“建莲”莲子心中生物碱的含量测定及HPLC指纹图谱的研究
莲子心中生物碱的提取工艺研究
提取 ， 并 重 复上述 步 骤 。
１ ． ３ 单 因素 实验 和正 交实验
选 取 乙 醇体 积 分 数 、 微 波功 率 、 微波时间、 料 液 比进行 单 因素 实验 ， 在 单 因素 实验 的基础 上 进 行 正 交 实验 设 计 ， 最 后根 据 正 交 实验 结 果 得 出莲 子 心 中 总 生物碱 的最佳提 取 工艺条 件 。
取 提供 理论 和参 考 。
１ 材 料与方法
１ ． １ 材料 、试 剂及 仪器 外购 莲 子心 ， 在５ ６ ． ７ ℃下 烘 干 ， 用 万 能粉碎 机粉
２ 结果 与分析
２ ． １ 乙醇体 积分 数对 提取 率 的影 响
准确 称 取 ２ ． ０ ｇ 莲 子 心粉 末 ， 在微 波 功率 ３ ０ ０ Ｗ、
ｐ Ｈ至 ８ ， 再次 在 ３ ０ ０ ０ ｒ・ ｍ ｉ ｎ 下离 心 １ ０ ｍｉ ｎ ， 得 到 下
胚芽 ， 具 有清 心安 神 ， 交通心肾， 涩精 止血 之功 效 ， 主
要 产于湖南 、 湖北 、 福建 、 江苏、 浙江等地 ， 其 内含有
黄酮 、 生物碱 、 叶绿素、 有 机 酸及 微 量 元 素等 多种 化 学成分， 同时含 有莲 心碱 、 异 莲心 碱 、 甲基莲 心碱 、 荷 叶碱及 莲 心季胺 碱 等多 种生 物碱 。研究 表 明莲 子心
Ｆ Ｗ１ １ ７中草药 粉碎机 ， 低 速离 心机 等 。
１ ． ２ 试 验 方法
由图 １ 可知 ， 随着 乙醇体积分 数的增加 ， 莲子
心生 物 碱 的提 取 率先 增 加 后 减少 ， 乙醇 体 积分 数 为 ６ ５ ％ 时提 取率 最 大 ， 可 能是 由于 莲子 心 中生 物 碱 的
莲的非可食用部分中生物碱分布
XIAO Juan，FU Xiao-yan，YANG Chao，LI Hai-long，CHEN Lin，WANG Zhi-hui，NAN Nan，SUN Zhi-da*
College of Food Science and Technology of Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China
1 材料与方法
1． 1 实验材料 干燥 荷 叶、莲 子 心、莲 房、藕 节、莲 子 壳、藕 皮。
1134
天然产物研究与开发
Vol. 23
2009 年 8 月采摘荷叶，莲蓬，2009 年 11 月采摘莲藕 于湖北武汉，品种为武植二号。取上述各部分于 60 ℃ 烘箱中烘 4 h，粉碎过 60 目筛，用聚氯乙烯和聚乙 烯的复合膜袋包装，室温贮藏于干燥器中备用。
分析天平（ AC210S，Sartorius Corporation） ； 旋转 蒸发仪（ RE111，瑞士 Buchi 公司） ； 数显恒温水浴锅 （ DK-98-IIA，天津市泰斯特仪器有限公司） ； pH 计 （ pHS-3C，上 海 雷 磁 仪 器 厂） ； 多 功 能 食 品 粉 碎 机 （ HR1707，飞利浦家庭电器有限公司） ； 超声波清洗 器（ KQ-50B，昆山超声仪器有限公司） ； 瓦里安高效 液相色谱仪（ Varian ProStar 230 型泵，Varian ProStar 330 PDA 检测器，瓦里安公司） 。 1． 3 实验方法 1． 3． 1 样品溶液的配制
在莲子心中的含量最高，分别为 457． 76、6155． 85、1420． 90 μg / g。莲的六个非可食用部分中都含有 5 ～ 8 种主要
的生； 非可食用部分； 生物碱； 高效液相色谱； 含量
莲心碱研究进展
莲心碱的研究进展一、莲子心介绍莲为睡莲科莲属多年生宿根水生草本植物，具有极高的药用价值。
其叶（荷叶）、叶柄或花柄（荷梗）、叶基部（荷叶蒂）、花蕾（莲花）、花托（莲房）、雄蕊（莲须）、肥大根茎（藕）、根茎节部（藕节）、老熟的果实（石莲子）和成熟种子中的幼叶及胚芽（莲子心）都供中医药用，为少见的一身皆供药用的植物。
其中，莲成熟种子的绿色胚芽为莲子心，干燥的莲心略成棒状，长1.2～1.6厘米。
顶端膏绿色，有2个分歧，一长一短，先端反折，紧密互贴，用水浸软后展开，可见2片盾状卷曲的幼叶。
中央的胚芽直立，长约2毫米。
基部胚根黄绿色，略呈圆柱形，长2～4毫米。
质脆，易折断，断面有多数小孔。
气无，味苦。
以个大、色青绿。
未经煮者为佳。
它是一味常用中药，功能包括清心、祛热、止血、涩精，用于治疗心烦、口渴、吐血、遗精、目赤肿痛等症，被2005年版中华人民共和国药典收载。
酚性生物碱如莲心碱( liensinine)、甲基莲心碱(neferine，Nef) 和异莲心碱(isoliensinine，Isolien) 等是莲子心的主要活性成分。
近年来对莲子心生物活性物质具有的药理作用研究较多。
二、莲心碱的结构与性质莲心碱(liensinine)为白色无定形粉末，化学式为C37H42N206，相对分子质量611.3121，熔点96～98 ℃，不溶于水，易溶于有机溶剂。
其分子是由单醚键将2个苄基异喹啉结构连接起来 ,化学结构如下图所示莲心碱是一种双苄基异喹啉类生物碱，它是一类在植物界分布局限、结构类型多样、生理活性广泛的天然二聚生物碱。
