荧光光谱的原理及应用
荧光光谱的原理与应用
荧光光谱的原理与应用一、简介荧光光谱是一种非常重要的光谱技术，用于研究物质的光谱特性。
和吸收光谱相比，荧光光谱具有很多优点，包括高灵敏度、高选择性和动态特性等。
本文将介绍荧光光谱的原理和应用。
二、荧光光谱的基本原理荧光光谱是物质在受激发后发射荧光的光谱。
荧光的产生涉及两个过程：激发和发射。
具体来说，当物质受到足够能量的激发后，其内部的电子会升级到激发态，并在短时间内返回到基态，释放出荧光。
这个过程伴随着光的吸收和发射。
荧光光谱图通常由激发光和发射光组成。
激发光是用于激发物质的光，而发射光是物质在激发后发射的荧光。
通过测量激发光和发射光的强度和波长，可以得到荧光光谱。
三、荧光光谱的应用1. 荧光光谱在生物学中的应用荧光光谱在生物学中有广泛的应用。
例如，它可以用来研究生物分子的结构和函数。
荧光标记是研究生物分子的常用方法之一，该方法利用荧光染料或荧光蛋白标记生物分子，通过测量荧光光谱来研究它们的相互作用、分子结构以及代谢路径等。
2. 荧光光谱在材料科学中的应用荧光光谱在材料科学中也有很多应用。
例如，它可以用于研究材料的光电特性。
通过测量材料激发和发射的荧光光谱，可以了解材料的能带结构、载流子动力学等信息，对材料的性能进行评估和优化。
3. 荧光光谱在环境监测中的应用荧光光谱在环境监测中也起到重要作用。
例如，它可以用于水质监测。
通过测量水样中的荧光光谱，可以判断水质的污染程度和有机物的种类。
同时，荧光光谱还可以用于检测空气中的有害气体，如VOCs、NOx等。
4. 荧光光谱在食品安全中的应用荧光光谱在食品安全领域也有广泛应用。
例如，它可以用于检测食品中的有害物质和污染物。
通过测量食品样品的荧光光谱，可以判断食品是否受到了污染，确保食品的安全性。
5. 荧光光谱在医学诊断中的应用荧光光谱在医学诊断中也有很多应用。
例如，它可以用于癌症的早期诊断。
通过测量病变组织或体液中的荧光光谱，可以鉴别正常组织和癌变组织之间的差异，帮助早期发现癌症。
荧光光谱的原理和应用
荧光光谱的原理和应用1. 荧光光谱的基本概念•荧光：荧光是指物质受到激发后，在短时间内吸收能量并发出较长波长的光。
•荧光光谱：荧光光谱是指在特定激发光源照射下，物质发出的荧光光在不同波长下的强度分布。
•荧光发射：当物质受到激发并返回基态时，通过辐射发出光的过程称为荧光发射。
2. 荧光光谱的原理2.1 荧光激发和发射•荧光激发：物质受到外界能量的激发，电子从基态上升到激发态。
•荧光发射：激发态电子回到基态的过程中，通过辐射发出光。
2.2 荧光激发与发射能级•电子能级：物质中的电子具有不同能量的电子能级。
•激发态：电子从基态跃迁到更高能级的状态称为激发态。
•发射态：电子从激发态回到基态的状态称为发射态。
2.3 荧光与分子结构•分子结构：不同分子结构对荧光发射的波长和强度有影响。
•良好的激发能量传递：分子结构中共轭体系的存在有助于良好的激发能量传递。
3. 荧光光谱的应用3.1 荧光光谱分析•分析特性：荧光光谱可以提供物质的结构信息、浓度、纯度和环境条件等分析特性。
•应用领域：荧光光谱分析广泛应用于环境监测、生物医学、食品安全等领域。
3.2 荧光探针和标记物•荧光探针：利用荧光探针可以对生物分子进行检测和定量分析。
•标记物应用：荧光标记物在生物学领域中的应用非常广泛，例如细胞成像、蛋白质定位研究等。
3.3 荧光荧光显微镜•荧光显微镜：利用荧光显微镜可以观察和研究生物样本中的荧光信号，无需对样本进行染色处理。
•应用领域：荧光显微镜被广泛应用于生物学、医学和材料科学领域。
3.4 荧光染料•荧光染料：具有良好荧光性能的化合物，可以用于荧光显微镜观察、荧光分析和药物研究等方面。
•应用领域：荧光染料广泛应用于细胞成像、分子探针、生物传感器等领域。
4. 总结荧光光谱是一种重要的光谱学技术，在科学研究和应用中具有广泛的应用前景。
通过荧光光谱可以获得物质的结构信息、浓度、纯度和环境条件等分析特性。
