高效液相色谱指纹图谱的梯度条件优化
中药材高效液相色谱指纹图谱研究概述
指 纹图谱 ： 色谱条件 ， 依利 特 Ｋ ｒ ｏ ｍ ａ ｓ ｉ ｌ Ｃ １ ８ 色谱 柱 （ ２ ０ ０ ｍ ｍ Ｘ ４ ． ６ ｍｍ， ５ ｍ） ； 柱 温 ４ ０ ℃； 流 动相 为 甲醇 （ Ａ相 ） 、 ６ ｍ ｍ ｏ ／ Ｌ— Ｎ ａ Ｈ Ｐ Ｏ （ Ｂ相 ， Ｈ Ｐ Ｏ 调 ｐ Ｈ ６ ． ５ ） ， 梯 度 洗脱 。流速 ０ ． ６ ｍ ｌ ／ 分； 检测 波 长 分段 用
科研人员对 指纹 图谱分 析技术 进行 了大
量研究 ， 取得 了可喜 的成绩 。中药指纹 图
谱 的研究 已经从早 期 只对单一 谱 图进行
简单评述 的阶段 ， 发展到利用计算机技术
雷海 民等 ｊ 报道， 不 同产地 牛 蒡 子
药材 Ｒ Ｐ—ＨＰ Ｌ Ｃ指 纹 图谱 研 究 ， 由于采 用梯度洗脱 的方式 ， 各批次供试 品指 纹图 谱 中色谱峰保 留时间可能不一致 ， 故 相似 度计算时未采用 自动校正方式 ， 而是使 用
获 取 的 色谱 条 件 ， 供 试 品 制备 方 法及 评 价
研 究等 ３个 方 面进 行 阐述 。结 果 ： 中药 指
数的一致性 ） ， 且稳定， 制 定 的指 纹 图谱
可对 白术药材组 分群体 特征 的一 致性作 出判断 。白术指 纹 图谱 有 自身化 学条码 的特征 ， 是其 内在化学成分种类与数量 的
色谱指纹图谱 ， 流速 ０ ． ５ ｍ ｌ ／ 分， 检 测波长 ２ ５ ０ ｎ ｍ， 其他色谱条件与 白术基本相 同。
李小 燕 等 报 道 ， 广 西 粉葛 药 材 高 效液相色谱指纹 图谱 的研究 ， 用 乙腈 一 ０ ．
驱虫斑鸠菊高效液相色谱指纹图谱分离条件的优化
ｌ ｕ ｄ ｃ ｒ ｍａ ｏ ｒ ｐ ｙ ａ ｄ ｌｙ ａ ｆ ｕ ｄ ｔ ｎ ｏ ｔ ｄ ｅ ｎ ｉｓ ｆ ｇ ｒ ｒｎ ｙ ｈ ｇ ｅ ｆ ｒ ｎ ｅ ｌ ｕ ｄ ｃ ｒ ｍａ ｏ ｒ ｐ ｙ Ｍ ｅ ｈ ｄ ｉ ｉ ｈ ｏ ｔ ｇ ａ ｈ ｎ ａ ｏ ｎ ａ ｉ ｆｓ ｕ ｉｓ ｏ ｔ ｉ ｅ ｐ ｉ ｔｂ ｉ ｈ ｐ ｒ ｏ ｍａ ｃ ｉ ｉ ｈ ｏ ｔ ｇ ａ ｈ ． ｑ ｏ ｎ ｑ ｔ ｏ ｓ Ａ
ｒ ｖ ｒ ｅ — ｈ ｓ ｉ ｈ ｐ ｒ ｏ ｍａ ｃ ｉ ｕ ｄ ｃ ｒ ｍａ － ｇ ａ ｈ ｃ ｍｅ ｈ ｄ ｗａ ｄ ｐ ｅ ． ｅ ｓ ｍｐ ｅ ｒ ｘ ｒ ｃ ｅ ｙ ａ ｕ ｏ ｓ ｓ ｌ ｔ ｎ ｅ ｅ ｓ ｄ ｐ ａ ｅ ｈ ｇ ｅ ｆ ｒ ｎ ｅ ｌ ｉ ｈ ｏ ｔｏ ｒ ｐ ｉ ｔ ｏ ｓ ａ ｏ ｔ ｄ Ｔｈ ａ ｌｓ ｗｅ ｅ ｅ ｔ ａ ｔ ｄ ｂ ｑ ｅ ｕ ｏ ｕ ｉ ｑ ｏ
紫菀药材的高效液相色谱指纹图谱与定量分析讲解
生长在同一地段而致误采。
其二是三脉叶马兰生长范围较广而且量多，某些药农见利忘义有意伪充。
４．２药材切成饮片后，形状上较难分辩，但二者的头状花序较易区分，刘寄奴的呈椭圆形，白色似米粒，小花全为管状花，其叶脉羽状，无离基三出脉。
药材具芳香气，味淡。
而三脉叶马兰头状花序呈半球形，较大，小花有舌状花和管状花，其叶有离基三出脉和羽状脉。
气微，苦、辛。
４．３二者的显微特征差别较大，刘寄奴药材表面具“Ｔ”字形非腺毛，腺毛顶面观呈鞋底形；叶主脉底部钝圆略呈圆锥形，上表面稍突起，且中央微凹。
叶图６三脉叶马兰的粉末显微特征１．非腺毛２．草酸钙针晶３．方晶４．腺毛５．簇晶６．花粉粒７．叶下表皮及气孔肉组织与茎髓薄壁细胞中有草酸钙簇晶散在。
三脉叶马蓝无“Ｔ”字形非腺毛，叶主脉上下面突起明显，底部钝圆呈半圆形。
髓部薄壁细胞内含多数短小的草酸钙针晶。
二者花粉粒的形态和大小，表面特征差异也较明显。
参１处理２０ｍｉｎ，过滤，取滤液加９５％乙醇稀释至适量浓度。
于岛律ＵＶ２４５０型紫外分光度计上，在２００—４００ｎｍ波长范围内测定其紫外光谱。
结果：刘寄奴考文献在３３０ｎｍ波长处有一最大吸收峰，在３００ｎｍ波长处有肩峰；而三脉叶马兰仅在３２９ｎｍ波长处有一最大吸收峰。