这类生物碱分子中的苄基碳处于氮原子的β位，易被氧化剂(如高锰酸钾)氧化或在O2存在、紫外灯照射下发生光氧化；在H2O2作氧化剂时，氮原子会质子化，产物一般是N2氧化物的混合物；此产物又可以在6%的H2SO3或锌粉作用下，还原为原生物碱；当金属钠/液氨作为还原剂时可使醚键断裂发生还原裂解反应；在非质子溶剂条件下，苯硫酚钠可使生物碱的氢卤酸盐转化为原生物碱。
黄连HPLC数字化指纹图谱研究及7种生物碱含量测定
黄连HPLC数字化指纹图谱研究及7种生物碱含量测定一、本文概述本文旨在通过高效液相色谱（HPLC）技术对黄连的数字化指纹图谱进行深入研究，并精确测定其中7种主要生物碱的含量。
黄连作为一种重要的中药材，具有清热解毒、燥湿止痢等功效，被广泛应用于中医临床。
其药效与其中的生物碱类成分密切相关，因此对黄连中生物碱的深入研究对于评价黄连质量、指导药材合理使用及优化生产工艺具有重要意义。
本研究将通过HPLC技术的精确分析，构建黄连的数字化指纹图谱，明确各生物碱在黄连中的含量，为黄连的质量控制提供科学依据。
本文还将探讨黄连中生物碱含量与其药效之间的关系，为黄连的药效评价和药物研发提供新的思路和方法。
二、材料与方法黄连药材购自全国各地具有代表性的药材市场，并经专家鉴定确保其质量。
甲醇、乙腈等色谱纯试剂购自公司，磷酸等分析纯试剂购自公司。
7种生物碱标准品（小檗碱、黄连碱、巴马汀、药根碱、表小檗碱、非洲防己碱、木兰花碱）购自公司，纯度均大于98%。
高效液相色谱仪（HPLC，型号：）配备二极管阵列检测器（DAD）及化学工作站；电子分析天平（精度：01mg）；超声波清洗器；旋转蒸发仪；离心机等。
将黄连药材粉碎成细粉，过目筛。
精密称取粉末适量，加入甲醇，于室温下超声提取分钟，离心后取上清液，用甲醇定容至一定体积，得黄连提取液。
色谱柱为C18柱（mm×mm，μm）；流动相为乙腈-磷酸水溶液（梯度洗脱）；检测波长设定为nm；柱温为℃；进样量为μL；流速为mL/min。
将黄连提取液按设定的色谱条件进行HPLC分析，记录色谱图。
采用相似度评价软件对所得色谱图进行预处理和相似度计算，构建黄连的HPLC数字化指纹图谱。
精密称取7种生物碱标准品适量，分别用甲醇溶解并定容至不同浓度，按设定的色谱条件进行HPLC分析，记录峰面积。
以峰面积为纵坐标，生物碱浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。
将黄连提取液按设定的色谱条件进行HPLC分析，根据标准曲线计算各生物碱的含量。
2种HPLC检测器测定莲子心中3种酚性生物碱含量的比较
（ ． 京 巾 医药 大 学 药 用 菌 与 中药 生 物 技术 研 究 所 ， 苏 南 京 ２ ０ ２ ； ． 京 中 医药 大 学 药 学 院 ， 苏 南 京 ２ ０ ２ １南 江 １０ ９２ 南 江 １０ ９ ３ 南 京 中医 药 大 学 江 苏省 中药 炮 制 重 点 实 验 室 ， 苏 南 京 ２ ０ ２ ） ． 江 １ ０ ９
摘要 ： 目的 建 立反 相 ＨＰ Ｃ一 Ｌ 荧光 检 测 （ｌｏ ｅｃ ｎ ｅｄ ｔ ｔ ｒＦ ） ， 定 中药 莲 子 心 中莲 心碱 （ｉ ｓｎ ｅ Ｌ ｅ ） 异 莲 ｆ ｒ ｓｅ ｃ ｅｅ ｏ ， Ｄ 法 测 ｕ ｃ １ ｎ ｉｉ ， ｉ 、 ｅ ｎ ｎ 心碱 （ｓ ｌ ｎ ｉｉｅ Ｉ ） 甲基 莲 心碱 （ ｅｅｉｅ Ｎｅ） ３ 酚 性 生 物 碱 的 含 量 ， 与 ＨＰ Ｃ一 ｉ ｉ ｓ ｎ ，ｓ 和 ｏｅ ｎ ｏ ｎ ｆｒ ， ｆ等 种 ｎ 并 Ｌ 紫外 检 测 器 （ ｌ ａ ｉｌ ｉ ｕｔ ｖ ｅ ｖｓ ｒ ｏ ｔ ｉ
Ｃｏ ｐ ｒ ｓ ｎ ｏ ｒ ｅ Ｐｈｅ ｌｃ Ａｌ ｌ ｉ ｓ Ｃｏ ｅ ｎＰｌ ｍ ｕ ａ Ｎｅ ｕ ｂｉ ｙ Ｕｓ ｎｇ Ｔｗｏ Ｈ ＰＬＣ ｔ ｃ ｏ ｓ ｍ ａ ｉ ｏ ｆ Ｔｈ ｅ ｎｏ ｉ ｋａ ｏ ｄ ’ ｎｔ ｎｔ ｉ ｕ ｌ ｌ ｍ ｎｉｂ ｉ Ｄｅ ｅ ｔ ｒ
ＯＢＪ ＥＣＴＩ ＶＥ Ｔ ｏ ｅ ｔ ｂ ｉｈ ａ Ｒ Ｐ— ＰＬＣ ｅ ｈ ｄ ｔ ｔ ｒ ｉ ｈｅ ｃ ｎｔ ｎ ｓ ｏｆｔ ｅ ｓ ａ ｌｓ Ｈ ｍ ｔ ｏ ｏ ｄｅ ｅ ｍ ｎｅｔ ｏ ｅ ｔ ｈｒ ｅｐｈｅ ｏｌ ｌ ａ ｏｄｓ．ｉｎｓ ｎ ｉ ａ ｋ ｌ ｉ １ｅ ｉ ｃ
南 京 中 医药 大 学 学 报 ２ １ 年 １ 第 ２ 卷 第 １期 ０１ 月 ７
电喷雾萃取电离质谱法分析莲子中的生物碱
