荧光光谱原理
荧光光谱分析实验报告
一、实验目的1. 熟悉荧光光谱分析的基本原理和方法；2. 掌握荧光光谱仪的使用和操作；3. 通过实验，学会分析荧光光谱图，了解荧光物质的结构和性质；4. 培养实验操作技能和数据分析能力。
二、实验原理荧光光谱分析是利用荧光物质在特定波长激发光照射下，产生特定波长的荧光现象进行分析的一种方法。
荧光光谱分析的基本原理是：荧光物质分子吸收激发光能量后，从基态跃迁到激发态，随后以发射荧光的形式释放出能量，从而产生荧光。
荧光光谱分析主要包括激发光谱、发射光谱和荧光强度分析。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：荧光光谱仪、紫外可见分光光度计、荧光比色皿、样品池、光源、计算机等；2. 试剂：荧光物质标准溶液、溶剂、缓冲液等。
四、实验步骤1. 标准曲线的制作（1）取一系列已知浓度的荧光物质标准溶液，分别注入荧光比色皿中；（2）打开荧光光谱仪，设置激发光波长和扫描范围；（3）依次测量各溶液的荧光强度；（4）以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2. 未知样品的测定（1）取未知样品溶液，注入荧光比色皿中；（2）按照标准曲线的制作方法，测量未知样品的荧光强度；（3）根据标准曲线，计算未知样品的浓度。
3. 数据处理与分析（1）将实验数据输入计算机，进行数据处理；（2）分析荧光光谱图，了解荧光物质的结构和性质；（3）比较实验结果与理论值，验证实验方法的准确性。
五、实验结果与分析1. 标准曲线的制作通过实验，成功绘制了荧光物质的标准曲线。
标准曲线呈现良好的线性关系，相关系数R²接近1，说明实验方法准确可靠。
2. 未知样品的测定根据标准曲线，成功测定了未知样品的浓度。
实验结果与理论值基本一致，说明实验方法具有较高的准确度。
3. 数据处理与分析通过对荧光光谱图的分析，发现荧光物质具有明显的荧光峰，表明其结构中含有特定的官能团。
实验结果与文献报道相符，验证了实验方法的正确性。
六、讨论与心得1. 实验过程中，要注意控制实验条件，如激发光波长、扫描范围等，以保证实验结果的准确性；2. 荧光光谱分析具有灵敏度高、选择性好、快速简便等优点，在物质结构分析、定量测定等方面具有广泛的应用；3. 通过本次实验，掌握了荧光光谱分析的基本原理和操作方法，提高了自己的实验技能和数据分析能力。
原子发射光谱,荧光光谱,化学发光谱的区别
原子发射光谱、荧光光谱和化学发光光谱是分析化学中常见的光谱技术，它们在原子结构分析和元素检测等方面具有重要的应用价值。
然而，这三种光谱具有不同的原理和特点。
下面将分别介绍原子发射光谱、荧光光谱和化学发光光谱的区别。
一、原子发射光谱1. 原理：原子发射光谱是利用原子在能级跃迁时所发射的特征光谱线进行分析的一种技术。
当原子受到激发能量后，原子的电子会跃迁至较高的能级，而后再跃迁至较低的能级时会发射出特征波长的光谱线。
通过测量这些特征光谱线的强度和波长，可以确定样品中各种元素的含量和种类。
2. 应用：原子发射光谱广泛应用于金属材料分析、环境污染物检测、地质勘探等领域，尤其在工业生产中具有重要的应用价值。
3. 优势：原子发射光谱的灵敏度高、测定范围广，能够同时检测多种元素，具有较高的分析精度和准确度。
二、荧光光谱1. 原理：荧光光谱是利用物质在受到紫外光激发后，发射出荧光光谱进行分析的一种技术。
当样品受到紫外光激发后，部分分子会吸收能量并跃迁至激发态，随后分子会再跃迁至基态并发射出荧光光谱，通过测量荧光光谱的强度和波长，可以得到样品的成分和结构信息。
2. 应用：荧光光谱在生物医学、材料科学、环境监测等领域具有广泛的应用，尤其在生物分析和药物检测中得到广泛应用。
3. 优势：荧光光谱对于生物分子具有较高的灵敏度和选择性，能够实现实时、非破坏性的分析。
三、化学发光光谱1. 原理：化学发光光谱是利用化学反应产生的发光进行分析的一种技术。
当两种或多种试剂混合后，在化学反应的作用下产生的化学发光可以被测定，通过测量化学发光的强度和时间，可以获得样品的化学成分和反应动力学信息。
2. 应用：化学发光光谱广泛应用于医学诊断、食品安全检测、环境监测等领域，尤其在微量分析和实时检测方面具有重要意义。
3. 优势：化学发光光谱对于微量物质具有较高的检测灵敏度和快速响应性，适用于多种复杂样品的分析。
原子发射光谱、荧光光谱和化学发光光谱分别具有不同的原理和应用特点，它们在元素分析和化学反应动力学研究中发挥着重要的作用。
荧光光谱的原理
荧光光谱的原理
荧光光谱是一种分析物质性质的技术方法。
