叶绿素荧光原理与应用

主要与类囊体膜上和间质中的一些反应
过程包括碳代谢之间的相互作用有关。
测定与分析
荧光测定和猝灭分析需要几种不同的光源： 1. 检 测 光 （ 调 制 光 ） ― 绿 光 ： 光 强 PPFD 小 于 10μmol· m-2· s-1，用于测Fo。 2. 作用光― 通常用白光，用于推动光合作用的光 化学反应，光强可因实验目的不同而变化。 3. 饱 和 脉 冲 光 ― 通 常 用 白 光 ， 光 强 PPFD 大 于 3000μmol· m-2· s-1，确保QA全部还原，用于测Fm 和Fm'。 4. 弱远红光（或暗）―以便 PSI 推动 QA 氧化，测 Fo'前使用。
Fm’― 光下最大荧光，在光适应状态下全部 PSII 中心都关闭时的荧光强度， qp=0，qN≥O。Fm' 受非 光化学猝灭的影响，而不受光化学猝灭的影响。 Fo’― 光下最小荧光，在光适应状态下全部 PSII 中心都开放时的荧光强度，qp=1，qN≥0。为了使照 光后所有的 PSII 中心都迅速开放，一般在照光后和 测定前应用一束远红光（波长大于 680nm，使用的 波长735nm，几秒钟）。 Fv― 黑 暗 中 最 大 可 变 （ variable） 荧 光 强 度 ， Fv=Fm-Fo。 Fv’―光下最大可变荧光强度， Fv'=Fm'-Fo'。
叶绿素荧光诱导动力学
当一片经过充分暗适应的叶片从黑
暗中转入光下后，叶片的荧光产额 会随时间发生规律性的变化，即 kautsky效应，典型荧光诱导动力学 曲线上几个特征性的点分别被命名 为O、I、D、P、S、M和T
叶绿素荧光诱导动力学曲线
在照光的第一秒钟内，荧光水平从O上 升到P,这一段被称为快相； 在接下来的几分钟内，荧光水平从P下 降到T，这一段被称为慢相。 快相与 PSII 的原初过程有关，慢相则
调制荧光技术把作用光信号与荧光信号区分开， 在测定时，给植物材料施加一个脉冲调制光束， 该脉冲光使植物叶片产生一个脉冲的荧光信号， 当有自然光存在时，检测到由脉冲调制光束诱 导出的脉冲荧光信号。 脉冲荧光信号的大小可以反映出叶片生理状况 ，由脉冲调制光束诱导出的脉冲荧光信号作为 光系统II光能利用效率大小的探针。
的降低。只有当 qp=1 和Fv'/Fm'=0.83 时， L(PFD)=0，即不存
在限制。 使用Fv’/Fm’可以来估以下指标： 光化学反应相对份额 P=Fv'/Fm'×qp, 天线热耗散的相对份额D=1-Fv'/Fm'。
热耗散的速率为＝(1-Fv'/Fm')×PFD。
荧光猝灭参数
qp=(Fm'-Fs)/(Fm'-Fo')，光化学猝灭系数。这里 ， (Fm'-Fs) 代表光化学猝灭的荧光。 qp 是表示 PSII 开放的反应中心所占比例，而1-qp则是关闭的反应 中心所占比例，反映 QA 的还原程度，有时被称为 PSII的激发压。 氧化态的QA是PSII电子传递的原初醌受体，它 决定PSII的激发能捕获速率，所以光化学猝灭也被 称为Q猝灭。 qp 和 Fv/Fm、φPSII 之 间 有 如 下 关 系 ： Fv/Fm=φPSII/qp。
叶绿素荧光原理与应用
光合作用过程简介
光合膜上的蛋白复合体
光反应的电子传递 Z-scheme
叶绿素荧光的产生
叶绿素吸收光能的去向
光合机构吸收的光能有三个可能的去向： 一、光化学反应 , 引起反应中心的电荷分离及后来 的电子传递和光合磷酸化,形成用于固定、还原二氧化 碳的同化力(ATP和NADPH),氮素还原，光呼吸等。 二、转变成热散失； 三、以荧光的形式发射出来。 由于这三者之间存在此消彼长的相互竞争关系 , 所 以可以通过荧光的变化探测光合作用的变化(图1)。
表明PSII光化学效率的参数
Fv/Fm― 没有遭受环境胁迫并经过充分暗适应的植物 叶片PSII 最大的或潜在的量子效率指标，它是比较恒定 的，一般在0.80~0.85之间。有时，Fv/Fm也被称为开放 的PSII反应中心的能量捕捉效率。 Fv/Fo－ 是 Fv/Fm 的 另 一 种 表 达 方 式 ， Fv/Fo=(Fv/Fm)/(1-Fv/Fm)。Fv/Fo不是一个直接的效率指 标，但是它对效率的变化很敏感，一些处理引起的 Fv/Fo 变 化 的 幅 度 比 Fv/Fm 变 化 的 幅 度 大 得 多 ， 所 以 Fv/Fo在一些情况下是表达资料的好形式。 此 外 ， Fm/Fo 也 是 Fv/Fm 的 另 一 种 表 达 方 式 ， 因 为 Fm/Fo=(Fv+Fo)/Fo=Fv/Fo+1。
(Fm’-Fs)/Fm’―作用光存在时PSII的实际的 量子效率(φPSII)，即PSII反应中心电荷分离的 实际的量子效率。 Fs 是稳态荧光水平， Fm’ 是在作用光存在 时一个饱和光脉冲激发的荧光水平。计算这个 参数不需要准确测定Fo，不受Fo变化的影响。 PSII 实 际 的 电 子 传 递 的 量 子 效 率 这 个 参 数 [φPSII=(Fm’-Fs)/Fm’]不仅与碳同化有关，也与 光呼吸及依赖O2的电子流有关。