Vol.35高等学校化学学报No.42014年4月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 730~735 doi:10.7503/cjcu20131121电喷雾萃取电离质谱法分析莲子中的生物碱方菲菲1,杜尚广1,戴喜末1,郭夏丽1,陈焕文2,罗丽萍1(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,生命科学与食品工程学院,南昌330047;2.东华理工大学江西省质谱科学与仪器重点实验室,南昌330013)摘要 在无需样品预处理的前提下,直接对莲子醇提液进行电喷雾萃取电离质谱(EESI⁃MS)检测,并对其中可能存在的生物碱母离子进行串联质谱分析确认,通过主成分分析(PCA)对不同贮藏时间莲子的醇提液进行区分.研究结果表明,电离电压㊁离子传输管温度和样品进样流速的最佳条件分别为3.5kV,250℃和5μL /min;串联质谱结果表明莲子醇提液中存在莲心碱㊁甲基莲心碱㊁莲心季铵碱㊁荷叶碱及O ⁃去甲基荷叶碱等生物碱.PCA 可将不同贮藏时间的莲子明显区分在二维平面的不同区域.本方法无需样品预处理,可用于复杂基体样品中生物碱的快速鉴定,与化学计量学结合可对不同新陈度的莲子样品进行有效区分.关键词 电喷雾萃取电离质谱;莲子;主成分分析;生物碱中图分类号 O657 文献标志码 A 收稿日期:2013⁃11⁃20.基金项目: 十二五”农村领域国家科技计划课题项目(批准号:2012BDA29B01)㊁江西省主要学科学术和技术带头人培养对象项目(批准号:20123BCB22004)和江西省高等学校科技落地计划项目(批准号:KJLD12051)资助.联系人简介:罗丽萍,女,博士,教授,博士生导师,主要从事植物代谢产物的研究.E⁃mail:lluo2@陈焕文,男,博士,教授,博士生导师,主要从事有机质谱分析和仪器的研究.E⁃mail:chw8868@莲子是莲的种子,含有丰富的多糖㊁磷脂㊁生物碱和类黄酮等营养保健成分,是一种食疗佳品及著名的药食同源食物.生物碱为莲的主要生物活性成分,在莲的各部位均可检测到.传统的生物碱鉴定方法是化学降解法,近年来已应用光谱㊁色谱㊁质谱和核磁分析等现代分析手段来鉴定生物碱的结构.王嘉陵等[1]从莲心中分离出莲心碱㊁异莲心碱㊁甲基莲心碱㊁前荷叶碱㊁荷叶碱和莲心季铵碱等;Luo 等[2]采用高效液相色谱⁃二极管阵列检测法(HPLC⁃DAD)从莲叶中鉴定出多种生物碱.目前,莲心生物碱已被用于临床制剂[3~5].然而,基于直接质谱分析对莲生物碱进行快速分析及鉴定目前鲜见报道[6].电喷雾萃取电离(EESI)技术是一种新兴的离子化技术,可在无需样品预处理的条件下对复杂基体样品进行直接质谱分析,可用于分析液体㊁气溶胶㊁固体表面和黏性样品等不同形态的样品[7].潘素素等[8]分析了马尾松根际土壤溶液中的尿素衍生物;Zhou 等[9]采用EESI 技术建立了尿液中阿特拉津及其代谢产物的快速分析方法;许柠等[10]采用EESI⁃MS 快速标靶分析氨基酸,将EESI 和LTQ⁃XL 质谱仪耦合,在无需样品预处理情况下,建立了多种不同极性氨基酸的快速检测方法.本文利用EESI⁃MS 技术,对不同贮藏时间莲子中的生物碱进行了直接质谱分析,对其中的5种生物碱进行确认;基于正离子模式下获得的EESI⁃MS 指纹谱图的差异,采用主成分分析法(PCA)实现了对不同贮藏时间莲子的快速甄别.本方法分析速度快㊁信息提取准确且识别精度高,对不同贮藏时间的莲子样品质谱数据具有较好的识别效果,为生物碱的直接快速分析提供了参考.1 实验部分1.1 仪器与试剂EESI 电离源(东华理工大学研制)[11,12];LTQ⁃XL 为线性离子阱质谱仪和Xcalibur 型数据处理系统(美国Finnigan 公司);乙醇(分析纯,上海化工试剂有限公司).莲子品种为太空莲3号,均为去除胚芽(莲心)的通心莲子,由江西省广昌县白莲科学研究科所提供.当年新鲜莲子为2012年8月收获,贮藏的陈年莲子分别于2011,2010和2009年8月收获,均产于广昌县同一种植基地,去种皮㊁胚芽,烘干后真空包装,避光室温[(23±2)℃]下保存.1.2 莲子醇溶液的制备分别将4年收获的莲子粉碎,过80目筛,称取莲子粉末0.01g 于1.5mL 离心管中,加入1mL 80%(体积分数)的乙醇溶液,超声提取10min,以4000r /min 转速离心5min,取上清液直接进行质谱检测,每种样品平行测试6次.1.3 EESI⁃MS 实验参数线性离子阱质谱(LTQ⁃MS)在正离子检测模式下工作,质谱扫描范围m /z 50~1000;电离电压3.0kV;离子传输管温度250℃;ESI 溶剂为甲醇;雾化气为氮气(纯度99.999%),压力为1.2MPa;EESI 溶剂和样品溶液流速分别为3和5μL /min;2个毛细管喷雾口之间的距离a =1mm,夹角为60°,到质谱进样口的距离为5mm,角度为150°;在进行串联质谱分析时,母离子的隔离窗口宽度设定为1.5Da,碰撞时间为30ms,碰撞能量为17%~25%,其它参数由LTQ⁃MS 软件系统自动优化.1.4 主成分分析利用7.0版Matlab 软件(美国Mathworks 公司)对4个年份的莲子(每年各取60个样本,共240个)进行PCA 分析,通过计算特征值㊁特征向量及累计贡献率,获得少数几个主成分,尽可能完整地保留原始变量的信息,且彼此间不相关,达到简化数据的目的.2 结果与讨论2.1 EESI⁃MS 质谱条件的优化莲子生物碱具有比较相似的性质,实验选择甲基莲心碱m /z 625作为目标信号物质,对电离电压㊁离子传输管和样品进样速率等EESI⁃MS 质谱条件进行优化.2.1.1 离子源电压的优化 在实验所用离子源中,带电的喷雾溶剂与样品喷雾在离子传输管空间内碰撞,样品中的目标分子被带电喷雾溶剂萃取,进行电荷传递,样品目标分子形成带电离子在检测器中被检测,因此离子源电压对样品目标分子的电离效率有直接影响,对质谱信号的强弱起关键作用.