其原理基于物质在受到激发光照射后，原子或分子中的电子受激发而跃迁到较高的能级，然后从高能级返回到低能级时会发射特定波长的荧光光子。
具体来说，荧光光谱仪会先用某种激发源辐射样品，这个激发源的波长可以使得样品中的分子或原子处于激发态。
然后，光谱仪会通过收集样品发出的荧光光子来进行分析。
荧光光子会被光谱仪中的光学系统聚焦，并经过一系列的光学元件（如滤波片、光栅等）进行分光，最终被探测器接收并转换成电信号。
这些电信号会通过放大、滤波和转换等处理后输出为荧光光谱图。
荧光光谱的形状和峰位可以提供样品的信息，如有机物的结构、浓度和化学环境等。
荧光光谱在分析生物、医药、环境、材料等领域具有广泛的应用，例如用于分析药物的纯度、鉴定化合物的结构、追踪生物分子运动等。
需要注意的是，荧光光谱的分析结果还会受到样品本身的光学特性和实验条件的影响，因此在进行荧光光谱分析时需要严格控制实验条件，并与已知的标准样品进行比对以确保准确性。
拉曼光谱与荧光光谱的区别
拉曼光谱与荧光光谱的区别
拉曼光谱和荧光光谱是分析物质结构和性质的常用光谱技术，它们在原理、测量方法和应用等方面存在明显的区别：
1、原理：
拉曼光谱：拉曼光谱是由分子或晶体在受到激光束照射时，与光发生散射而引起的光谱现象。
当光与样品相互作用后，经过散射后的光子会发生能量的微小变化，这种能量变化称为拉曼散射，其频移与样品分子内部振动能级的差异有关。
荧光光谱：荧光光谱是由物质吸收光能量的激发态分子或原子的产生，随后转移到较低能级并释放出光子的光谱现象。
物质在受到光激发后，通过激发态与基态之间的能量交换过程，发生器件释放出光子，形成荧光光谱。
2、测量方法：
拉曼光谱：拉曼光谱测量使用激光束照射样品，然后检测散射光中的频移。
拉曼散射光有两个分量：斯托克斯散射（频移较小）和反斯托克斯散射（频移较大）。
通常使用拉曼散射光谱仪测量这两个分量，以获得样品的拉曼光谱信息。
荧光光谱：荧光光谱测量涉及样品吸收激发光能量后，检测其发出的荧光信号。
如激光激发或其他激发光源照射样品，荧光光谱仪会测量样品发出的荧光光谱，以分析其特征波长和强度。
3、应用：
拉曼光谱：拉曼光谱可用于分析样品的化学组成、结构和晶体品质等，
广泛应用于化学、材料科学、生物医学等领域。
荧光光谱：荧光光谱可用于分析样品的荧光性质、杂质检测、分子结构等，在生物学、药物研发、环境科学等领域具有广泛应用。
总的来说，拉曼光谱和荧光光谱在原理上存在差异，测量方法和应用领域也各不相同，但它们都是重要的光谱技术，能够为物质分析提供有价值的信息。
荧光光谱的原理及应用
30
2 荧光量子产率Φ
物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表示：
发射荧光的分子数 发射的光子数 Φ = 激发态的分子数 =吸收的光子数
Φ与失活过程的速率常数k有关：
kf k f k i k ec k ic
凡是使荧光速率常数 kf增大而使其他失活过程（系间窜越、外转
换、内转换）的速率常数减小的因素（环境因素和结构因素）都可使
②能够使荧光物质产生吸收并发射出荧光的激发光的波长并不具 有唯一性； ③在保证激发的前提下，不同激发波长处的荧光发射光谱相同， 但荧光强度不同。 ④在进行荧光测定时，须选择激发光波长以保证荧光强度最大。
25
镜像规则
荧光发射是光吸收的逆过程。荧光发射光谱与吸收光谱有类似镜 影的关系。但当激发态的构型与基态的构型相差很大时，荧光发射 光谱将明显不同于该化合物的吸收光谱。
19
光谱图
荧光发射光谱 荧光激发光谱 磷光光谱
200
260 320 380 440 500 560 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
620
20
二、主要光谱参量 吸收光谱
化合物的吸收光强度与入射光波长的关系曲线 。
激发光谱
固定发射波长(一般将其固定于发射波段中感兴趣的峰位)，扫描 出的化合物的发射光强度(荧光/磷光) 与入射光波长的关系曲线。
23 2
,l 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最
‘ 2
低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如l
)
斯托克位移 产生斯托克位移的主要原因：
1.跃迁到激发态高振动能级的激发态分子，首先以更快的速 率发生振动弛豫（其速率在1013/s数量级），散失部分能量，
荧光光谱原理
荧光光谱原理荧光光谱是一种分析化学技术，它利用物质在受到激发后发出的荧光来进行分析。
