吡拉格雷钠对氧糖剥夺_复氧后星形胶质细胞水肿及AQP4表达的影响_许淑红

胞培养液，测定乳酸脱氢酶 （ lactate dehydrogenase， LDH） 活性，结果计算采用公式： LDH 漏出率 / % = ［培 养 基 LDH / （ 胞 质 LDH + 培 养 基 LDH） ］ × 100% 。 1． 2． 6 星形胶质细胞活性鉴定（ MTT 法） 取星形 胶质细胞以 1 × 108 ·L － 1 密度种于 96 孔培养板中， 每孔接种 100 μL，每组设 6 个复孔，培养至所需的 天数，DMEM 培养基冲洗 3 次，加 5 μL 的 MTT（ 5 g ·L － 1 ） ，孵 育 4 h，弃 去 MTT 及 培 养 基，每 孔 加 入 200 μL 的 二 甲 基 亚 砜，振 荡 5 min，酶 标 仪 （ A570 nm） 测 定，取 均 值，采 用 公 式 计 算 结 果： 细 胞 存 活 率 / % =［A（ 实验组） / A（ 对照组） ］× 100% 。 1． 2． 7 Western blot 测定星形胶质细胞 AQP4 蛋白 表达水平 去除培养液，加入蛋白裂解液，置于冰上 裂解 20 min； 4℃ 下14 000 × g 离心 10 min，取上清， 用 BCA 法测定总蛋白浓度。30 ～ 50 μg 总蛋白上样 量以浓度为 8% 的凝胶电泳分离。冰水浴下恒流 （ 300mA） 湿法转膜 1. 5 h，以体积分数 5% 的脱脂奶 粉封闭 1 h，加 AQP4 一抗（ 1 ∶ 300） ，4℃ 共孵育过 夜。TBS-T 洗涤，与二抗共孵育 2 h，用增强型化学 发光试剂进行显色，并利用灰度分析软件定量分析， 以 β-actin 的灰度值标化蛋白表达水平。 1． 2． 8 RT-PCR 测定星形胶质细胞 AQP4 mRNA 转 录水平 取 各 组 别 星 形 胶 质 细 胞，均 匀 粉 碎 后 按 TRIzol 提取 程 序 （ 说 明 书 ） 提 取 组 织 总 RNA； 按 AMV 逆转录试剂盒操作说明进行逆转录后，4℃ 保 存。扩增引物： AQP4 上 游 引 物 5'-GGAATTTCTGGCCATGCTTA-3'，下 游 引 物 5'-AAGACAGACTTGGCGATGCT-3'，扩增片段产物长 231 bp。β-actin 上 游引 物 5'-CTGCCGCATCCTCTTCCTC-3'，下 游 引 物 5'-CTCCTGCTTGCTGATCCACTA-3'，扩增产物长 398 bp。扩增条件： 94℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 20 s，共 35 个循环。2% 琼脂糖凝胶电泳后，凝胶成像仪观 察，用 Band Scan 5. 0 软 件 测 定 条 带 灰 度 值，将 AQP4 mRNA、分别与 β-actin mRNA 灰度值的比值 作为观察指标，进行统计学分析。 1． 3 统计学分析 采用 SPSS19. 0 进行统计分析， 计量资料采用 x珋± s 表示，组间比较均采用单因素方 差分析（ One-way analysis of variance，ANOVA） 处理。 2 结果 2． 1 TSF 对 OGD / Reox 后星形胶质细胞体积变化 的影响 2． 1． 1 OGD / Reox 后不同时间点星形胶质细胞体 积变化 经过 2 h 时长的氧糖剥夺后，星形胶质细 胞不同时间点细胞体积随着时间延长呈不断增高趋