实验考察了离子管温度为250℃,样品流速为0.5μL /min 时,不同离子源电压对m /z 625信号强度的影响(如图1所示),可见,电压为3.5kV 时,m /z 625信号强度较大;电压低于3.5kV 时,因为带电初级离子数目较少,难以使生物碱电离;而电压大于3.5kV 时,m /z 625信号有所下降,其原因可能是高喷雾电压加大了对其它杂质的电离,使目标分析物m /z 625的信号受到干扰,因此选择3.5kV 作为离子源电压.Fig.1 Effect of ionization voltage on the signalintensity of m /z 625Fig.2 Effect of ion tube temperature on the signal intensity of m /z 6252.1.2 离子传输管温度的优化 在电离电压为3.5kV,样品流速为0.5μL /min 条件下,离子传输管温度优化结果(图2)表明,当离子传输管温度低于250℃时,m /z 625的信号强度随着温度的上升而增大,说明在250℃以下,升高温度不仅可去除小液滴中的溶剂,还可加快样品中目标分子的运动,获得更多的电离电荷,导致信号强度增大;在250℃以上时,m /z 625的信号强度下降,这可能是由于温度升高导致生物碱分解,或是反应环境的温度较高,生物碱在溶剂喷雾碰撞过程中挥发并扩散到外界环境中,造成目标信号的下降.故选择离子传输管温度为250℃.137 No.4 方菲菲等:电喷雾萃取电离质谱法分析莲子中的生物碱Fig.3 Effect of sample injected speed on the signal intensity of m /z 6252.1.3 样品进样速率的优化 实验中样品在高压气流(N 2)作用下形成喷雾,在电离电压为3.5kV,离子管温度为250℃的条件下,考察了电喷雾溶剂流速为5μL /min 时,样品进样速率对质谱信号的影响(见图3).结果表明,样品的最佳速率为5μL /min;速率较低时,目标物质进入质谱的量相应减少,使信号强度降低;而进样速率大于5μL /min时,可能是因为氮气压力一定的情况下,样品溶液不易雾化而影响电离效果,m /z 625的信号强度下降.因此选择样品进样速率为5μL /min.经过优化,确定了质谱和离子源的条件为:离子源电压为3.5kV,离子传输管温度为250℃,样品进样速率为5μL /min.其它参数设置为默认值.2.2 莲子醇提物的EESI⁃MS 离子流图在优化的实验条件下获得了莲子醇提物的EESI⁃MS 谱图(图4),m /z 611,625,314,282和296为总离子流(TIC)中的选择离子.由图4可见,选择的离子流与总离子流图的走势一致,离子的丰度随着进样而明显增强,说明样品中存在该质量分数的物质.与文献[13~15]对比发现,选择的5种离子流的质荷比分别与质子化的莲心碱(异莲心碱)㊁甲基莲心碱㊁O ⁃去甲基荷叶碱㊁莲心季铵碱和荷叶碱的质荷比相同,为了确认该系列离子是否为莲子的生物碱,进一步通过串联质谱分析进行验证.Fig.4 Total ion chromatogram (TIC )(A )and selected ion diagrams of m /z 611(B ),m /z 625(C ),m /z 314(D ),m /z 282(E )and m /z 296(F )2.3 莲子醇提液的EESI⁃MS 串联质谱分析选择m /z 611进行碰撞诱导解离(CID)实验,获得二级质谱图[图5(A)],其中m /z 593,579,503和489等离子峰是母体离子分别丢失H 2O,CH 3OH,CH 3 C 6H 5O 和CH 3 CH 2 C 6H 5O 基团所致,这与文献[5]报道的莲心碱二级质谱碎片一致,故可确认m /z 611是质子化莲心碱分子的信号.另外,在二级质谱上还有一定丰度的m /z 192的碎片离子峰,而m /z 192是莲心碱的同分异构体异莲心碱二级质谱的特征碎片[5],因此莲子醇提取液中可能含有一定量的异莲心碱,但其信号强度要小于莲心碱的特征碎片强度.因而,在莲子醇提取液m /z 611的物质中,莲心碱占有较大比例.不同贮藏时间莲子样品的m /z 611二级质谱图中都含有图5(A)中所示的各种特征离子峰.m /z 625离子的二级质谱[图5(B)]中出现了m /z 607,593,580,489,297和206等离子碎片,其中m /z 607,593,580和489主要由m /z 625分别丢失1个H 2O,CH 3OH,C 2H 5O 和CH 3 CH 2 CH 2 C 6H 5O 形成,对比文献[5]可以确认m /z 625为甲基莲心碱.