荧光光谱原理是基于分子或原子在吸收光能后发生跃迁，从而产生荧光的现象。
在荧光光谱中，我们可以通过测量样品在不同波长的激发光下发出的荧光强度来获取样品的信息，包括结构、浓度、纯度等。
荧光光谱原理的基本过程是，首先，样品受到激发光的照射，激发光的能量会被部分吸收并转化为激发态能量；接着，激发态的分子或原子会在极短的时间内发生非辐射跃迁，从而回到基态并释放出荧光光；最后，荧光光会被检测器接收并转化为电信号，然后进行信号放大、处理和分析。
荧光光谱原理的关键参数包括激发光源、激发波长、荧光检测器和荧光强度。
激发光源的选择应该考虑样品的特性和所需的激发波长，常见的激发光源包括氙灯、汞灯、激光等。
激发波长的选择应该根据样品的特性和所需的分析信息来确定，通常情况下，我们会选择使样品吸收最大的波长作为激发波长。
荧光检测器的选择应该考虑荧光强度的测量范围和灵敏度，常见的荧光检测器包括光电倍增管、光电二极管等。
荧光强度的测量可以通过调节荧光检测器的增益来实现，以确保信号在合适的范围内。
荧光光谱原理在分析化学中有着广泛的应用，例如荧光光谱可以用于药物分析、环境监测、生物标记、食品安全等领域。
在药物分析中，荧光光谱可以用于检测药物的含量和纯度，以及药物在体内的代谢过程。
在环境监测中，荧光光谱可以用于检测水体、大气和土壤中的污染物，如重金属离子、有机污染物等。
在生物标记中，荧光光谱可以用于追踪生物分子在细胞或组织中的分布和转运过程。
在食品安全中，荧光光谱可以用于检测食品中的添加剂、农药残留和食品质量等。
总之，荧光光谱原理是一种重要的分析化学技术，它通过测量物质在受到激发光后发出的荧光来获取样品的信息。
荧光光谱在药物分析、环境监测、生物标记、食品安全等领域有着广泛的应用前景。
随着科学技术的不断发展，相信荧光光谱原理将会在更多领域展现出其重要价值。
荧光光谱仪的原理及应用
T1 T2 外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
l1
l2
l 2
l3
5Байду номын сангаас
主 要 光 谱 参 数
吸收光谱：化合物的吸收光强与入射光波长的关系曲 线 激发光谱：让不同波长的激发光激发荧光物质使之发 生荧光，而让荧光通过固定波长的发射单色器照射到 检测器上，检测荧光强度变化。
发射光谱：固定激发波长(一般将其固定于激发波段 中感兴趣的峰位),扫描出的化合物的发射光强(荧光/ 磷光) 与发射光波长的关系曲线。
激发波 长确定
• 重复2、3步循环扫描得到理想的光谱图
关机
• 保存数据，先关软件，再关光源最后关风扇和电源
10
荧光寿命和量子产率的测试和数据处理
荧光寿命 • 根据发射谱和激发谱选择感兴趣的发射波长和激发波长， 测试荧光强度随时间的衰减曲线，同样需要数据进行校 正，然后应用origin软件进行作图和数据拟合得到寿命 结果
• 光电转化效率，即入射单色光子-电子转化效率 (monochromatic incident photon-to-electron conversion efficiency， 用缩写IPCE表示)，定义为单位时间内外电路中产生的电子数 Ne与单位时间内的入射单色光子数Np之比。 • 计算公式：IPCE(λ)=1240 * jp(λ)/Eλ(λ)
IPCE测试系统
Solar Cell Scan100 Crown tech.inc Newport 光源、单色仪、信号放大模 块、光强校准模块、计算机 控制和数据采集处理模块
通过用波长可调的单色光照射样 品，同时测量样品在不同波长的 单色光照射下产生的短路电流, 从而通过计算得到样品的IPCE
原子荧光光谱原理
原子荧光光谱原理
原子荧光光谱是一种通过激发原子内部电子跃迁产生的特定波长的荧光信号来研究原子结构和化学元素的方法。
其原理基于以下几个方面：
1. 原子激发：当原子处于基态时，其电子位于最低能级上。
当外界能量传递给原子时，电子可以被激发到较高的能级。
激发方式可以是光照、电子轰击或热激发等。
2. 电子跃迁：一旦电子被激发到较高能级，它会很快返回到较低的能级。
在这个过程中，电子通过发射光子来释放多余的能量。
这些光子的能量与原子内部能级差的大小相关。
3. 荧光发射：原子内部的能级结构是离散的，每个能级对应着特定的能量差和波长。
当电子跃迁到较低能级时，它会发射具有特定波长的光子。
这些特定波长的光子通过荧光发射被观测到。
4. 光谱分析：利用光谱仪等设备可以将荧光信号分解成不同波长的光谱。
通过测量光谱图案中的特定波长，可以确定原子的组成和结构。
原子荧光光谱在科学研究和分析领域具有广泛的应用，例如用于元素分析、材料表征和环境监测等。
通过分析荧光光谱能够推断出样品中的元素组成，并提供关于原子结构和化学性质的信息。
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M
L
S0
20040300
配体发光
XMUGXQ PFS03-01
N OH
弱发光
Mg2+
N O
Mg/2
强发光
20040300
MLCT Metal – ligand charge transfer
XMUGXQ PFS03-01
M* S1 T1
Rh Ru Os Ir Re 铑钌锇铱铼
Ru 邻菲啰呤等 引自“荧光分析法” 陈国珍等人编写。
20040300
问题：Demas 等人认为 - 二亚胺类配体易被 还原，与铂系元素形成的配合物应为MLCT.
3.2.1 铂系金属有机配体化合物
XMUGXQ PFS03-01
Rh
Ru
铑
钌
Os
Ir
Re
锇
铱
铼
Rhodium Rutheniuபைடு நூலகம் Osmium Iridium Rhenium
M* S1 T1
M S1 T1 *
MLCT
S1 T1 M *
LMCT
S0
S0
S0 S0
ML
ML
ML
L
M
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
20040300
3.2 Metal – ligand compounds
XMUGXQ PFS03-01
配体发光
M* S1 T1
1）配体发光
2）配合前后发光特性发生变化，最 低激发态发生转变, n,*向,*变化
COOR
荧光量子产率
D/P
R=
R=
20040300
NO N OAc
0.0082 57
0.47
抗磁性
R2OOC
R1=R2=
R1=R2=
20040300
XMUGXQ PFS03-01
COOR1
荧光量子产率 D/P
NO
0.011
60
N OAc
0. 66
抗磁性
XMUGXQ PFS03-01
F
NO + R
S0
L
M
20040300
Tb3+-Trion 发射光谱
XMUGXQ PFS03-01
LMCT 2) d* →d 或*→d发光 Ru, Rh, Ir等， 宽带光谱
Ru 联二吡啶、联三吡啶，邻菲啰呤 Os 联二吡啶、联三吡啶，4，6 双（甲硫基- 3 – 氨基-
嘧啶）等
Ir 联二吡啶、联三吡啶，邻菲啰呤
Coordination Chemistry Reviews, 198(2000), 231-250
20040300
XMUGXQ PFS03-01
3.2 Metal – ligand compounds
金属离子-有机配体化合物的发光特性与金属离子和有机 配体最低激发态的能级的相对高低有关
M* S1 T1
电子结构
XMUGXQ PFS03-01
以d6型金属离子和二亚胺（diimine) 配体为主进行讨论。
ML6 正八面体晶体场
分裂能的决定因素
e dz2,dx2-y2
分裂能
1）晶体场的强度
Crystal field strength of the ligand
能量简并
t2 dxy, dxz, dzy 2) 中心金属离子 Central metal ion
2*
*
1*
1
2
CH2=CH2—CH2=CH2—CH2=CH2 3*
2*
1*
1 2 3
20040300
电子激发态的类型——单线态与三线态
XMUGXQ PFS03-01
分子处于激发态时，单线态与三线态的势能曲线交叉，容易 发生系间窜跃（intra-system crossing )
S1
T1
hvA
hvF hvP
观测到萘的荧光
20040300
取代基的影响
XMUGXQ PFS03-01
要点：
1）取代基影响分子的荧光光谱特性，其影响的方式 及程度视取代基的不同而不同，有的影响不大，有的 影响严重。
2）一般规律，取代基的电子云如果能与共轭 键发 光基团作用，降低能量，增大 电子的离域区域， 则荧光增强，发射波长红移。
Fluorophores
3.1 Organic molecule fluorescence 3.2 metal –ligand compounds 3.3 Probe
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3.1 有机分子荧光
XMUGXQ PFS03-01
有机分子的电子结构
S和P轨道→、和n 轨道
可能产生的吸收跃迁组合为
酚盐吸收性质
化合物
HO O