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ma 公司） ； D-Hanks 缓冲液； 3-氧 － 甲基-［1-3H］-D葡萄糖； 根皮素； NaOH 溶液； HCl 溶液； BCA 蛋白浓 度测定试剂盒（ Beyotime 公司） ； AQP4 一抗（ Abcam 公司） ； 酶标仪； 低温离心机； 二氧化碳孵箱。 1． 2 实验方法 1． 2． 1 原代星形胶质细胞的培养 取 SD 乳鼠脑 组织，用预冷 D-Hanks 缓冲液清洗表面血迹，并快速 除去脑膜和血管，制备单细胞悬液，以上操作均在无 菌条件下进行。将单细胞悬液接种入培养瓶中，培 养瓶置于二氧化碳孵箱（ 5% CO2 ，20% O2 ） ，37℃ 恒 温培养 1 h； 将细胞悬液转换至另一培养瓶，继续置 于二氧化 碳 孵 箱 培 养，隔 2 ～ 3 d 换 液，7 d 后 于 37℃ ，200 r · min － 1 振 荡 18 h，换 液，细 胞 长 满 至 90% ～ 95% 瓶底时，以 0. 25% 胰蛋白酶消化离心， 重复传代至第 3 代，此时即得到成熟纯化的原代星 形胶质细胞［8］。 1． 2． 2 氧糖剥夺 /复氧星形胶质细胞水肿模型的建 立 弃去星形胶质细胞培养瓶中的正常培养基， PBS 快速冲洗 2 次。加入无糖 DMEM 培养基，置于 低氧（ 1% O2 ，5% CO2 ） 孵箱，进行 2 h 的氧糖剥夺 培养； 氧糖剥夺后，弃去无糖 DMEM 培养基，置 于 DMEM / F 12 培养基，正常条件培养。 1． 2． 3 实验分组 将体外原代星形胶质细胞分为 4 个组： ① 正常组： 正常星形胶质细胞在二氧化碳 孵箱（ 5% CO2 ，20% O2 ） ，37℃ 恒温，以 10% 胎牛血 清的 DMEM / F 12 培养基培养； ② 氧糖剥夺 / 复氧 （ oxygen glucose deprivation / reoxygenation， OGD / Reox） 损伤组： 将正常星形胶质细胞进行 2 h 氧糖剥 夺培养，恢复正常条件培养至 6、12、24 和 48 h 4 个 时间点； ③ Ozagrel 阳性对照组： 在星形胶质细胞行 OGD / Reox 损伤各时间点在细胞培养基中加入治疗 浓度的 Ozagrel 治疗； ④ TSF 治疗组： 星形胶质细胞 OGD / Reox 损伤模型建立后各时间点在细胞培养基 中加入不同浓度梯度的 TSF 治疗。 1． 2． 4 细胞体积测定 各时间点实验结束前 30 min，加 3-氧 － 甲基-［1-3H］-D-葡萄糖于细胞培养基 中，使其终浓度为 1. 85 × 108 Bq·L － 1 ，以此作示踪 物测定细胞体积。各时间点取样，用预冷根皮素（ 1 mmol·L － 1 ） 培养基快速洗 6 遍，以终止反应，NaOH 消化 10 min，以等浓度 HCl 中和，加闪烁液混匀，取 0. 5 mL 用于流体闪烁计数，取 0. 1 mL 用于 BCA 法 蛋白质 含 量 测 定，换 算 成 细 胞 内 水 含 量 （ Kletzien 法） ，结果以 L·g － 1 蛋白表示。 1． 2． 5 LDH 漏出率测定 星形胶质细胞分别在氧 糖剥夺 / 复氧培养至各时间点，各组取约 0. 3 ml 细
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吡拉格雷钠对氧糖剥夺 /复氧后星形
胶质细胞水肿及 AQP4 表达的影响
许淑红1 ，尹茂山2，3 ，吴玉林1
（ 1． 中国药科大学药学院，江苏 南京 211198； 2． 济南大学山东省医学科学院医学与生命科学学院， 山东 济南 250200； 3． 山东省医学科学院药物研究所，山东 济南 250062）
E-mail： 2339855844@ qq． com； 吴玉林（ 1956 － ） ，男，硕士，副教授，研究方向： 心脑血管 药理学，E-mail： wylcpu625@ 163． com
碍和死亡的主要原因之一。水通道蛋白 4（ aquaporin，AQP4） 是膜水通道蛋白家族的一员，在脑组织中 广泛表达，是控制水出脑组织的通道，在脑组织水平 衡、星形细胞迁移、神经兴奋及炎症等方面均起着 重要作用［2］。大量研究［2 － 3］表 明，AQP4 与 脑 水 肿 关系密切，AQP4 在星形胶质细胞周足处表达明显， 调控水分子出入脑组织，因此在脑水肿的形成和消 退的各个阶段起着重要作用，参与了多种疾病所引 起的脑 水 肿 的 病 理 过 程。 