甲基莲心碱m /z 625的碎片特征与莲心碱m /z 611较相似,其原因是甲基莲心碱仅在莲心碱羟基位点( OH)替换成了甲基( CH 3),相似的结构决定了两者相似的离子断237高等学校化学学报 Vol.35 Fig.5 MS /MS spectra (A E )of five alkaloids in ethanol extract of lotus seeds(A)Liensinine m /z 611;(B)neferine m /z 625;(C)lotusine m /z 314;(D)O ⁃demethylation m /z 282;(E)nuciferine m /z 296.裂方式.母体离子m /z 314的二级质谱图[图5(C)]中最主要的碎片离子峰为m /z 269(M-45)+,由母离子丢失1个H 2O 形成的m /z 298含量也较高;此外,m /z 107和251与电子轰击质谱(EI⁃MS)碎片离子及NMR 结果一致[15],因此,推断m /z 314为莲心季铵碱.母体离子m /z 282的二级质谱图[图5(D)]表明,特征碎片离子m /z 264和250分别是母体离子丢失H 2O 和CH 3OH 基团所形成的,根据文献[11]由HPLC⁃MS 对荷叶中生物碱的鉴定,可以推断母体离子主要为O ⁃去甲基荷叶碱.母体离子m /z 296的二级质谱图[图5(E)]中有较强的离子特征碎片为m /z 265和104,相似的离子断裂方式已经在荷叶中荷叶碱的检测中得到验证[13],因此推断m /z 296为荷叶碱.5种生物碱的结构如图6所示.以上结果表明,通心莲子中生物碱种类丰富,不仅含有莲心中的莲心碱㊁甲基莲心碱及莲心季铵碱,还含有在荷叶中较常见的荷叶碱及O ⁃去甲基荷叶碱等.丰富的生物碱组成是莲子作为药用食物的重要因素.Fig.6 Structures of five alkaloids in ethanol extract of lotus seeds(A)Liensinine m /z 611;(B)neferine m /z 625;(C)lotusine m /z 314;(D)O ⁃demethylation m /z 282;(E)nuciferine m /z 296.Fig.7 Signal intensity changes of five alkaloids in the ethanol extracts from lotus seeds with different storage time 2.4 不同贮藏时间的莲子生物碱组成的差异对不同贮藏时间莲子的醇提取液进行EESI⁃MS分析发现,莲子醇提液中5种生物碱含量依次为:O ⁃去甲基荷叶碱<莲心碱<甲基莲心碱<莲心季铵碱<荷叶碱.各种生物碱的质谱信号在不同年份的样品中存在差异,表明不同陈化度莲子的生物碱含量不同.图7分别为2009~2012年莲子中m /z 611,625,282,314和296等5种离子峰的强度变化趋势图,在一定程度上表示了莲心碱㊁甲基莲心碱㊁莲心季铵碱㊁O ⁃去甲基荷叶碱和荷叶碱的含量变化.由图7可见,莲心碱㊁甲基莲心碱和O ⁃去甲基荷叶碱在储藏过程中信号强度变化较小;莲心季铵337 No.4 方菲菲等:电喷雾萃取电离质谱法分析莲子中的生物碱碱的信号强度随储藏时间延长先下降后上升;荷叶碱信号强度差异较大,先上升后下降.2.5 不同贮藏时间的莲子醇提物EESI⁃MS 谱图的PCA 分析将4个年份的莲子共32个样本(每个年份8个样品)在正离子模式下所获得的EESI⁃MS 指纹谱图信息导入Matlab 中进行PCA 数据处理与分析,分别得到二维的PCA 得分结果.由PCA 的二维平面图[图8(A)]可见,4种莲子被明显区分;由图8(B)可见,能用于区分不同年份莲子的物质较多,主要为m /z 705和176等在莲子中含量较多的物质.为了验证生物碱的质谱特征信息对不同年份莲子的区分有无贡献,对m /z 611,625,282,314和296等生物碱质谱特征信息再次进行PCA 分析,结果如图8(C,D)所示.由图8(C)可见,通过对生物碱信息进行PCA 分析,不同年份的莲子被明显区分,区分效果贡献率最大的为m /z 314.Fig.8 2D plot of PCA score results for the ethanol extract from lotus seeds with different storage time byEESI⁃MS (A ),loading 1vs .loading 2plot (B ),2D plot of PCA score results for m /z 611,625,314,282and 296(C )and loading 1vs .loading 2plot (D)2009;2010;2011;2012.综上所述,在优化条件下对未经样品预处理的莲子醇提液进行了EESI⁃MS 分析.结果表明,通心莲子中含有莲心碱㊁甲基莲心碱㊁O ⁃去甲基荷叶碱㊁莲心季铵碱和荷叶碱等生物碱.不同贮藏时间的莲子生物碱的信号强度变化趋势表明,莲心碱和甲基莲心碱含量较稳定,而荷叶碱的含量变化较大,且先上升后下降,可能在储存初期逐步积累,然后随着莲子的陈化逐步降解.采用PCA 分析不同贮藏时间莲子醇提液的EESI⁃MS 谱图发现,莲子在贮藏过程中醇提液部分物质发生显著变化,不同年份的莲子可被明显区分在PCA 二维平面图的不同区域.