荧光光谱在环境监测、生物医学、食品安全等领域发挥着重要作用。
荧光光谱的原理与应用
分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 在每个电子能级上，都存在振动、转动能级；
激发： 基态(S0)→激发态(S1、S2激发态振动能级)：吸收
特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；
失活： 激发态 →基态：多种途径和方式(见能级图)；速
度最快、激发态寿命最短的途径占优势；
第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、T2 … ；
14
主要光谱参量
吸收谱反映出的是物质的基态能级与激发态能级之间所有的允许跃迁。 通常状态下的物质的表观颜色大部分时候取决于其吸收特性。
激发谱则反映的是基态与所有与该荧光发射有关的能级之间的跃迁。其所 呈现的关系比吸收谱要有选择性，但有时候又不如吸收谱来的直接。
电子跃迁到不同激发态能级
时，吸收不同波长的能量(如
发生了改变的跃迁是允许的；
跃迁过程中电子自旋发生了改变、跃迁前后电子的轨道在空间不 重叠或轨道的对映性未发生改变的跃迁是禁阻的。
9
失活的途径
电子处于激发态是不稳定状态，容易返回基态，在这个过程中通过
辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量，这个过程就称为失活。
失活途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光
磷光
系间窜越 内转换 外转换 振动弛豫
蒽在溶液中的吸收（虚线） 和发射（实线）光谱
斯托克位移
产生斯托克位移的主要原因：
1.跃迁到激发态高振动能级的激发态分子，首先以更快的速 率发生振动弛豫（其速率在1013/s数量级），散失部分能量， 达到零振动能级，一般从零振动能级发射荧光；
2.激发态形成后，其分子的构型将很快进一步调整，以达到 激发态的稳定构型，这又损失了部分能量；
荧光光谱的原理及应用
荧光探针也可用于药物筛选过程中，通过标记特定的靶点或 受体，观察药物与靶点或受体之间的相互作用。这种方法有 助于加速新药研发过程，提高药物筛选的效率和准确性。
荧光光谱在环境监测中的实际应用案例
荧光光谱在水质监测中的应用
荧光光谱技术可用于检测水体中的有机污染物，如农药、石油和工业废水等。通过分析水样中的荧光光谱，可以 确定污染物的种类和浓度，为环境保护和治理提供科学依据。
计算机
处理和显示测量数据，控制光 谱仪的操作。
荧光光谱的测量步骤
准备样品
选择适当的荧光物质 样品，并进行必要的 处理和纯化。
安装样品
将样品放入样品池中， 并确保激发光能够照 射到样品上。
调整仪器
根据实验需求，调整 激发光源、单色仪和 检测器的参数。
பைடு நூலகம்
进行测量
启动光谱仪，测量荧 光物质在不同波长下 的荧光强度。
热能等形式散失。
荧光光谱的形状可以反映荧光 物质的分子结构和环境因素，
如溶剂极性、温度等。
02
荧光光谱的测量技术
荧光光谱的测量方法
发射光谱法
通过测量荧光物质发射的光谱，确定荧光物 质的结构和组成。
吸收光谱法
通过测量荧光物质吸收的光谱，研究荧光物 质的能级结构和跃迁过程。
时间分辨光谱法
通过测量荧光物质在不同时间点的光谱，研 究荧光物质的动态过程和寿命。
荧光光谱法可用于研究聚合物的 荧光性质，如荧光量子产率、荧 光寿命等，有助于聚合物的性能 研究和质量控制。
在生物学研究中的应用
生物分子的荧光标记
荧光光谱法可用于标记生物分子，如蛋白质、核酸等， 以研究其结构和功能。
细胞成像
荧光光谱仪的原理及应用
T1 T2 外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
l1
l2
l 2
l3
5Байду номын сангаас