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XMUGXQ PFS03-01
介质（ 2%甲醇）
max max
203.5 7400 254 204
210.5 6200 270 1450
235 9400 287 2600
➢吸电子取代基
O O N+
XMUGXQ PFS03-01
n 电子不与 电子共轭
要点 1） 有利于电子离域的，则荧光增强。 因此，一般 邻位、对位给电子基团导致荧光增强。
2）有利于形成环，导致分子刚性增大O，荧光增强。
COOH OH
荧光强度较强
CH O H
O
COOH
COOH
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OH
HO 荧光强度较弱
3）双取代基
XMUGXQ PFS03-01
可以是协同作用，也可以是非协同作用，当为非协同作 用时，以作用大的为主。
S0 ML
N N
N
Ru2+ N
2Cl-
N N
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弱发光或不发光
M* S1 T1
XMUGXQ PFS03-01
M→M*通常很弱
S0 ML
20040300
XMUGXQ PFS03-01
金属离子发光 LMCT ligand-metal charge transfer
S1 T1 M*
1) f*f 跃迁， Eu, Td, 锐线光谱
XMUGXQ PFS03-01
20040300
例5 荧光衍生化
XMUGXQ PFS03-01
VB1 [O] 硫胺荧
CH3
N
N
(Z)
H3C
S N NH2HCl
硫胺素，VB1， 非荧光
C2H5OH
CH3
20040300
N
H3C
N
N
(Z)
C2H5OH
N (E) S
硫胺荧，强荧光
例6 联萘与北
XMUGXQ PFS03-01
H CC
(E)
H
反式，发光
20040300
XMUGXQ PFS03-01
C(Z) C
H
H
顺式， 不发光
刚性平面结构 例1 荧光素与酚酞
XMUGXQ PFS03-01
20040300
F0.92
例2 笏与联苯
F 1 例 3 偶氮苯与杂氮菲
XMUGXQ PFS03-01
F 0.2
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例4 金属配合物
能量分裂
20040300
配体
20040300
关注 轨道
e
2* t26,1*1 1* t25,1*1
t25, e1
t26
12
XMUGXQ PFS03-01
→*
1,3 MLCT
d→*
1d→d* 3dd*
轨道能级
O
O
C
C
O
羰基类
1）n* 跃迁禁阻，小，10-2
2）最低单重态为 n,* 型，易于ISC。荧光弱，磷 光强
O
OH
非荧光
强荧光
20040300
O
OH
➢吸电子取代基
XMUGXQ PFS03-01
硝基 引起ISC增大，荧光量子产率降低，磷光 也弱，主要是增强IC过程。
20040300
➢取代基的位置
XMUGXQ PFS03-01
N OH
N H OH
含羰基有机物
XMUGXQ PFS03-01
芳香类 S1与T1能级间隙小， ISC效率高，接近于1。
ISC
0.99 1.00 1.01 0.84 0.93 0.87 0.87
脂肪类 有微弱的荧光，ISC效率低一些
20040300
抗磁性
XMUGXQ PFS03-01
Diamagnetic / paramagnetic
F
N OR
弱荧光 猝灭机理
1）IC 加剧 2）ISC加剧 3）能量转移 4）电荷转移
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强荧光
N. V. Blough and D. J. Simpson, “ Chemical mediated fluorescnece yield switching in nitroxidefluorophore adducts: optical sensors of radical / redox reactions”, J. Am. Chem. Soc, 1988, 110, 19151917
➢n,* 1) 含有杂原子（N,O,S）的有机化合物多属于这一
类，含有n 电子，其特点是自旋禁阻 ， 小，102,
ISC速率大，荧光弱。
2) n 轨道的能量受环境的影响大，如质子化或生成 氢键等，将使n 轨道的能量降低，导致n*跃迁的 能量增大。荧光分子的最低激发态可能变成,*。