４４．１中国医学科学院药用植物资源开发研究所，中国医学科学院药物研究所等．中药志．第四册．ｊＥ京：人民卫生出版，１９８８：４３讨论刘寄奴的混杂原因可能有二：其一是二者均２李时珍．本草纲目（校点本，上册）．北京人民出版社，１９９ｌ：９５９来源于菊科植物，在开花之前茎叶的形状和色泽均有相似之处，其生长环境与习性相似，且二者常混杂（２００３一１１—２６收稿）紫菀药材的高效液相色谱指纹图谱与定量分析周军辉１伍蔚萍１谢子民２孙文基ｈ（１．西北大学陕西省生物医药重点实验室，西安７１００６９；２．西安市药品检验所，西安７１００６８）摘要目的：建立紫菀药材的反相液相色谱定性和定量鉴别分析方法。
高效液相色谱法研究三七指纹图谱
． ＿＿
同 液 相 色 谱 法 研 究 三 七 指 纹 图 谱 效
谢 国祥 ， 明丰 ， 邱 贾 伟
（ 上海交 通大学 药学 院 ， 海 上 ２０４ ） ０２０
－． ＿ ＿ Ｃ
摘要 ： 目的 用高效液相 色谱法建立三七的指纹 图谱 。方法 采用反相 ｃ 乙腈一 。 柱， 水梯度 洗脱 ； 检测 波长 ２３Ｂ Ｉ流速 １０ ０ Ｉ； Ｔ ． ｍ／ ｉ进行试验。根据相对保 留值 Ｉ和相对面积 Ｓ 对色谱指纹 图谱进 行分析对比研 究， 立了一个快速、 ｌｍｎ Ｘ 建 简易鉴别三七 样品的色 谱指纹 图 谱分析方法。用指标成分三七皂苷 Ｒ ， 。 人参皂苷 Ｒ 人参皂苷 Ｒ 。人参皂苷 Ｒ 进行 了定位 ， ， ｂ， ｅ 并测定 了 它们的含量。结果 建立了 Ｈ Ｌ Ｐ Ｃ指纹 图谱共有模式， 并根据相 对保 留值 和相 对面积 Ｓ 进行 了比较。结论 该法 为中药 样品的鉴定提供 了较全 面的信 息， 三七样品指纹 图谱及指标成分含量测定可用于全 面控制三七 药材 的质量。
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ｗａｅ ａ ｉｎ ｌｔ ｎ，ａ Ｄ ｔｒｇ ｄ ｅ ｔｅｕ ｉ ｒ ｏ ＡＤ ｉｄ ｒａ ｅｅ ｔｒ ａ ２ ３ ｎ ａ ｄ ｔｅ ｆ ｗ ｒ ｔ ｆ１ Ｏ ｄ ｏ ｅ ａ ｒｙ ｄ ｔｃｏ ｔ ０ ｍ ｎ ｈ ｏ ａｅ ｏ ． ｍＶｍｉ ｌ ｎ．ｃ ｌ ｍｎ ｔ ｍｐ ｒ ｔｒ ｆ３ ℃ ｏ ｕ ｅ ｅ ａｕ ｅ ｏ ５ ａ ｄ ｔｅ ｒ ｌｔ ｅ ａ ｅ ｒ ｒｓ ｌ ｎｓ ｉ ｈ ｏ ｔｇ ａ ｈｃ ｆ ｇ ｒ ｒ ｔ ｈ ｉ ｃ ｍｐ ｒ ｔ ｅ ｎ ｈ ｅａｉ ｒ ａ Ｓ ｅ ｕ ｔ ｔ ｎ ｃ ｒｍａｏ ｐ ｉ ｉ ｅ ｉ ．ｔ ｅｒ ｏ ａ ａｉ ｖ ａ ｒ ｎ ｐ ｎ ｖ
高效液相色谱法研究三七指纹图谱高效液相色谱法高效液相色谱法原理液相色谱法反相高效液相色谱法高效液相色谱法ppt液相色谱法原理高效液相色谱法测定高效液相色谱法的应用硝基苯测定液相色谱法
指纹图谱及高效液相PPT课件
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正常使用前后色谱柱要强溶剂冲洗
• 参考图5-23，5-24 • “污物”在柱进口处积聚，柱压高等问题，用纯溶剂（甲醇、乙腈）正冲，
反冲。当柱子过“脏”时，正相柱可用甲醇（可加少量水）；反相柱可用异 丙醇加甲醇冲洗；96%二氯甲烷+4%甲醇+1%氢氧化铵20倍柱体积25cm 的柱子大约50ml
次预实验,然后按照一定速度(20%)降低强溶剂的比例。
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确定方法的有效性
• 在精密度、方法可重复性及样品稳定性分析中由五次进样所得共有峰的峰面积和峰保留时间的相对标准偏 差来确定。
• 由此确定仪器和进样精密度如何，提取方法，仪器状态，色谱条件是否适用。并确保溶液在规定温度条件 下48小时内稳定。
查阅文献名称 • 中药指纹图谱在中药质量控制中的应用—王乐 • 高效液相色谱数字化定量指纹图谱评价维C银翘片的中药 组分物质均一
