红花高效液相色谱指纹图谱的研究21页PPT
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中药材高效液相色谱指纹图谱研究概述
２ ０ ０ ６， ２ ８ （ ９） ： １ ２ ４ ９—１ ２ ５ ３ ．
指 纹图谱 ： 色谱条件 ， 依利 特 Ｋ ｒ ｏ ｍ ａ ｓ ｉ ｌ Ｃ １ ８ 色谱 柱 （ ２ ０ ０ ｍ ｍ Ｘ ４ ． ６ ｍｍ， ５ ｍ） ； 柱 温 ４ ０ ℃； 流 动相 为 甲醇 （ Ａ相 ） 、 ６ ｍ ｍ ｏ ／ Ｌ— Ｎ ａ Ｈ Ｐ Ｏ （ Ｂ相 ， Ｈ Ｐ Ｏ 调 ｐ Ｈ ６ ． ５ ） ， 梯 度 洗脱 。流速 ０ ． ６ ｍ ｌ ／ 分； 检测 波 长 分段 用
科研人员对 指纹 图谱分 析技术 进行 了大
量研究 ， 取得 了可喜 的成绩 。中药指纹 图
谱 的研究 已经从早 期 只对单一 谱 图进行
简单评述 的阶段 ， 发展到利用计算机技术
雷海 民等 ｊ 报道， 不 同产地 牛 蒡 子
药材 Ｒ Ｐ—ＨＰ Ｌ Ｃ指 纹 图谱 研 究 ， 由于采 用梯度洗脱 的方式 ， 各批次供试 品指 纹图 谱 中色谱峰保 留时间可能不一致 ， 故 相似 度计算时未采用 自动校正方式 ， 而是使 用
获 取 的 色谱 条 件 ， 供 试 品 制备 方 法及 评 价
研 究等 ３个 方 面进 行 阐述 。结 果 ： 中药 指
数的一致性 ） ， 且稳定， 制 定 的指 纹 图谱
可对 白术药材组 分群体 特征 的一 致性作 出判断 。白术指 纹 图谱 有 自身化 学条码 的特征 ， 是其 内在化学成分种类与数量 的
色谱指纹图谱 ， 流速 ０ ． ５ ｍ ｌ ／ 分， 检 测波长 ２ ５ ０ ｎ ｍ， 其他色谱条件与 白术基本相 同。
李小 燕 等 报 道 ， 广 西 粉葛 药 材 高 效液相色谱指纹 图谱 的研究 ， 用 乙腈 一 ０ ．
指 纹图谱 ： 色谱条件 ， 依利 特 Ｋ ｒ ｏ ｍ ａ ｓ ｉ ｌ Ｃ １ ８ 色谱 柱 （ ２ ０ ０ ｍ ｍ Ｘ ４ ． ６ ｍｍ， ５ ｍ） ； 柱 温 ４ ０ ℃； 流 动相 为 甲醇 （ Ａ相 ） 、 ６ ｍ ｍ ｏ ／ Ｌ— Ｎ ａ Ｈ Ｐ Ｏ （ Ｂ相 ， Ｈ Ｐ Ｏ 调 ｐ Ｈ ６ ． ５ ） ， 梯 度 洗脱 。流速 ０ ． ６ ｍ ｌ ／ 分； 检测 波 长 分段 用
科研人员对 指纹 图谱分 析技术 进行 了大
量研究 ， 取得 了可喜 的成绩 。中药指纹 图
谱 的研究 已经从早 期 只对单一 谱 图进行
简单评述 的阶段 ， 发展到利用计算机技术
雷海 民等 ｊ 报道， 不 同产地 牛 蒡 子
药材 Ｒ Ｐ—ＨＰ Ｌ Ｃ指 纹 图谱 研 究 ， 由于采 用梯度洗脱 的方式 ， 各批次供试 品指 纹图 谱 中色谱峰保 留时间可能不一致 ， 故 相似 度计算时未采用 自动校正方式 ， 而是使 用
获 取 的 色谱 条 件 ， 供 试 品 制备 方 法及 评 价
研 究等 ３个 方 面进 行 阐述 。结 果 ： 中药 指
数的一致性 ） ， 且稳定， 制 定 的指 纹 图谱
可对 白术药材组 分群体 特征 的一 致性作 出判断 。白术指 纹 图谱 有 自身化 学条码 的特征 ， 是其 内在化学成分种类与数量 的
色谱指纹图谱 ， 流速 ０ ． ５ ｍ ｌ ／ 分， 检 测波长 ２ ５ ０ ｎ ｍ， 其他色谱条件与 白术基本相 同。
李小 燕 等 报 道 ， 广 西 粉葛 药 材 高 效液相色谱指纹 图谱 的研究 ， 用 乙腈 一 ０ ．
红花注射制剂有效成分含量测定与HPLC指纹图谱的研究_张林
关键词：红花；注射用红花黄色素；冻干粉针剂；红花注射制剂；指纹图谱；质量标准
Determination of active ingredient and HPLC fingerprint in safflower injection forms
ZHANG Lin, DU Shou-ying, LU Yang, WANG Zhen, LIU Chang, TIAN Zhi-hao
· 3528 ·
当代医药论丛杂志
·论著·
Hale Waihona Puke 红花注射制剂有效成分含量测定与 HPLC指纹图谱的研究
张林，杜守颖，陆洋，王振，刘畅，田志浩
（北京中医药大学，北京 100102）
摘要：目的：建立测定红花注射制剂中羟基红花黄色素A（HSYA）的高效液相色谱法和总黄酮的紫外-可 见分光光度法，并研究注射用红花黄色素指纹图谱，以提高红花注射制剂质量标准。方法：采用Merck KGaA Hibar-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相乙腈-含0.5%三乙胺的1%冰醋酸溶液（9∶91），流速1.0mL/ min，波长403nm，测定HSYA；使用紫外分光光度计，波长403nm，测定总黄酮；使用Synergl 4μm Hydro-RP 80A 色谱柱（250mm×4.6mm，4μm），流动相乙腈-0.05%磷酸，梯度洗脱，流速0.8mL/min，波长270nm，建立指纹 图谱。结果：方法学考察表明，检测方法各项指标均符合要求，准确测定了两种制剂10个批次中药效成分含量， 所得指纹图谱各色谱峰分离度好，充分反映粉针剂中所含成分种类和比例。结论：测定方法快速准确灵敏，发现 粉针剂所含药效成分比例更高，为提高红花注射制剂质量标准提供参考。
( Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China )
Determination of active ingredient and HPLC fingerprint in safflower injection forms
ZHANG Lin, DU Shou-ying, LU Yang, WANG Zhen, LIU Chang, TIAN Zhi-hao
· 3528 ·
当代医药论丛杂志
·论著·
Hale Waihona Puke 红花注射制剂有效成分含量测定与 HPLC指纹图谱的研究
张林，杜守颖，陆洋，王振，刘畅，田志浩
（北京中医药大学，北京 100102）
摘要：目的：建立测定红花注射制剂中羟基红花黄色素A（HSYA）的高效液相色谱法和总黄酮的紫外-可 见分光光度法，并研究注射用红花黄色素指纹图谱，以提高红花注射制剂质量标准。方法：采用Merck KGaA Hibar-C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相乙腈-含0.5%三乙胺的1%冰醋酸溶液（9∶91），流速1.0mL/ min，波长403nm，测定HSYA；使用紫外分光光度计，波长403nm，测定总黄酮；使用Synergl 4μm Hydro-RP 80A 色谱柱（250mm×4.6mm，4μm），流动相乙腈-0.05%磷酸，梯度洗脱，流速0.8mL/min，波长270nm，建立指纹 图谱。结果：方法学考察表明，检测方法各项指标均符合要求，准确测定了两种制剂10个批次中药效成分含量， 所得指纹图谱各色谱峰分离度好，充分反映粉针剂中所含成分种类和比例。结论：测定方法快速准确灵敏，发现 粉针剂所含药效成分比例更高，为提高红花注射制剂质量标准提供参考。
( Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China )
指纹图谱(PPT)
↓
↓
鉴别
质量评价
↓
↓
聚类分析
相似性差别
遗传算法
↓
人工神经网络
相似系数法
等等
夹角余泫法
欧氏距离等等
图 5 中药材、中药制剂药效组分指纹图谱信息处理研究框图
4、中药药效组分筛选及检测方法学
动态细胞培养 技术
电穿孔技术 ↘
细胞药物筛选 系统
↘
中药复方的有效 部位 ︱ ↓
中药复方药代动 力学
(血液、脑脊液)
三七总皂甙化学成分鉴定LCMS
the total saponins
Fr. III
Fr. II
Fr. IV
三七总皂甙化学成分
Fr.III-1中微量化合R1 物以HP分L析C制备
分离
100%CH3CN
R1
R1制备液相制备示意图
O OH
OH OH
OH
glc O
notoginsenoside R7
O OH
200
100
0 0
10
20
nm
mAU 800
VWD1
A,
Wavelength=203
(SANQI\A2112503.D)
700
600
500
400
300
200
100
0 0
10
nm 20
30 30 30 30 30
Carbosorb ODS-3
40
50
60
70
min
Lichosorb
40
50
60
70
min
Polaris
40
50
60
70
色谱指纹图谱评价PPT幻灯片
◆ 中药色谱指纹图谱 方法学
柱色谱
Column Chromatography
平面色谱
Planar Chromatography
液相色谱
Liquid Chromatography (LC)
气相色谱
Gas Chromatography (GC)
薄层色谱
Thin Layer Chromatography (TLC)
主要内容
◆ 色谱指纹图谱的缘起、属性、特点和作用 ◆ 中药色谱指纹图谱方法学 ◆ 中药色谱指纹图谱试验的规范化 ◆ 中药色谱指纹图谱的定性评价方法 ◆ 应用实践
◆ 色谱指纹图谱的缘起、 属性、特点和作用
中药质量控制现状
【名称】 【来源】 【性状】 【鉴别】
宏观特征鉴别
生药学
植物分类学 动物分类学 矿物学 微生物分类学
谱
中药各类制剂和相关产品指纹图谱
中药指纹图谱的建立
指纹图的获取 方法验证 指纹图的校验和复核
指纹图谱的获取
供试品收集
供试品制备
对照品（参比物）
指纹图谱试验研究
指纹图谱建立和辨识
供试品的收集
真实性、代表性；收集量不少于 10 批
◆ 原料药材
药材名称
供试品来源
原
药材名称收集时间及收集人
始 纪 录
货源情况调查 基原鉴定及鉴定人
毛细管电泳
Capillary Electrophoresis（CE）
反相高效液相色谱 (RP-HPLC)
Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography
●适用范围广 ●分离性能好 ●分析速度快 ●流动相选择范围宽
色谱指纹图谱评价PPT课件
面取得了显著进步。
毛细管电泳法（CE）
03
CE具有高分离效率和低成本的优势，尤其适合分析复杂生物样
品。
数据库的建立与完善
建立标准色谱指纹图谱库
收集各种样品的标准色谱指纹图谱，建立全面的数据库，为比对 分析提供参考。
数据标准化
对色谱数据进行处理和标准化，确保不同实验条件下的数据具有可 比性。
数据库更新与维护
谢谢观看
根据样品的性质和目标成 分，选择合适的色谱柱， 确保目标成分的有效分离。
流动相的选择
根据样品的性质和目标成 分，选择合适的流动相， 以获得最佳的分离效果。
检测波长的选择
选择适当的检测波长，以 便在指纹图谱中获得准确 的检测结果。
数据处理与分析
数据采集
按照设定的色谱条件进行实验 ，并采集色谱图数据。
色谱指纹图谱评价ppt课件
目录
• 引言 • 色谱指纹图谱的建立 • 色谱指纹图谱的解析 • 色谱指纹图谱的应用 • 色谱指纹图谱的局限性 • 色谱指纹图谱的发展趋势
01
引言
目的和背景
目的
介绍色谱指纹图谱在中药质量评价中的应用。
背景
随着中药产业的快速发展，中药质量评价方法的创新与改进成为行业关注的焦 点。色谱指纹图谱作为一种新型的中药质量评价方法，具有独特的优势和广泛 的应用前景。
数据预处理
对采集的数据进行必要的预处 理，如平滑化、基线校正等， 以提高数据的准确性和可靠性 。
特征峰的确定
通过对比对照品和样品色谱图 ，确定色谱指纹图谱中的特征 峰。
相似度评价
利用相关软件计算样品之间的 相似度，以评估色谱指纹图谱
的一致性和可靠性。
03
色谱指纹图谱的解析
电化学指纹图谱ppt课件
ຫໍສະໝຸດ 电化学指纹图谱用于中药定量分析
实验表明，特征参数诱导时间、最大振幅均能作为 定量分析的参数，均与甘草的用量呈良好的线性关 系。
面临的问题？？？
药材生产供应、流通领域的混乱对指纹图谱
的研究是不利的，用多种来源的药材很难制 定稳定的指纹图谱。 从药材提取分离到分析检测全过程的标准化、 规范化程度不够，影响实验室之间的重现性。 除中药注射剂外，大部分中药制剂生产工艺 简单粗糙，杂质较多，即难以保证产品的稳 定，更无法提供高的质量。
不同粉末粒度的薄荷电化学指纹图谱(单位：mm)
(a)0.20~0.45 (b)0.15~0.20 (c)0.10~0.15 (d)0.075~0.10
电化学指纹图谱用于中药的鉴别
以上结果表明，不同中药作为底物的化
学振荡反应体系，可以获得各具特色的 中药电化学指纹图谱，可进行中药的鉴 别和检测。
电化学指纹图谱
常见的中药指纹图谱
高效液相色谱指纹图谱 气相色谱指纹图谱 薄层色谱指纹图谱 高速逆流色谱指纹图谱 毛细管电泳指纹图谱 红外光谱指纹图谱
色谱指纹图谱局限性
液相色谱仅适用于真溶液体系；气相色谱仅适用于 中药挥发性成分分析 定性和定量参数一般只有保留值和峰强度，色谱峰 形也很少变化，因而其特征直观性不强，需进行数 据处理后鉴别和评价中药； 色谱技术不能直接用于成药和固体天然药物指纹图 谱的测定，测定前必须对其成分进行提取、分离等 预处理，因而繁琐、操作流程长、试剂消耗量大， 分析费用高，还引入杂质，提取的部分已不能代表 中药的全部成分。 -------因此，色谱指纹图谱仅适用于中药注射液和口 服真溶液。
电化学指纹图谱
不加入中药时获得的纯B-Z振荡体系的E-t曲线， 因持续振荡时间超过4h，故只截取部分E-t曲线
实验表明，特征参数诱导时间、最大振幅均能作为 定量分析的参数，均与甘草的用量呈良好的线性关 系。
面临的问题？？？
药材生产供应、流通领域的混乱对指纹图谱
的研究是不利的，用多种来源的药材很难制 定稳定的指纹图谱。 从药材提取分离到分析检测全过程的标准化、 规范化程度不够，影响实验室之间的重现性。 除中药注射剂外，大部分中药制剂生产工艺 简单粗糙，杂质较多，即难以保证产品的稳 定，更无法提供高的质量。
