9_3_氨基苯胺基_吖啶与核酸作用的荧光光谱及其分析应用_朱燕舞

　第17卷第4期2005年8月化学研究与应用ChemicalResearchandApplicationVo.l17,No.4Aug.,2005　
收稿日期:2004-09-13;修回日期:2005-02-17
联系人简介:朱燕舞(1977-),女,硕士,主要从事有机试剂的合成与分析工作。Email:yanwuzhu@sina.com

文章编号:1004-1656(2005)04-0468-03
9-(3-氨基苯胺基)吖啶与核酸作用的荧光光谱
及其分析应用

朱燕舞
1,2,周运友1
(1.安徽师范大学化学与材料科学学院,安徽芜湖　241000;
2.合肥工业大学化学工程学院,安徽合肥　230009)

摘要:报道了荧光试剂9-(3-氨基苯胺基)吖啶(简称:m-APAA)的合成,产品经多次重结晶提纯,用
IR、1HNMR和元素分析确证了结构。研究了该物质与DNA作用的荧光光谱,随着DNA的加入观察到418nm
(λex=256nm)处的荧光峰猝灭,且其猝灭程度与DNA的浓度成正比,据此拟定了测定DNA的分析方法。实
验了最佳条件,干扰实验,确定了反应机理。该方法简便、快速、灵敏度高。
关键词:荧光试剂;9-(3-氨基苯胺基)吖啶;测定;DNA
中图分类号:0657.39 文献标识码:A

吖啶类化合物具有良好的荧光性能和生物活性以及理化性能[1～6],基于这些特性已用于多种物质的测定,如测定谷胱甘肽还原酶[7]、作为DNA的嵌入试剂[8]、作为光化学裂解DNA试剂[9]等。核酸作为重要的遗传物质,它的测定对于研究核酸的生物化学反应,发展核酸的医药制品以及对疾病的诊断和防治均有重要意义[10]。荧光法是定量测定核酸的一种常用方法,包括荧光增强和荧光猝灭法,通常较光度法有更高的灵敏度。但是由于DNA的内源荧光很弱,直接利用其荧光测定受到限制。近年来人们对核酸探针很感兴趣,核酸荧光探针作为核酸标记的工具,具有方便、快速、灵敏度高和安全等特点,受到广泛关注。我们合成了新荧光试剂9-(3-氨基苯胺基)吖啶(m-APAA),其结构式为:研究了该物质与DNA作用的荧光光谱,随着DNA的加入观察到418nm(λex=256nm)处的荧光峰猝灭,且其猝灭程度与DNA的浓度成正比,据此拟定了测定DNA的分析方法,实验了最佳条件,干扰实验。该方法简便、快速、灵敏度高。
1　9-(3-氨基苯胺基)吖啶的合成
及分析鉴定

N-苯基邻氨基苯甲酸和9-氯吖啶按文
献[11]合成。取9-氯吖啶1g(4.68mmol),加入
40mL无水乙醇搅拌溶解后加入间苯二胺0.5g
(4.68mmol),氮气保护下室温搅拌反应22h后,过
滤出红褐色固体,用少量乙醇多次洗涤,干燥。用
甲醇∶水=5∶1(v/v)作溶剂重结晶三次,得到橘
黄色针状晶体0.7g(产率53%),熔点:220℃-
222℃。IR(KBr压片):υ(cm
-1
)3424,3303

(-NH
2
),3085(=C-H),1682,1585,1552,1519

(苯环骨架振动),865,756,691(间位取代
苯)。1HNMR(DMSO-d6)∶δ(ppm)5.48(s,2H,
Ph-NH2),6.46-7.15(m,4H,苯基上的质子),
7.38-8.26(m,8H,吖啶环上的质子)。元素分析
(%):C
19H15N3
,实测值(计算值):C80.20