主 要 光 谱 参 数
吸收光谱：化合物的吸收光强与入射光波长的关系曲 线 激发光谱：让不同波长的激发光激发荧光物质使之发 生荧光，而让荧光通过固定波长的发射单色器照射到 检测器上，检测荧光强度变化。
发射光谱：固定激发波长(一般将其固定于激发波段 中感兴趣的峰位),扫描出的化合物的发射光强(荧光/ 磷光) 与发射光波长的关系曲线。
激发波 长确定
• 重复2、3步循环扫描得到理想的光谱图
关机
• 保存数据，先关软件，再关光源最后关风扇和电源
10
荧光寿命和量子产率的测试和数据处理
荧光寿命 • 根据发射谱和激发谱选择感兴趣的发射波长和激发波长， 测试荧光强度随时间的衰减曲线，同样需要数据进行校 正，然后应用origin软件进行作图和数据拟合得到寿命 结果
• 光电转化效率，即入射单色光子-电子转化效率 (monochromatic incident photon-to-electron conversion efficiency， 用缩写IPCE表示)，定义为单位时间内外电路中产生的电子数 Ne与单位时间内的入射单色光子数Np之比。 • 计算公式：IPCE(λ)=1240 * jp(λ)/Eλ(λ)
IPCE测试系统
Solar Cell Scan100 Crown tech.inc Newport 光源、单色仪、信号放大模 块、光强校准模块、计算机 控制和数据采集处理模块
通过用波长可调的单色光照射样 品，同时测量样品在不同波长的 单色光照射下产生的短路电流, 从而通过计算得到样品的IPCE
荧光光谱的原理及应用文库
荧光光谱的原理及应用文库1. 荧光光谱的基本概念荧光光谱是指物质受到激发后，发射出来的荧光光线的频率分布情况。
光谱仪通过测量荧光的频率分布，可以得到荧光光谱图，从而对物质的性质和结构进行研究。
2. 荧光光谱的原理荧光现象是物质受到能量激发后，电子从低能级跃迁到高能级，然后再从高能级跃迁回低能级，释放出准确的频率的光子。
荧光光谱仪利用荧光的这种特性，通过激发物质并测量发射的荧光光子的频率、强度等信息，可以了解样品的性质和结构。
3. 荧光光谱的测量过程荧光光谱的测量过程一般包括以下几个步骤：•准备样品：将待测样品制备成适当的溶液或薄膜，确保样品与光谱仪的测量条件相适应。
•激发样品：使用合适的光源对样品进行激发。
激发的光源通常需具备合适的激发波长和足够的光强。
•收集荧光信号：利用光谱仪收集激发样品后发出的荧光信号，通常是使用专用的光学系统将荧光光子收集到光谱仪中。
•记录光谱信息：根据收集到的荧光信号，光谱仪会自动生成荧光光谱图，并记录频率分布和强度等相关信息。
4. 荧光光谱的应用领域荧光光谱在各个领域都有着重要的应用，主要包括以下几个方面：4.1 生物科学荧光光谱在生物科学中的应用很广泛，包括荧光染料标记、蛋白质结构分析、酶动力学研究等。
例如，可以利用荧光标记的抗体来进行细胞中特定蛋白质的定位和定量研究。
同时，荧光光谱也可以用于检测细胞内的钙离子浓度、pH值等生物参数的变化。
4.2 材料科学荧光光谱在材料科学中的应用主要体现在材料的性质表征和分析方面。
通过测量材料的荧光光谱，可以了解材料的能带结构、禁带宽度、缺陷态等信息，进而指导材料的设计和改进。
4.3 环境监测荧光光谱可用于环境中有机物的监测和分析。
例如，在水环境中，可以通过测量水样品的荧光光谱，判断其中是否存在有机物的污染，并评估污染程度。
此外，荧光光谱还可应用于大气中气体污染物的监测和分析。
4.4 化学分析荧光光谱在化学分析领域中也有广泛的应用。
浅谈荧光光谱法在水质监测中的应用
浅谈荧光光谱法在水质监测中的应用荧光光谱法是一种常用的分析技术，它利用物质在受激发后发出的特征性荧光信号来研究其性质和组成。
在水质监测中，荧光光谱法具有许多优势，如高灵敏度、非破坏性、快速实时等。
本文将从荧光光谱法的原理、方法和应用角度，阐述其在水质监测领域的重要作用。
一、荧光光谱法的原理荧光是物质受到能量激发后，电子跃迁到高能级，再由高能级返回基态时所产生的特征性辐射。