进 一 步 研 究［4 － 6］ 显 示， AQP4 定位于星形胶质细胞（ astrocyte，Ac） 上，被发 现在脑水肿的形成中能明显促进 Ac 的肿胀，AQP4 作为一个潜在的药物作用靶点成为预防和治疗脑水 肿的研究热点之一。脑水肿形成的因素很多，其中 血小板功能异常是参与脑血栓形成的重要因素，与 脑水肿关系密切。奥扎格雷钠是 TXA2 合成酶抑制 剂，抑制 TXA2 的生成，抑制血小板聚集，同时促进 PGI2 的产生，从而使凝血过程受到有效抑制，达到 改善微循环，增加脑血液供应，达到消除脑水肿的作 用。临床试 验［7］ 证 明，奥 扎 格 雷 钠 具 有 见 效 快、疗 程短、价格适中、无毒副作用等诸多优点。吡拉格雷 钠（ tetramethylpyrazine-2'-O-sodium ferulate，TSF） 是 以奥扎格雷钠为先导物进行改良的结构新型的血栓 烷素 A2 合成酶抑制剂。本课题组的前期研究发现， 吡拉格雷可以明显减轻大鼠脑缺血 /再灌注后的脑 水肿，很好地保护血脑屏障的完整性，但其减轻脑水 肿的具体途径及机制目前都尚不清楚。本研究通过 对体外星形胶质细胞行氧糖剥夺 / 复氧处理，建立细 胞水肿模型，观察 TSF 对星形胶质细胞水肿模型的 治疗效果及其对 AQP4 表达的影响。 1 材料与方法 1． 1 实验动物及材料 1． 1． 1 实验动物 出生 3 d 内的 SD 新生乳鼠（ 由 江苏大学动物中心提供） 。 1． 1． 2 材料及试剂 戊巴比妥钠（ 美国 Sigma 公 司） ； 胎 牛 血 清，0. 25% 胰 蛋 白 酶 （ 含 0. 025% EDTA） ，DMEM 无糖培养基，DMEM 培养基（ 美国 Sig-
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
doi： 10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2015． 12． 008 文献标志码： A 文章编号： 1001 － 1978（ 2015） 12 － 1661 － 07 中国图书分类号： R322． 8； R329． 24； R651． 15； R743． 3； R977． 6 摘要： 目的 探讨氧糖剥夺并复氧培养后星形胶质细胞水肿 及其水通道蛋白 4（ AQP4） 表达的变化以及吡拉格雷（ TSF） 对其表达变化的影响。方法 体外培养原代星形胶质细胞， 建立氧糖剥夺 / 复氧细胞水肿模型，并随机分为正常组、氧糖 剥夺 / 复氧损伤（ OGD / Reox） 组、奥扎格雷钠 （ Ozagrel） 阳性 对照组和 TSF 治疗组，在氧糖剥夺 / 复氧损伤后 6、12、24 和 48 h 4 个时间点测定细胞体积变化，乳酸脱氢酶（ LDH） 漏出 率、MTT 法检测细胞损伤及存活情况，Western blot 法检测各 组细胞膜 AQP4 蛋白的表达水平，RT-PCR 法检测各组细胞 AQP4 mRNA 的转录水平。结果 星形胶质细胞经缺氧再复 氧处理，随着复氧时间的延长细胞损害加重（ P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01） ； TSF 治疗组的细胞体积明显低于 OGD / Reox 损伤组 （ P ＜ 0. 05 ） ； 给 予 TSF 治 疗 后 细 胞 在 氧 糖 剥 夺 / 复 氧 后 的 LDH 漏出率较 OGD / Reox 损伤组明显降低（ P ＜ 0. 05） ； TSF 治疗组与单纯氧糖剥夺 / 复氧相比较 MTT 检测细胞活力明 显升高（ P ＜ 0. 05） ； 给予 TSF 治疗组，AQP4 表达明显降低（ P ＜ 0. 05） ； 与 Ozagrel 相比较差异无显著性。Western blot 及 RT-PCR 检测蛋白及 mRNA 的表达水平，给予 TSF 治疗组的 AQP4 蛋白及 mRNA 表达均明显降低 （ P ＜ 0. 05） 。结论 TSF 治疗能明显减轻体外氧糖剥夺 / 复氧损伤引起的星形胶 质细胞水肿，可能是通过降低氧糖剥夺后 AQP4 的表达水平 而实现。