猪瘟病毒衣壳蛋白核仁定位信号鉴定
猪流行性腹泻病毒N蛋白核仁定位信号对宿主细胞周期的影响
猪流行性腹泻病毒N蛋白核仁定位信号对宿主细胞周期的影响刘随新;石达;陈建飞;张鑫;时洪艳;刘孝珍;张莎;王璐;冯力【摘要】为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)核衣壳蛋白(N)与宿主细胞相互作用,本研究根据前期已经鉴定的PEDVN蛋白核仁定位信号序列,利用重叠延伸PCR (SOE-PCR)方法扩增出核仁定位信号序列缺失的PEDVN基因(dN),并将其与真核表达载体pAc-GFP-Cl连接,构建重组质粒pAc-GFP-dN.将pAc-GFP-dN转染于Vero E6细胞中,利用激光共聚焦显微镜分析重组质粒pAc-GFP-dN表达蛋白的定位情况,并利用流式细胞仪检测转染细胞的周期变化.实验结果表明:与完整的N蛋白相比,缺失核仁定位信号的N蛋白不能定位于细胞核仁,同时丧失了使宿主细胞周期在G2/M期停滞的能力,从而揭示了N蛋白核仁定位信号对宿主细胞具有重要的影响.%To study the interaction between porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) N protein and the host cell, the PEDV N gene was amplified with the deletion of nucleoli localization signal sequence by SOE-PCR and cloned into eukaryotic expression vector pAc-GFP-C1 to construct the recombinant plasmid pAc-GFP-dN. Vero E6 cells were transfected with the pAc-GFP-dN and the subcellular localization of the expressed dN protein was analyzed by confocal microscopy. The effect on cell cycle of the transfected cell was detected by flow cytometry. The results showed that the dN protein was unable to localize in the nucleus compared to the N protein as expected; However, the dN was also unable to induce the arresting on cell cycle G2/M caused by N protein. These results revealedthat the nucleoli localization signal in N protein has an important function to host cell.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2013(035)003【总页数】4页(P173-176)【关键词】猪流行性腹泻病毒;核衣壳蛋白;核仁定位信号;流式细胞术;宿主细胞周期【作者】刘随新;石达;陈建飞;张鑫;时洪艳;刘孝珍;张莎;王璐;冯力【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;东北农业大学,黑龙江哈尔滨150030;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;东北农业大学,黑龙江哈尔滨150030;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨150001【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪流行性腹泻（Porcine epidem ic diarrhea，PED）是由PED病毒（PEDV）引起的一种急性高度接触性肠道传染病，以肠炎为主要特征，对仔猪致死率高达90%[1]，给养猪业造成了严重的经济损失。
猪瘟病毒E2蛋白部分抗原区基因在原核系统的分泌表达与鉴定
Ｚｈ ｕ Ｓ ｕ ， ＬｉＪ ｎ ， 、 ｎ Ｊａ ｘ ｎ ｏ ｈ ｎ１ ｕ ２ № ｉｎ ｉ
（．ｉ ｄ ｏ Ａ ｒ ｕｔｒｌＵ ｉ ｒｔ， ｉｇ ａ ６ １９ Ｃ ｉ ；． ｓｔｔ ｏ ｎｍａ Ｓ ｉ ｃ ｎ ｅ ｒ ａ ｄ ｉ ， １ ｎ ａ ｇｉ ｌ ａ ｎ ｅｓｙ Ｑ ｎ ｄｏ ２６ ０ ， ｈ ａ ２ ｎｔｕｅ ｆＡ ｉ ｌ ｃ ｎｅ ａ ｄ Ｖ ｔ ｉ ｒ Ｍｅｉ ｎ Ｑ ｇ ｃ ｕ ｖ ｉ ｎ Ｉ ｉ ｅ ｅｎ ｙ ｃｅ
摘 要 ： 于猪瘟病毒主要保护性抗原 Ｅ 基 ２囊膜 糖蛋 白有 两个相对独立 的抗原 结构 单位 ＢＣ抗原 区和 Ａ Ｄ抗原 ／ ／ 区， 根据 Ｇ ｎ Ｂ ｎ ｅｅ ａｋ中猪瘟 病毒 Ｂ Ｃ基 因核苷酸序 列设 计合成一对 引物 ， Ｒ ．Ｃ ／ 经 ＴＰ Ｒ扩增猪瘟 病毒 ＢＣ基 因。 ／ 将扩增 所得 猪瘟 病毒 ＢＣ基 因克隆 于 Ｐ ／ ＭＤ１． ８Ｔ载体 ， 然后定 向亚克隆猪瘟 病毒 ＢＣ基 因至原核 表达载体 Ｐ Ｔ ０ａ的 多 ／ Ｅ ３ （） 克 隆位点 中， 经酶切鉴定后 ， 将含有 ＢＣ基 因的重组质 粒命名为 Ｐ ＴＢＣ ／ Ｅ ／。用 Ｐ Ｔ ＢＣ转化 受体 菌 Ｂ ２， Ｅ ／ Ｌ １挑取单 个 茵落， 用诱导剂 Ｉ ｒ ｇ Ｇ以不 同浓度进行诱导 ， 并在 不 同诱 导时间收集样 品。 Ｓ ＳＰ ＧＥ电泳分析证 实 ＢＣ基 因获得 经 Ｄ ．Ａ ／ 了表达 ， 并在终浓度为 ｌ 的 ＩＴ 诱导 ６ ｍＭ Ｉ Ｇ， ， ｈ其表 达达到 高峰 ， Ｗｅｔ ｎｂｏ分析证 实表 达的重组 ＢＣ蛋 白具有 经 ｓ ｒ．ｌ ｅ ｔ ／ 反应活性 ， 大小约为 ９ Ｄ。 Ｋ 用表 达产物作 Ｅ ＩＡ， ＬＳ 结果表 明表 达产物与猪瘟病毒抗血清可发生 明显的反应 ， 而与其 它 ８ 种疫 病阳性血 清不发生反应 。 常茵体蛋 白与猪 瘟病毒 阳性血 清也 不发 生反 应。 正 通过对 ５ 份送检 血清样 品的检 测 ８ 结果显示其与 Ｄ ｔＥ ＩＡ 的相符率 高达 ９ ％以上。 ｏ－ ＬＳ ５ 试验证 明利用原核 表达 系统制备 的重组蛋 白作为诊 断用抗原 ， 为 研究亚单位疫苗或诊 断抗原打下坚实基础 。 关键词： 瘟病毒 ； ／ 猪 Ｂ Ｃ抗原 区； 达 表 中图分类号：８ ２ ６ １ Ｓ ５ ．５ 文献标识码 ： 文章编号：０ ５ ９４ ２ １ ）８ ０ ２ — ４ Ａ １０ — ４ Ｘ（０ ０ ０ — ０ ４ ０
猪瘟病毒衣壳蛋白的细胞核定位研究
ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｓ ｉ ｎ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ
Ｌ Ｉ Ｕ Ｎｉ ｎ ｇ ，Ｓ ＨＩ Ｈｏ ