外泌体在疾病诊疗中的研究进展_刘艳华

CA19-9 仍 然 是 胰 腺 癌 最 可 靠 的 诊 断 血 清 标 记物，但可结合其他诊断工具，如胰腺癌患者血清 miRNA 可 鉴 别 疾 病 是 良 恶 性 肿 瘤 还 是 炎 症 [14]， Wang 等研究[20]证实了胰腺癌血清中外泌体携带胰 腺癌干细胞标记物。 另外，外泌体 miRNA 也可作 为肺癌的诊断标志物[21]。 Logozzi 等[22]发现血浆外泌 体中 CD63+可作为黑色素瘤的蛋白标志物。 胶质母 细胞瘤患者血清中可检测到肿瘤特异性的表皮生 长因子受体(EGFRⅧ)[23]，血清 miR-21 在胶质母细 胞瘤体中增加了 40 倍。
外泌体是细胞内内溶酶体微粒内陷形成多囊 泡体， 并在刺激作用下多囊泡体与细胞膜融合向 胞外分泌的大小均一， 直径为 40~100nm 的囊泡， 可以通过电镜进行观察； 外泌体的特异性蛋白包 括 Alix、Flotillin-1、Lamp-1、Lamp-2、CD63 和 CD9 等[10]， 可 通 过 免 疫 印 迹 分 析 以 及 流 式 细 胞 仪 进 行 鉴 定。 目前的实验技术主要依靠离心速率法来分离 各类微泡， 但物理作用能导致微泡结构及大小的 改变， 流式细胞仪可以同时检测物质的大小和密 度，但 300nm 以下的囊泡无法被测到。 微泡没有独
·２６８·
实验与检验医学 2014 年 6 月第 32 卷第 3 期 Experimental and Laboratory Medicine, Jun.2014,Vol.32,No.3
吞-融合-外排” 等一系列调控过程而形成的细胞 外 纳 米 级 小 囊 泡 ， 其 膜 上 含 有 GPI 铆 定 蛋 白 、 CD63、TNFR1， 其 分 泌 主 要 依 靠 转 运 必 需 内 吞 体 分 选复合物，多数为持续性释放。 然而，SV 一般大于 200nm，甚 至 超 过 1μm，无 规 则 形 状 ， 含 有 收 缩 蛋 白、 金属蛋白酶及整合素， 脂类成分以胆固醇为 主，一般不会持续释放[8]。 ２ 外泌体的提取和鉴定
实验与检验医学 2014 年 6 月第 32 卷第 3 期 Experimental and Laboratory Medicine, Jun.2014,Vol.32,No.3
·２６９·
但它们在尿中表现出了极大的变异。 另外，前列腺 癌患者的尿中也有 miR-107 和 miR-574-3p 上调 的实验研究 [18]， 血浆中的外泌体均有存活素(Survivin)， 前列腺癌存活素的表达与健康者和良性前 列腺增生相比上调了。 经免疫印迹法和流式细胞 仪 分 析 [19]， 膀 胱 肿 瘤 细 胞 来 源 的 外 泌 体 在 膀 胱 肿 瘤 中可能检测到蛋白质的阳性表达， 其中重要的有 外 泌 体 中 CD36，CD44 的 表 达 在 健 康 和 疾 病 状 态 有明显的差别。
特的表面标志物，其膜脂质成分、蛋白组成、密度 也还需进一步检测。 ３ 外泌体在疾病诊断的研究进展
在 疾 病 诊 断 方 面 ， 外 泌 体 含 有 蛋 白 质 ，mRNA， miRNAs 等信号分子，它们反映分泌细胞的生理状 态和功能状态， 甚至还会包含细胞病态相关的分 子信息， 从而提供了丰富的潜在的生物标志物分 子源。 临床研究已发现，不同疾病的不同类型细胞 都能分泌含有 RNAs 的外泌体，这使得从人体体液 中纯化外泌体，再对其 RNA 成分及序列分析成为 可能，有望用于疾病诊断及监测，尤其在肿瘤标志 物检测方面。 外泌体作为生物标志物虽然还处于 起步阶段，但随着进一步的研究，外泌体的临床应 用可能会有良好的前景。 3.1 外 泌 体 在 肿 瘤 疾 病 诊 断 中 的 应 用 肿 瘤 是 威 胁人类健康和生存最主要的疾病之一， 恶性肿瘤 发病率和死亡率日趋增高， 给社会和家庭带来沉 重的经济和疾病负担。 肿瘤在生长过程中会不断 地将外泌体释放到周围环境中， 外泌体含有 miRNA，因此检测体液中的外泌体及外泌体 RNA 有助 于肿瘤诊断和预后判断，Rosell 等[11]对非小细胞肺 癌的相关研究得出了相似的结果。 miRNA 不仅是 遗传信息的内源性调控者， 也是调节细胞通讯的 分泌因子及疾病的生物标志物。 miRNA 作为一种 在某些肿瘤中可能出现异常表达的非编码的 RNAs， 可以作为肿瘤诊断和预后判断的生物标志 物[12]。 Taylor 等[13]发现卵巢癌患者与正常人血液中 外泌体的 miRNA 图谱有明显的差异，说明外泌体 有助于卵巢癌的诊断； 并且还发现从血清中分离 出 的 肿 瘤 来 源 外 泌 体 中 的 miRNA 与 卵 巢 癌 组 织 中提取出的 miRNA 具有很好的相关性，以及患者 组 与 正 常 对 照 组 的 miRNA 图 谱 分 析 结 果 也 显 示 出明显的差异。 卵巢癌患者血清中的外泌体有 8 种 miRNA 显著增加[13]，另外，也有研究[14]发现卵巢 癌 患 者 的 腹 水 和 血 清 中 可 检 测 到 蛋 白 CD24 和 EpCAM 的表达。
1985 年 Pan 等[3]通过电镜发现，在网织红细胞 向成熟红细胞发育过程中， 晚期胞内体可与细胞 膜相融合释放其中大量的亚细胞囊泡结构， 由于 外泌体含有大量特异性的蛋白质及功能性的 mRNAs、miRNAs，是 细 胞 积 极 分 泌 的 结 构 ，与 凋 亡 细 胞分泌的小泡有着本质区别。 外泌体的质膜含有 丰富的胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺、脂筏及磷脂酰 丝氨酸。 外泌体也含有与其来源细胞相类似的细 胞因子、生长因子等蛋白质，以及脂质、编码或非 编码 RNA 等生物活性物质，在细胞之间物质交换
实验与检验医学 2014 年 6 月第 32 卷第 3 期 Experimental and Laboratory Medicine, Jun.2014,Vol.32,No.3
·２６７·Leabharlann ·综 述·外泌体在疾病诊疗中的研究进展
刘艳华 综述，王小中 审校
(南昌大学第二附属医院检验科，江西 南昌 330046)
2008 年 Mitchell 等[15]发现 miR-141 是前列腺 癌 的 一 个 可 靠 的 诊 断 标 志 物 ， 且 有 研 究 [16]证 明 血 清 miR-141 与 miR-375 水平与前列腺癌的肿瘤进展 相关。Nilsson 等[17]发现在前列腺癌患者尿中的外泌 体有蛋白标记物 5T4，前列腺 癌 基 因-3(PCA-3)和 mRNA (TMPRSS2-ERG) 的 表 达 存 在,在 前 列 腺 癌 患者尿外 泌 体 中 也 检 测 到 PSA 和 PSMA 的 表 达 ，