性 —邵艳玲 • 地黄基于HPLC指纹图谱的质量评价及种质资源利用研究—曹建军 • 人参药材HPLC指纹图谱和高端保健品多维指纹图谱的研究—苑若瑶 • 六味地黄浓缩丸HPLC指纹图谱研究—高新彪 • 黄芎抗栓胶囊指纹图谱的研究_冯艺戎 • 高效液相色谱法同时测定黄芎抗栓胶囊中5种大黄成分的含量_韩燕全 • 仙鹤草质量控制方法的研究_丁蓓蓓
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用良好的流动相条件，包括PH、缓冲溶液 种类及浓度、添加剂，尽量减小硅胶基质 的“次级作用”。
流动相的配制方法：20mMol磷酸钠缓冲液：HCN（9：1）9体积的磷酸钠缓冲 液加1体积的HCN溶液混合。脱气方法应一致 缓冲溶液的配制方法：天平定量称量，定容到一定体积最准。如需控制PH值时应 使用酸度计，添加好的酸碱。
高效液相色谱法在中药指纹图谱中的应用现状及分析
高效液相色谱法在中药指纹图谱中的应用现状及分析【关键词】高效液相色谱法摘要：综述了高效液相色谱(HPLC)法指纹图谱在中药质量操纵方面的应用，并通过供试品的制备、标准品的选择、结果分析方式来论述中药指纹图谱的应用现状，指出高效液相色谱法应用于中药指纹图谱中现有不足的地方和以后的进展方向。
关键词：高效液相色谱；中药指纹图谱Application and Analysis of Fingerprint in Traditional Chinese Medicine by HPLCAbstract:This paper summarized the application of fingerprint of traditional Chinese medicine by HPLC to the quality also reviewed the actuality of fingerprint in traditional Chinese medicine through the preparation for sample,the choice for standard sample,and the method of result pointed out the main problems at present and the prospective future in application of fingerprint of traditional Chinese medicine by HPLC.Key words:HPLC; Fingerprint of Traditional Chinese medicine当前，中药指纹图谱技术在国内外已成为一种进展趋势。
第一是美国食物与药品治理局(FDA)许诺草药保健品申报资料能够提供色谱指纹图。
世界卫生组织(WHO)在1996年草药评判指导原那么中也规定：若是草药的活性成份不明，能够提供指纹图谱以证明产品质量的一致。
决明子超高效液相色谱指纹图谱研究
·论著·基金项目:国家中医药管理局2015年度中医药行业科研专项(201507002)作者单位:100102摇北京中医药大学中药学院中药品质评价北京市重点实验室[姬蕾(硕士研究生)、杨冉冉、乔艺涵(硕士研究生)、索亚然(硕士研究生)、梁文举(硕士研究生)、倪璐(硕士研究生)、赵霞(硕士研究生)、赵崇军(博士研究生)、林瑞超];中国中医科学院中药研究所(邹迪新)作者简介:姬蕾(1993-),女,2016级在读硕士研究生。
研究方向:中药品质评价研究。
E鄄mail:642981026@通信作者:林瑞超(1954-),博士,教授,研究员,博士生导师。
研究方向:中药品质评价研究。
E鄄mail:linrcha307@;邹迪新(1983-),女,讲师,博士。
研究方向:中药复方药效物质基础及作用机制研究。