不同粉末粒度的薄荷电化学指纹图谱(单位：mm)
(a)0.20~0.45 (b)0.15~0.20 (c)0.10~0.15 (d)0.075~0.10
电化学指纹图谱用于中药的鉴别
以上结果表明，不同中药作为底物的化
学振荡反应体系，可以获得各具特色的 中药电化学指纹图谱，可进行中药的鉴 别和检测。
电化学指纹图谱
常见的中药指纹图谱
高效液相色谱指纹图谱 气相色谱指纹图谱 薄层色谱指纹图谱 高速逆流色谱指纹图谱 毛细管电泳指纹图谱 红外光谱指纹图谱
色谱指纹图谱局限性
液相色谱仅适用于真溶液体系；气相色谱仅适用于 中药挥发性成分分析 定性和定量参数一般只有保留值和峰强度，色谱峰 形也很少变化，因而其特征直观性不强，需进行数 据处理后鉴别和评价中药； 色谱技术不能直接用于成药和固体天然药物指纹图 谱的测定，测定前必须对其成分进行提取、分离等 预处理，因而繁琐、操作流程长、试剂消耗量大， 分析费用高，还引入杂质，提取的部分已不能代表 中药的全部成分。 -------因此，色谱指纹图谱仅适用于中药注射液和口 服真溶液。
电化学指纹图谱
不加入中药时获得的纯B-Z振荡体系的E-t曲线， 因持续振荡时间超过4h，故只截取部分E-t曲线
高效液相色谱技术在中药指纹图谱研究中的应用
几种特征成分（如色谱指纹图谱）以保证制剂和产品质量的一致”［２］。
我国国家药品监督管理局２０００年颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，要求到２００２年末，所有申报的中药注射剂均应有相关的指纹图谱资料， 使中药指纹图谱的研究成为中药研究的热点。
为实现中药材、中成药质量标准现代化，使中药走向世界，研究建立指纹图谱对实现中药质量标准现代化具有重要的意义。
２ 高效液相色谱技术在中药指纹图谱研究中的应用２．１ 高效液相色谱法构建中药指纹图谱应用于中药材的真伪鉴别及质量评价由于高效液相色谱仪的诸多优点并能对中药样品中含有的绝大多数成分进行分析检测及质量评价，故高效液相色谱技术已成为当前研究中药指纹图谱的主要手段。
欧洲国家现在普遍采用高效液相色谱法对植物药物中已知及未知组分进行控制，并形成相应的规范。
因此高效液相色谱法在构建中药指纹图谱对中药的定性鉴别与定量分析中得到广泛应用。
采用高效液相色谱法测定指纹图谱可对中药材的产地、采收时间、加工方法、工艺流程等多方面通过化学成分的差异来反映中药材的种属差异、真伪鉴别等，从而达到控制中药质量的目的。
刘梅［３］等采用ＨＰＬＣ色谱指纹图谱可以快速、准确对药材夏天无和延胡索进行定性鉴别。
张玉杰等［４］对不同产地正伪品沙苑子及伪品的主要有效成分黄酮类进行利用ＨＰＬＣ指纹图谱进行鉴别研究，研究显示不同来源的正品沙苑子ＨＰＬＣ指纹图谱十分相似，而２种伪品则显示出完全不同的指纹图谱特征，得出ＨＰＬＣ指纹图谱特征可以作为沙苑子质量评价和药材鉴别的依据。
李磊等［５］以不同产地正宗丹参和市场上充作丹参的其他鼠尾草属植物为分析对象，采用ＨＰＬＣ法构建丹参ＨＰＬＣ指纹图谱，可鉴别不同来源丹参与其他鼠尾草属丹参伪品。
高效液相色谱技术在中药指纹图谱研究中的应用许一平１ 罗启恩２１．山东中医药高等专科学校 ２６５２００２．莱阳农学院 ２６５２００高效液相色谱法（Ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）是在经典液相色谱法的基础上发展起来的一种新的色谱技术。