荧光光谱法利用物质在受激励后发射的荧光光谱来分析物质的特性和组成。
其原理基于荧光信号的强度、发射波长和光谱形状等参数与样品的成分、浓度和环境有关。
二、荧光光谱法的方法荧光光谱法主要包括激发光源、样品处理、信号采集和数据处理等步骤。
激发光源可以是单色激光器或光栅光源，用于激发样品产生荧光信号。
样品处理可以通过调整pH值、添加荧光标记物等方式，增强荧光信号或选择性检测目标物质。
信号采集可以使用荧光光谱分析仪器进行，常见的有荧光光谱仪和荧光显微镜等。
数据处理则可以通过比较荧光光谱的峰值位置、强度差异等来分析样品。
三、荧光光谱法在水质监测中的应用1. 有机物污染监测有机物污染是影响水质的常见问题。
荧光光谱法可以对水体样品中的有机物进行快速、准确的检测。
例如，水质中的苯并芘类化合物是常见的有机污染物，其荧光光谱特征独特，可以通过荧光光谱法进行监测和定量分析。
2. 无机物质分析除了有机物，荧光光谱法还可以用于无机物质的分析。
例如，水体中的重金属离子是一种常见的污染物，可以通过添加荧光探针来选择性检测，并利用荧光光谱法进行监测和分析。
3. 水质监测指标分析荧光光谱法还可以应用于水质监测指标的分析。
例如，水体中的溶解有机质（DOM）是一个重要的指标，可以通过荧光光谱法分析其含量和组成，从而评估水体的有机质质量和来源。
4. 生物监测与生态评估荧光光谱法在生物监测和生态评估中也得到广泛应用。
例如，通过分析水体中藻类或细菌的荧光光谱特征，可以评估水华的存在和种群结构，进而判断水体富营养化程度和生态系统健康状况。
荧光光谱原理
荧光光谱原理荧光光谱原理荧光光谱是一种常见的分析方法，常用于化学、生物学、药学等领域。
下面，我们将详细介绍荧光光谱的原理及其应用。
一、荧光现象的基本原理荧光现象是指某些物质受到激发后，能够发出比激发光波长长的荧光。
这种现象的实现需要三个条件：激发光源，荧光物质及荧光检测系统。
其中，荧光物质是关键，只有某些物质具有这种特性。
二、荧光光谱图的基本构成荧光光谱图是用荧光物质受到特定波长的激发后，发出荧光的辐射能量与波长之间关系的曲线图。
其基本构成有以下四个参数：激发波长，发射波长，发射强度及荧光寿命。
激发波长：又称刺激波长，是激发荧光物质时所使用的波长。
发射波长：是荧光物质在受到激发后所发出的荧光辐射波长。
发射强度：是荧光物质发射的荧光辐射强度。
荧光寿命：是荧光物质在激发后发射荧光的时间长度。
三、荧光光谱的应用1. 化学分析：荧光光谱可以用于药物、生化试剂的分析，还可以用来探测污染物质和有毒化合物。
如气相色谱-荧光检测法(GC-FLD)检测环境中苯骈克星的浓度。
2. 生物医学：荧光光谱可以用于细胞成像、蛋白质分析、DNA测序、荧光定量PCR等领域。
如荧光定量多聚酶链式反应(qPCR)检测病毒RNA的表达水平。
3. 材料检测：荧光光谱可以用于材料表面缺陷的检测、矿物物质含量的分析等，如纳米粒子的荧光检测。
四、荧光光谱技术的优越性与传统的分析技术相比，荧光光谱技术具有很多优势，如高灵敏度、快速、准确性高、无需预处理、不易受样品污染等。
综上所述，荧光光谱技术在许多领域都有着广泛的应用前景。
相信在未来的发展中，荧光光谱技术将会更加成熟和完善，驱动着科技的进步和实践的发展。
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Michael G. Erickson, et al., DsRed as a Potential FRET Partner with CFP and GFP. Biophysical Journal , 2003,85:599–611