本文首次采用EESI⁃MS 对通心莲子样品中的生物碱进行多级串联质谱鉴定,该方法快速㊁准确且无需复杂的样品预处理,不仅可用于复杂基体样品中生物碱的快速鉴定,结合化学计量学还可对不同陈化度的莲子样品进行有效区分.参 考 文 献[1] Wang J.L.,Hu X.M.,Yin W.H.,Cai H.S.,Journal of Chinese Medicinal Materials ,1991,14(6),36 38(王嘉陵,胡学民,尹武华,蔡鸿生.中药材,1991,14(6),36 38)[2] Luo X.B.,Chen B.,Liu J.J.,Yao S.Z.,Anal.Chim.Acta ,2005,538(1),129 133[3] Chen W.Z.,Ling X.Z.,Ding G.S.,Acta Pharmaceutica Sinica ,1962,9,277 279(陈维洲,凌秀珍,丁光生.药学学报,1962,9,277 279)[4] Pan Y.,Cai B.C.,Yang G.M.,Cao L.,Shen A.Q.,Journal of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine ,2005,21(4),437高等学校化学学报 Vol.35 243 244(潘扬,蔡宝昌,杨光明,曹亮,沈爱琴.南京中医药大学学报,2005,21(4),243 244)[5] Wu S.H.,Sun C.R.,Cao X.J.,Zhou H.,Hong Z.,Pan Y.J.,J.Chromatogr.A ,2004,1041(1),153 162[6] Luo L.P.,Zhao Z.F.,Dai X.M.,Zhang X.,Liu Y.L.,Zhang X.L.,Zhang W.J.,Ouyang Y.Z.,Trans.Chin.Soc.Agri.Engi.,2013,29(7),261 266(罗丽萍,赵占锋,戴喜末,张茜,刘亚丽,张兴磊,章文军,欧阳永中.农业工程学报,2013,29(7),261 266)[7] Jia B.,Zhang X.L.,Ding J.H.,Yang S.P.,Chen H.W.,Chin.Sci.Bull.,2012,57,1918 1927(贾滨,张兴磊,丁健桦,杨水平,陈焕文.科学通报,2012,57,1918 1927)[8] Pang S.S.,Zhao N.,Ouyang Y.Z.,Huang K.K.,Ding J.H.,Chen H.W.,Yuan L.,Wang X.X.,Chem.J.Chinese Universi⁃ties ,2013,34(6),1379 1384(潘素素,赵娜,欧阳永中,黄科科,丁健桦,陈焕文,袁龙,王兴祥.高等学校化学学报,2013,34(6),1379 1384)[9] Zhou Z.Q.,Jin M.,Ding J.H.,Zhou Y.M.,Zheng J.,Chen H.W.,Metabolomics ,2007,3(2),101 104[10] Xu N.,Zhu Z.Q.,Yang S.P.,Wang J.,Gu H.W.,Zhou Z.,Chen H.W.,Chin.J.Anal.Chem.,2013,4,523 528(许柠,朱志强,杨水平,王姜,顾海巍,周振,陈焕文.分析化学,2013,4,523 528)[11] Chen H.,Zenobi R.,Nature Protocols ,2008,3(9),1467 1475[12] Zhu L.,Hu Z.,Gamez G.,Law W.S.,Chen H.W.,Yang S.P.,Chingin K.,Balabin R.,Wang R.,Zhang T.T.,Zenobi R.,Anal.Bioanal.Chem.,2010,398(1),405 413[13] Kunitomo J.,Journal of Pharmacy (Japanese ),1964,84(11),1141 1142(国友顺一.药学杂志(日),1964,84(11),11411142)[14] Kunitomo J.,Yoshikawa Y.,Tanaka S.,Imori Y.,Isoi K.,Phytochem .,1973,12(3),699 701[15] Pan Y.,Yang G.M.,Cai B.C.,Ding G.,Chinese Traditional and Herbal Drugs ,2004,35(5),501 503(潘扬,杨光明,蔡宝昌,丁岗.