(79.95),H4.96(5.31),N14.01(14.73)。
由以上分析鉴定结果可以确证所合成的化合
物与目标物相符。
2　实验部分
2.1　仪器与试剂
F-4500型荧光分光光度计(日本日立公
司),pHs-2C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂)。
m-APAA溶液浓度:1.0×10-4mol/L;DNA储备
溶液:将一定量的鱼精脱氧核糖核酸(fs-DNA,
Sigma化学试剂公司)和小牛胸腺DNA(ct-DNA,
Sigma化学试剂公司)直接溶于适量水中,并保存
于0℃-4℃冰箱中,操作液浓度为100mg/L;三羟
甲基氨基甲烷(Tris)溶液浓度为0.05mol/L。其
余试剂均为分析纯,实验用水为亚沸蒸馏水。
2.2　实验方法
在10mL容量瓶中加入一定量m-APAA、1mLTris-HCl缓冲溶液、fs-DNA(或ct-DNA)溶液,用水稀释至刻度,以不含fs-DNA(或ct-DNA)的溶液为试剂空白,静置30min后,以λex=256nm光激发,λem=418nm处测定荧光强度。3　结果与讨论3.1　荧光光谱按照实验方法分别绘制m-APAA与ct-DNA及空白溶液的荧光光谱图,结果如图1。λex=256nm,λem=418nm。当加入ct-DNA后,418nm处的荧光强度减弱,442nm处的驼峰也相应减弱,且418nm的发光强度随着DNA浓度增加而递减,据此拟定了测定DNA的方法。实验证明该方法是可行的。图1　激发光谱和发射光谱Fig.1　Thefluorescentexcitationandemissionspectra1,1’:1.0×10-5mol/Lm-APAA;2,2':1.0×10-5mol/Lm-APAA+10mL/L　ct-DNA3.2　pH的影响用HCl、NaOH、Tris溶液调节体系pH值。实验了不同pH下对体系荧光强度影响,结果表明:当体系中存在DNA时,在pH<3和pH>10时ΔF值较小,pH值在5.5-10.0之间ΔF值较大并基本保持不变,表明在强酸和强碱的介质中DNA的双螺旋结构发生改变,而将结合的m-APAA从DNA的双螺旋结构中释放出来,使体系中游离的m-APAA的浓度增加,从而使ΔF值较小。本实验对于fs-DNA选用Tris-HClpH=6.40缓冲溶液;对于ct-DNA选用Tris-HClpH=7.00缓冲溶液。3.3　m-APAA浓度变化对体系的影响试验了m-APAA浓度变化对体系的影响,结果表明1.0mL1.0×10-4mol/Lm-APAA时体系的F0/F较大。3.4　时间对体系的影响
考察了将溶液静置10-60min时对体系荧光强
度的影响。结果表明m-APAA的荧光强度随时间
的延长先增强接着又逐渐减弱。当存在DNA时,荧
光强度逐步减弱,表明在25-60minF0/F最强且基
本稳定。本实验选用静置30min时测定为佳。
3.5　KI荧光猝灭
I-离子为一动态猝灭剂。通过考察其对小分
子荧光的猝灭作用可以判断小分子与DNA的作用
方式。与纯水介质相比,根据文献[12]可知,当小分
子与DNA属于嵌入作用时,I-的猝灭作用减弱,又
由文献[13]可知,当小分子与DNA属于沟槽作用时,
I-的猝灭作用增强。由图2可看出,与纯水介质相
比,在DNA存在下,I-对m-APAA的荧光猝灭略
有增强。但是根据文献[5]吖啶刚性平面环一般与
DNA作用方式为嵌入式,所以推知m-APAA的9
-位取代基可能与DNA的小沟槽结合。

图2　KI荧光猝灭实验
Fig.2　Fluorescencequenchingofm-APAA
(1.0×10-5mol/L)byKIintheabsenceof
ct-DNA(■)andinthepresenceofct-DNA( )
(KIconcentration/mo.lL-1)

469第4期　朱燕舞等:9-(3-氨基苯胺基)吖啶与核酸作用荧光光谱及其分析应用
3.6　离子强度的影响NaCl使m-APAA的荧光度下降。而当体系中存在DNA时,NaCl(浓度小于0.04mol/L时)使体系的荧光增强。当体系存在NaCl时,随钠离子浓度的增加,DNA磷酸骨架的静电斥力减小,使DNA链结构变紧[14],因而使m-APAA不易插入到DNA中,导至溶液中游离的m-APAA增多,从而使体系的荧光强度增强。所以过量的NaCl存在不利于m-APAA与DNA的结合反应。3.7　变性DNA与m-APAA作用变性DNA(将DNA在沸水浴中加热30min,用冰水冷却至室温)与m-APAA作用,λex=256nm,λem=418nm处的荧光峰强度没有变化,说明m-APAA与变性DNA基本上没有发生作用。3.8　干扰实验
测定10mg/LDNA(相对标准偏差≤5%),10倍
6-巯基嘌呤、5倍的常见金属离子不干扰测定。
3.9　线性范围、检测限及精密度
在实验确定的最佳条件下,测定了DNA的线
性范围。fs-DNA浓度在5-40mg/L范围内与
ΔF呈良好的线性关系。其回归方程为ΔF=
13.16+1.402C(mg/L),r=0.9971,检出限为
3.21mg/L(3σ/斜率,σ为平行测定10份空白液所
得的标准偏差)。ct-DNA浓度在5-50mg/L范
围内与ΔF呈良好的线性关系。其回归方程为
ΔF=-4.41+1.407C(mg/L),r=0.9976,检出限
为2.99mg/L。对浓度分别为20mg/Lfs-DNA和
20mg/Lct-DNA溶液进行10次测定,其相对标
准偏差分别为1.51%和1.43%。

参考文献:
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Chem.Commun,1987,22:1696-1697.
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Photobiol.A:Chem,1993,74,231-236.
[14]PasternackRF,BrigandiRA,AbramsMJ.Inorg.
Chem,1990,29,4483-4487.

Studyandapplicationsof9-(3-aminoanilino)acridine
withDNAfluorescencespectra

ZHUYan-wu
1,2,ZHOUYun-you1
(1.CollegeofChemistryandMaterialScience,AnhuiNormalUniversity,Wuhu　241000,China;
2.SchollofChemical,HefeiUniversityofTechnology,Hefei　230009,China)

Abstract:　Anewfluorescentreagent9-(3-aminoanilino)acridine(m-APAA)waspreparedandtheprod-
uctwaspurifiedbyseveraltimesbyrecrystallition.ItsconstitutionwasconfirmedbyIR,1HNMRandelemental
analysis.Thefluorescencespectraofm-APAAwithDeoxyribonucleicacid(DNA)wasstudied.Itwasshown
thatDNAhasabilitytoquenchthem-APAAfluorescencein418nm(λex=256nm),andthequenchedinten-
sityoffluorescenceisproportionaltotheconcentrationDNA.Thismethodhadtheadvantagesofhighsensitivity,
goodselectivityandsimplicity.

Keywords:　fluorescentreagent;9-(3-aminoanilino)acridine;Determination;DNA
(责任编辑　李　方)

470化学研究与应用 第17卷