摘要: 外泌体是多种细胞主动分泌的直径为 40～100 nm 的囊泡，这些成分可以从多种体液中分离。 外泌体含有蛋白质， mRNA，miRNAs 等信号分子，它们反映分泌细胞的生理状态和功能状态，从而提供了丰富的潜在的生物标志物分子源。 除了 用于疾病诊断外，外泌体还具有抗肿瘤免疫，诱导肿瘤免疫逃逸、促进肿瘤血管新生和肿瘤转移等生理功能。 本文主要对外 泌体在疾病诊疗中的研究进展进行综述。
微泡(Microvesicles)是广泛存在于正常细 胞 和 肿瘤细胞的胞外细胞器样结构， 能运载多种特异 性蛋白、微小 RNA 及 DNA 片段，在细胞间物质和 信息转导中起重要作用。 微泡可能含有多种亚型， 包括外泌体、脱落小泡(shedding vesicles，SV)、分泌 性微泡、膜颗粒及外泌体样小泡等，这些命名是否 存在概念的重合尚不明确。 外泌体是细胞经过“内
外泌体提取的方法有离心法、过滤离心法、密 度 梯 度 离 心 法 、免 疫 磁 珠 法 和 色 谱 法 等[9]，但 没 有 一种方法能同时保证外泌体的含量、纯度、生物活 性。 离心法是外泌体提取常用的方法，得到的外泌 体量多，但是纯度不足，而且这种物理作用可导致 外泌体结构及大小的改变。 过滤离心法是利用不 同截留相对分子质量 (MWCO)的超滤膜离心分离 外泌体，这种操作简单、省时，不影响外泌体的生 物活性，但分离的外泌体纯度也不足。 外泌体目前 广泛应用的提取方法是蔗糖密度梯度超速离心 法， 通过逐步去除细胞、 细胞碎片， 在高达 100 000g 离心力的情况下得到富含外泌 体 的 沉 积 物 ， 在蔗糖梯度液中将其中含有与外泌体非特异性结 合的蛋白质、 蛋白质聚集物等杂质超速离心进行 进一步的纯化。 此种方法分离得到的外泌体纯度 高，但前期准备工作繁杂，耗时，量少。 免疫磁珠法 是利用包被有单克隆抗体的球型磁性微粒特异性 结合靶物质得以分离外泌体， 这种方法可以保证 外泌体形态的完整，特异性高、操作简单、不需要 昂贵的仪器设备，但是非中性 pH 和非生理性盐浓 度会影响外泌体的生物活性， 不便进行下一步的 实验。 另外，根据凝胶孔隙的孔径大小与样品分子 尺寸的相对关系， 利用色谱法也可对外泌体进行 分离，此法分离到的外泌体在电镜下大小均一，纯 度高，但需要特殊的设备，应用不广泛。
关键词:外 泌 体 ； 生 物 标 志 物 ；MicroRNA； 诊 断 ； 治 疗 中图分类号:R730.5,R730.23 文献标识码：A 文章编号：1674-1129(2014)03-0267-05 DOI:10.3969/j.issn.1674-1129.2014.03.012
外泌体(Exosomes)是一种细胞主动分泌的大小 均一， 直径为 40～100nm 的脂质 双 分 子 层 结 构 囊 泡，可由树突细胞、淋巴细胞、血小板、肥大细胞 、 内皮细胞 、成纤维细胞 、间充质干细胞和肿瘤细 胞等不同细胞类型脱落释放， 在大多数体液如外 周血、尿液、唾液、腹水、羊水、乳汁、脑脊液、关节 液、支气管肺泡灌洗液等体液中可检测到[1]。 透射 电子显微镜下外泌体观察常为杯状， 但是在体液 中通常为球形结构，在蔗糖溶液中的密度为 1.13～ 1.19g/ml，其密度与细胞来源相关，并随蛋白含量而 改变[2]。 不少实验证明外泌体可携带多种蛋白质、 脂 质 、mRNA、miRNA，参 与 细 胞 通 讯 、 细 胞 迁 移 、 血 管新生、免疫反应和肿瘤细胞生长等过程。 然而， 外泌体的发现虽有 30 多年历史，但其在疾病诊疗 方面的研究还处在初级阶段。 １ 外泌体的起源、结构及其生物学特性