中草药,2004,35(5),501 503Rapid Analysis Alkaloids in Lotus Seeds by Extractive Electrospray Ionization Mass Spectrometry †FANG Feifei 1,DU Shangguang 1,DAI Ximo 1,GUO Xiali 1,CHEN Huanwen 2*,LUO Liping 1*(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology ,School of Life Sciences and Food Engineering ,Nanchang University ,Nanchang 330047,China ;2.Jiangxi Key Laboratory for Mass Spectrometry and Instrumentation ,East China Institute of Technology ,Nanchang 330013,China )Abstract To identify alkaloids in lotus seeds rapidly and to distinguish fresh and aged lotus seeds,using self⁃developed extractive electrospray ionization source,ethanol extracts of lotus seeds were directly analyzed by mass spectrometry without any sample pretreatment.The MS were further analyzed using principal component analysis(PCA).The results showed that optimum conditions of ionization voltage,capillary temperature and sample flow rate were 3.5kV,250℃,and 5μL /min,respectively.Liensinine,neferine,lotusine,nucife⁃rine and O ⁃demethylation nuciferine were found in the ethanol extracts by tandem mass spectrometry,of which signal intensities showed special change trends.Lotus seeds of different storage time and aging degree were clearly distinguishable from each other by PCA.This method is of high sensitivity and high analytical speed,without complex sample pretreatment.The method in this paper is fast and effective to identify alkaloids in real samples with complicated matrix,and combined with chemometrics,it is also used to distinguish fresh and aged lotus seeds.†Supported by the Twelve Five”Issues in Rural Areas of National Science and Technology Plan Project,China(No.2012BDA29B01),the Jiangxi Major Disciplines of Academic and Technical Leader of Cultivation Project,China(No.20123BCB22004)and the Floor Plan of Scientific and Technological Projects in Jiangxi Province,China(No.KJLD12051).Keywords Extractive electrospray ionization mass spectrometry;Lotus seed;Principal component analysis;Alkaloid (Ed.:I ,K )537 No.4 方菲菲等:电喷雾萃取电离质谱法分析莲子中的生物碱。
黄连HPLC数字化指纹图谱研究及7种生物碱含量测定_刘芳
［摘要］ 该文建立了峨眉地区道地药材黄连的 HPLC 数字化指纹图谱，并将其在全国不同主产区的黄连测定中进行了 应用，同时测定黄连中 7 种季胺型生物碱的含量，为科学评价与有效控制黄连质量提供依据。采用 Diamonsil C18 色谱柱（4. 6 mm × 250 mm，5 μm） ，流动相乙腈-0. 025mol·L － 1 KH2 PO4 溶液（ 磷酸调 pH 3. 0） （40∶ 60） ，内含 SDS 1. 7 g·L － 1 ，流速 1. 2 mL· min －1 ，检测波长 345 nm，柱温 40 ℃ 。运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（ 国家药典委员会） 进行分析，10 批次峨眉产黄 连样品得到的指纹图谱相似度均大于 0. 99，标定共有峰 10 个，并对其中 8 个色谱峰进行了归属。全国 5 个黄连主产区样品与 峨眉产黄连进行相似度分析比较，整体相似度高。同时对黄连药材中 groenlandicine，非洲防己碱，药根碱，表小檗碱，黄连碱， 巴马汀，小檗碱 7 种主要生物碱进行了含量测定。该方法灵敏度高、专属性强，HPLC 指纹图谱结合生物碱含量测定能全面反 应其内在质量，为黄连的质量控制提供科学依据。