E鄄mail:zoudixin@决明子超高效液相色谱指纹图谱研究姬蕾摇杨冉冉摇乔艺涵摇索亚然摇梁文举摇倪璐摇赵霞摇赵崇军摇林瑞超摇邹迪新揖摘要铱摇目的摇运用超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)技术建立一种快速、高效、全面评价中药决明子质量的指纹图谱方法。
方法摇流动相选用乙腈-0.1%磷酸水溶液对样品进行梯度洗脱,流速设置为0.3mL /min,检测波长为290nm,柱温为30益,进样量为3滋L。
色谱柱采用沃特世公司BEH C 18(2郾1伊100mm 1.7滋m)色谱柱,共计分析了28批不同地区中药决明子的UPLC。
结果摇初步建立了决明子UPLC 指纹图谱,运用中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析,共确定了40个共有峰,通过与标准物质保留时间的对比进行分析,初步确认了其中的10个化合物。
结论摇本实验方法为中药决明子提供了一种操作简便、快速、重复性好的质量评价方法,可为中药决明子的质量控制提供一定的参考。
揖关键词铱摇决明子;摇指纹图谱;摇质量评价;摇超高效液相色谱技术揖中图分类号铱摇R284摇揖文献标识码铱摇A摇doi:10.3969/j.issn.1674鄄1749.2019.05.008Study on UPLC fingerprint of Semen Cassiae 摇JI Lei ,YANG Ranran ,QIAO Yihan ,et al.摇College of Pharmacy ,Beijing University of Chinese Medicine ,Beijing 100102,ChinaCorresponding author :LIN Ruichao ,E鄄mail :linrcha307@ ;ZOU Dixin ,E鄄mail :zoudixin@揖Abstract 铱摇Objective 摇To establish a rapid,efficient and comprehensive method for the evaluationof the quality of Semen Cassiae ,a kind of Chinese medicne,by UPLC fingerprint.Methods 摇The mobile phase was eluted with acetonitrile -0.1%phosphoric acid aqueous solution.The flow rate is set to 0.3mL·min -1,the detection wavelength is set to 290nm,and the column temperature is set to 30毅C.The injection volume is set to 3滋L.And it was analyzed by Waters BEH C18(2.1伊100mm 1.7滋m)column.The UPLC fingerprints of 28batches of TCM Semen Cassiae in different regions were analyzed.Results 摇UPLC fingerprints of Semen Cassiae were preliminarily established,and the chromatographicfingerprint similarity evaluation system of traditional Chinese medicine was used to analyze.A total of40common peaks were identified.The comparison with the retention time of standard materials was carried out,and 10of them were initially confirmed.Conclusion 摇This experimental method provides a simple,rapid and reproducible quality evaluation method for Semen Cassia ,providing a reference for the quality control of Semen Cassia .