能量共振转移制备荧ຫໍສະໝຸດ 呼吸囊泡精品课件B) Schematic representation of the protonation and deprotonation of PEG-b-PDMA-Azo in the C) Steady-state fluorescence spectra of the vesicular solution at pH values between 4 and 12 D) Reversible pH-induced change in the fluorescence
能性小，荧光强） ④取代基效应（给电子基团，荧光增强；吸电子基团，荧光减弱甚至猝
灭）
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荧光强度与环境因素的关系
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有序介质的影响(表面活性剂)
CMC
精品课件
Intensity
1500000
1000000
500000
0 350
0.0001 0.0005 0.001 0.005 0.01 0.05 0.1 0.5 1 mg/ml
Alexander Sorkin, et al., Interaction of EGF receptor and Grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. Current Biology 2000, 10:1395–1398
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Thank you very much
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荧光光谱的原理及其在分 子自组装中的应用
郑永丽 上海交通大学化学化工学院
20131115
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主要内容
概述 荧光光谱法原理 荧光的光谱特性 我们有关荧光的工作
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概述
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基本概念 能级: 现代量子物理学认为原子的可能状态是不连续的，因 此各状态对应能量也是不连续的。这些能量值就是能级 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回
Intensity
图称为荧光的激发光谱。
图 荧光染料C-540A
250000
发射波长的：激发固和定发激射发光谱光的波长而不断改变荧光的测定波长
并记录相应的荧光强度，所得到的0 荧光强度对发射波长的谱
图则为荧光的发射波长。
400
500
600
700
Wavelength / nm
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基本概念
测试方法：
磷 光 模 块
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荧光寿命模块
图 荧光分光光度计的光学系统
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两亲性超支化聚合物分子自组装
HBPO-star-PEO
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荧光光谱法研究内容
聚合物CMC的测定 荧光猝灭法测量分子的分布 能量共振转移制备荧光呼吸囊泡 荧光偏振测量分子的流动性 荧光寿命研究体系微环境 发光聚合物荧光性能的测定
测试方法：
①时间相关单光子记数法(Time-Correlated Single-Photon Counting , TCSPC); ② 相调制法(Phase Modulation Methods) ③频闪技术(Strobe Techniques).