［收稿日期］ 2013-05-03 ［基 金 项 目］ 科 技 部 国 家 科 技 支 撑 计 划 重 点 项 目 （2007BA140B05） ； 中 国 博 士 后 科 学 基 金 第 6 批 特 别 资 助 项 目 （2013T60863） ［通信 作 者］ * 张 浩，教 授，博 士 生 导 师，Tel： （ 028 ） 85503037， E-mail：zhanghhx@ vip. sina. com
高效液相色谱法同时测定莲子心中四种异喹啉生物碱的含量_28248
高效液相色谱法同时测定莲子心中四种异喹啉生物碱的含量_28248高效液相色谱法同时测定莲子心中四种异喹啉生物碱的含量==================================================================== ==【关键词】离子对反相高效液相色谱;,,莲心碱;,,异莲心碱;,,甲基莲心碱;,,莲心季铵碱;,,莲子心摘要:目的:建立同时测定莲子心中四种异喹啉生物碱莲心季铵碱、莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱含量的离子对反相高效液相色谱(RPHPLC)法。
方法:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱:HibarTR，5 μm，250mm×4.6 mm;流动相:乙腈水冰醋酸(55?45?1，每1 000 ml中加入4 g十二烷基磺酸钠);流速:1.2 ml/min;检测波长:282 nm;柱温:30?。
结果:莲心季铵碱在0.94,2.82 μg，莲心碱在1.14,3.42 μg，异莲心碱在0.7,2.1 μg，甲基莲心碱在0.96,2.88 μg范围内均呈良好线性关系;并均具有较好的加样回收率(,95%)。
结论:该分析方法快速、准确、灵敏度高，重复性好，可用于同时对药材莲子心中四种异喹啉生物碱的含量测定。
关键词:离子对反相高效液相色谱; 莲心碱; 异莲心碱; 甲基莲心碱; 莲心季铵碱; 莲子心Determination of Four Isoquinoline Alkaloids in Plumula Nelumbini by HPLC SimultaneouslyAbstract:Objective:An ionpair RPHPLC method was established to determine the amounts of lotusine, liensinine, isoliensinine andneferine in Plumula Nelumbini(PNN)simultaneously.Methods:The column is packed with Hibar RT C18(5 μm, 250 mm×4.60 mm);The mobile phase consists of acetonitrile/H2O/glacial acetic acid(55?45?1)，with 4 g sodium lauryl sulfonate in 1 liter, at the flow rate of 1.2 ml/min and the detection wavelength is 282 nm while the column temperature is 30?.Results:Lotusine, liensinine, isoliensinine and neferine were proved to be linear within the range of 0.94,2.82 μg, 1.14,3.42 μg,0.7,2.1 μg and 0.96,2.88 μg respectively,with the recovery of the four alkaloids all being above 95%.Conclusion:This method isfeasible to determine these four isoquinoline alkaloids simultaneously in PNN with the advantages of quickness, accuracy, high sensitivity and good repeatability.Keywords:HPLC; Lotusine; Liensinine; Isoliensinine; Neferine;Plumula Neumbini(PNN)莲子心为中医临床习用药材，主产于湖南、湖北、福建、江苏、浙江等省，秋季采收莲子时，从莲子中剥取，晒干，一般以个大、色青绿、未经煮者为佳,1,。