由于 φPSII 是 PSII 光化学反应的量子效率， 所以可以利用它计算非循环电子传递速率 （ETR）以及体内的总光合电子传递能力：
ETR=φPSII×PFDa×0.5 PFDa 是被吸收的光通量密度 ( 光合有效辐 射 μmol· m-2· s-1)，0.5 代表光能在两个光系统间 的分配系数。如果假设入射到叶片表面的光能 平均有84%被叶片吸收，并且平均分配给两个 光系统，则上式可以写成： ETR=φPSII×PFD×0.84×0.5。
实际上,以荧光形式发射出来的光能在数量 上是很少的,还不到吸收的总光能的3%。 在很弱的光下,光合机构吸收的光能大 约 97% 被用于光化学反应 ,2.5% 被转变成 热散失,0.5%被变成荧光发射出来； 在很强的光下，当全部 PSII 反应中心 关闭时，吸收的光能 95% － 97% 被变成热， 而2.5%－5.0%被变成荧光发射。
基本步骤
在植物对各种环境胁迫响应的分子机理研究中，
为了获得未遭受任何环境胁迫的对照叶片的基本荧光
参数，首先需要让对照叶片经过一个充分的暗适应过 程。 首先，给一个经过充分暗适应的叶片照射检测光 ，经过一小段时间（ 1~2min）荧光水平稳定后得到
荧光参数 Fo。接着，给一个饱和脉冲光，一个脉冲
后 关 闭 ， 得 到 荧 光 参 数 Fm， 于 是 得 到 荧 光 参 数 Fv/Fm(Fv=Fm-Fo)，即潜在的PS II的光化学效率
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叶片荧光的暗－光适应曲线
荧光猝灭
荧光猝灭就是荧光产额降低。一切使荧光 产额低于其最大值的过程，都被称为荧光猝灭 过程。对于不同荧光猝灭组分的分辨，能够提 供关于光合机构功能状态的重要资料。 荧光猝灭可分两类： 一、光化学猝灭，即由光化学反应引起的 荧光产额的降低，它有赖于氧化态QA的存在。 二、非光化学猝灭，即由非光化学过程， 例如热耗散过程引起的荧光产额的降低。它是 植物体内光合量子效率调节的一个重要方面。
调制式荧光仪的作用原理
调制光用于叶绿素荧光测定和猝灭分析是 荧光测定的一个革命性进展。在这样的系 统中，用于测定荧光的光源被调制，也就 是使用以很高频率不断开关的光源。在这 样的系统中，检测器选择性放大，仅仅检 测被调制光激发的荧光，就可以在田间条 件下，即在田间很强的太阳光存在的情况 下测定相对的荧光产额。
荧光参数
关于各种荧光参数的命名和定义，在不同 时期和不同作者的文章中很不一致。不同的资 料一定对应荧光动力学曲线理解。
2.1 基础参数
Fo― 有多种名称，最小（ minimal）、基底（ ground） 、 暗 （ dark）、 初 始 （ initial） 和 不 变 （ unchanged,constant）荧光强度等。它是已经暗适应的光合 机构全部 PSII 中心都开放时的荧光强度， qP=1，qN=0。 绝大部分学者都认为，Fo荧光来自天线叶绿素a Fi―荧光诱导动力学曲线O-I-D-F-T中I水平的荧光强度 Fp―荧光诱导动力学曲线O-I-D-P-T中P水平的荧光强度 Fs―荧光诱导动力学曲线O-I-D-P-T中T水平的荧光强度 Fm― 黑暗中最大（ maximum）荧光，它是已经暗适应 的光合机构全部 PSII 中心都关闭时的荧光强度， qP=0。 这时所有的非光化学过程都最小， qN=0，这是标准的最 大荧光。
qN=1-(Fm'-Fo')/(Fm-Fo)=1-Fv'/Fv。 实 际 上，qN是一个定量非光化学猝灭的旧术语， 它的计算以测定 Fo 和 Fo' 为前提，而 Fo 和 Fo' 的测定不准确会造成计算结果的偏差。 NPQ=(Fm-Fm')/Fm'=Fm/Fm'-1。 这 里 （ Fm-Fm'）代表非光化学猝灭的荧光。NPQ的 变化反映热耗散的变化。这个计算不需要测 定Fo和Fo'，但是必须测定一个充分暗适应叶 片的参比值Fm，最好是经过一个夜晚暗适应 的黎明时刻的Fm值，这时光化学效率最大， 而热耗散最小。
非光化学猝灭涉及三个不同的机理： qE—— 依赖类囊体膜内外的质子浓度差，暗弛豫的半时间 t1/2<1min，快相。 qT——依赖状态1向状态2的转换，PS II的捕光复合体磷酸化 ，脱离 PS II，从类囊体的基粒区迁移到间质片层区，从而减 少 激 发 能 向 PS II 的 分 配 ， 增 加 激 发 能 向 PS I 的 分 配 ， t1/2=8min，中间相。它比qE和qI小得多，强光下qE 和qI增加， 而qT受抑制。 qI—— 与光合作用的光抑制有关，可变荧光与最大荧光比值 的降低， t1/2=40min，慢相。关于这后一种非光化学猝灭，有 三种假说。假说一：这种非光化学荧光猝灭起源于 PS II 的反 应中心，部分 PS II 中心发生变化，虽然还能捕捉激发能，但 不能进行光化学反应，而把能量变成热。假说二：这种非光化 学荧光猝灭起源于 PS II 的天线色素，它通过非辐射能量耗散 消耗激发能，与叶黄素循环过程中生成的玉米黄素有关。假说 三：这种非光化学荧光猝灭与D1蛋白的失活和降解有关