应用：
荧光寿命与物质所处微环境的极性、粘度等条件有关，因此 可以通过荧光寿命直接了解所研究体系发生的变化。
常用偏振研究的荧光分子：
1,6-二苯基-1,3,5-己三烯(DPH)；罗丹明B；2-苯胺基-6-萘 磺酸钠(2,6-ANS)
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荧光共振能量转移(FRET)
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基本概念
定义：
当一个荧光分子（又称为供体分子，Donor）的荧光光谱与 另一个荧光分子（又称为受体分子，Acceptor） 的激发光 谱相重叠时， 供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧 光， 同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减。
58
Rhodamine 101
100
Rhodamine 6G
95
Rhodamine B
31
Tryptophan
13
L-Tyrosine
14
精品课件
Conditions for Measurement
PBS PBS Methol 0.1M NaOH, 220C Cyclohexane 0.1 M H2SO4, 220C Ethanol Water
供体分子的发射态偶极矩与受体分 子的吸收态偶极矩、以及它们的向 量必须满足一定的条件
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应用
检测两个发光分子间的重合与共定位 检测分子间的相互作用 检测分子的折叠与构象变化
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供体-受体荧光分子对
染料类(Dye)
FITC-Rhodamine Alexa488-Cy3 Cy3-Cy5
精品课件
常用荧光探针
探针 1,8-ANS
Ex(nm) Em(nm)
372
480
Hydroxycoumarin 325
386
探针 Cy3 Hoechst 33342
Ex(nm) Em(nm)
550
570
343
483
Aminocoumarin
350
445 Ethidium Bromide 493
620
温度，溶剂，激发波长，浓度
应用：
量子产率取决于辐射和非辐射跃迁过程，即荧光发射、系 间跨越、外转移和内转移等的相对速率
精品课件
常用物质的量子产率
Q.Y. Standards
Q.Y. [%]
Cy3
4
Cy5
27
Cresyl Violet
53
Fluorescein
95
popop
97
Quinine sulfate
Elizabeth A J et l., FRET Imaging. Nature Biotechnology, 2003,21:13887-1395
Rajesh B S. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. J Cell Biology, 2003, 160: 629–633
到基态所发出的辐射。 磷光：从第一激发三重态的最低振动能级回到基态所发出的
辐射。 分子荧光光谱法(Molecular fluorescence spectroscopy )：
又称为荧光光谱法或荧光分析法．是以物质所发射的荧光强 度与浓度之间的线性关系为依据进行的定量分析，以荧光光 谱的形状和荧光峰对应的波长进行的定性分析．
Water Water, 200C
Water
Excitation [nm]
540 620 580 496 300 350 450 488
514 280 270
荧光偏振
精品课件
基本概念
定义： 测量：
①L-型或者单通道法 ②T-型多通道法
应用：
流动性,分子基本性质,酶学 分子相互作用,荧光偏振免疫,成像
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荧光寿命的计算
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荧光测试技术
同步荧光测定；导数荧光测定；三维荧光光谱技术 时间分辨荧光测定；相分辨荧光测定； 荧光偏振测定；荧光免疫测定； 低温荧光测定； 固体表面荧光测定； 近红外荧光分析法； 荧光反应速率法 荧光显微与成像技术；空间分辨荧光技术荧光探针技术；单
分子荧光检测技术； 荧光光纤化学传感器
400
450
Wavelength (nm)
荧光量子产率
精品课件
基本概念
定义：
荧光物质吸光后所发射的荧光的光子数与所吸收的激发光的 光子数之比值.(Y)
测试方法：
①参比法 Yu=YS·(Fu/Fs)·(As/Au ) ·(nu/ns)(A<0.05)； ②直接测量法，要求仪器有积分球
注意事项：
NBD
466
536 Fluo-3 (膜穿透性) 506
526
Fluorescein
495
519
DPH
362
432
Rhodamine B
570
590
EGFP
488
507
Alexa Fluro 350
343
442
Calcein
496
517
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我们有关荧光的工作
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荧光稳态模块
系统总图
显微荧光模块
1)判断激发波长：①根据分子结构判断；②参照吸收光谱； ③三维扫描
2)以判断的波长为激发，做发射扫描，可以得到发射波长 3)利用得到的发射波长，进行激发扫描，即可得到激发波长
强度：
比尔-朗伯定律 If=2.303YfI0εb c
应用：定性和定量
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荧光波长和强度与结构的关系
①跃迁类型（pi->pi*荧光比较强，即有双键的物质荧光强） ②共轭效应（共轭体系是pi电子更容易被激发，荧光强） ③刚性平面结构（有这种结构的分子可以减小分子的振动，碰撞失活可