揖Key words 铱摇Semen Cassia ;摇Fingerprint;摇Quality evaluation;摇UPLC摇摇中药决明子,其性苦,甘,归大肠,肝经[1]。
指纹图谱及高效液相
正常使用前后色谱柱要强溶剂冲洗
• 参考图5-23，5-24 • “污物”在柱进口处积聚，柱压高等问 题，用纯溶剂（甲醇、乙腈）正冲，反 冲。当柱子过“脏”时，正相柱可用甲 醇（可加少量水）；反相柱可用异丙醇 加甲醇冲洗；96%二氯甲烷+4%甲醇 +1%氢氧化铵20倍柱体积25cm的柱子 大约50ml
HPLC流动相的选择
乙腈-水，甲醇-水，乙腈-磷酸水溶液，乙腈-乙酸水溶液
流动相组分溶液浓度对色谱峰影响
在选择流动相体系若酸度较大时，峰型好的同时还须考 虑色谱仪酸承载能力
开始方法建立
• 首次HPLC分离较好的实验条件 • 色谱柱 C18、C8 5μm 15×0.46cm • 流动相 甲醇-水， 甲醇-甲酸水（？不太确定） 流速 1.5—2.0ml/min 温度 35—45℃ 样品量 体积<25μL 重量 <100 μg
分析方法的评价方式
• 精密度：取样品一定量按试验方法制备样品溶液， 24小时内连续进样5次，分析仪器及进样的精密 度。 • 重复性：取5份同样量的样品，按试验方法（制备 方法及色谱方法）进样分析，测分析方法的可重 复性。 • 精密度：取同一样品溶液室温下放置，48小时内 进样分析五次，分析样品溶液在室温下的稳定性。
指纹图谱测定实验步骤
• 1.供试品及对照品的制备 • 2色谱条件的选择 • 3.方法学考察
• • • • 线性关系的考察 精密度实验 稳定性试验 重现性试验（保证相对保留时间的RSD<1%,相对保留面 积的RSD<3%） • 加样回收率实验
• 4.指纹图谱的建立和共有指纹图谱峰的指认
样品的溶液制备选择方法
三 压力降
• 同一支色谱柱的渗透性（压力降）或反压力应 该相似。 • 用球形微粒填充的色谱柱的压力降可用下式估 算： P=3000Lη/（t0dp2） 式中P为压力（psi），L为柱长（cm），为流 动相粘度（cp），t0为死时间，dp为微粒的直 径。 新的色谱柱使用纯溶剂（甲醇、乙氰）冲洗时 要记录压力，这是色谱柱很重要的指标
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高效液相色谱指纹图谱的梯度条件优化
一、实验目的
1．进一步熟悉高效液相仪的操作。
2．学习梯度洗提的参数优化。
二、仪器与样品
1. HP1200高效液相色谱仪,配自动进样器，高压两元梯度泵及二极管阵列检测器。
2. 手动进样器，低压四元梯度泵，可变波长紫外检测器。
3. 色谱柱：Agilent C18键合固定相（15cm*
4.6mm，5um）。
4．茵陈药材
5. 甲醇（HPLC grade），H
3PO
4
（AR），纯净水，绿原酸标样
三．样品预处理
称取1克茵陈，用10ml甲醇/水（50/50）超声提取20分钟，过0.45um微孔滤膜,备用。
四．初始分析条件
(1) 流动相与梯度：根据文献自行设计
(2) 检测波长：根据文献自行设计
(3) 流速：0.8-1.0ml/min
(4) 柱温：室温
(5) 进样量：10-20uL
五．实验内容
根据初始条件下的分离情况，调整梯度洗脱参数，如起始浓度，斜率等，实现绿原酸类组分的基线分离。
六. 思考
（1）梯度洗脱与等度洗脱相比，各有何优缺点？
（2）对于复杂样品，你该如何着手开始实验？
（3）该实验中如何进行定性与定量分析？你认为影响定量准确度的因素可能会有哪些？。