指纹图谱及高效液相PPT课件
色谱柱的冲洗和预平衡：
第25页/共29页
正常使用前后色谱柱要强溶剂冲洗
• 参考图5-23，5-24 • “污物”在柱进口处积聚，柱压高等问题，用纯溶剂（甲醇、乙腈）正冲，
反冲。当柱子过“脏”时，正相柱可用甲醇（可加少量水）；反相柱可用异 丙醇加甲醇冲洗；96%二氯甲烷+4%甲醇+1%氢氧化铵20倍柱体积25cm 的柱子大约50ml
次预实验,然后按照一定速度(20%)降低强溶剂的比例。
第15页/共29页
确定方法的有效性
• 在精密度、方法可重复性及样品稳定性分析中由五次进样所得共有峰的峰面积和峰保留时间的相对标准偏 差来确定。
• 由此确定仪器和进样精密度如何，提取方法，仪器状态，色谱条件是否适用。并确保溶液在规定温度条件 下48小时内稳定。
查阅文献名称 • 中药指纹图谱在中药质量控制中的应用—王乐 • 高效液相色谱数字化定量指纹图谱评价维C银翘片的中药 组分物质均一
性 —邵艳玲 • 地黄基于HPLC指纹图谱的质量评价及种质资源利用研究—曹建军 • 人参药材HPLC指纹图谱和高端保健品多维指纹图谱的研究—苑若瑶 • 六味地黄浓缩丸HPLC指纹图谱研究—高新彪 • 黄芎抗栓胶囊指纹图谱的研究_冯艺戎 • 高效液相色谱法同时测定黄芎抗栓胶囊中5种大黄成分的含量_韩燕全 • 仙鹤草质量控制方法的研究_丁蓓蓓
第24页/共29页
用良好的流动相条件，包括PH、缓冲溶液 种类及浓度、添加剂，尽量减小硅胶基质 的“次级作用”。
流动相的配制方法：20mMol磷酸钠缓冲液：HCN（9：1）9体积的磷酸钠缓冲 液加1体积的HCN溶液混合。脱气方法应一致 缓冲溶液的配制方法：天平定量称量，定容到一定体积最准。如需控制PH值时应 使用酸度计，添加好的酸碱。
第25页/共29页
正常使用前后色谱柱要强溶剂冲洗
• 参考图5-23，5-24 • “污物”在柱进口处积聚，柱压高等问题，用纯溶剂（甲醇、乙腈）正冲，
反冲。当柱子过“脏”时，正相柱可用甲醇（可加少量水）；反相柱可用异 丙醇加甲醇冲洗；96%二氯甲烷+4%甲醇+1%氢氧化铵20倍柱体积25cm 的柱子大约50ml
次预实验,然后按照一定速度(20%)降低强溶剂的比例。
第15页/共29页
确定方法的有效性
• 在精密度、方法可重复性及样品稳定性分析中由五次进样所得共有峰的峰面积和峰保留时间的相对标准偏 差来确定。
• 由此确定仪器和进样精密度如何，提取方法，仪器状态，色谱条件是否适用。并确保溶液在规定温度条件 下48小时内稳定。
查阅文献名称 • 中药指纹图谱在中药质量控制中的应用—王乐 • 高效液相色谱数字化定量指纹图谱评价维C银翘片的中药 组分物质均一
性 —邵艳玲 • 地黄基于HPLC指纹图谱的质量评价及种质资源利用研究—曹建军 • 人参药材HPLC指纹图谱和高端保健品多维指纹图谱的研究—苑若瑶 • 六味地黄浓缩丸HPLC指纹图谱研究—高新彪 • 黄芎抗栓胶囊指纹图谱的研究_冯艺戎 • 高效液相色谱法同时测定黄芎抗栓胶囊中5种大黄成分的含量_韩燕全 • 仙鹤草质量控制方法的研究_丁蓓蓓
第24页/共29页
用良好的流动相条件，包括PH、缓冲溶液 种类及浓度、添加剂，尽量减小硅胶基质 的“次级作用”。
流动相的配制方法：20mMol磷酸钠缓冲液：HCN（9：1）9体积的磷酸钠缓冲 液加1体积的HCN溶液混合。脱气方法应一致 缓冲溶液的配制方法：天平定量称量，定容到一定体积最准。如需控制PH值时应 使用酸度计，添加好的酸碱。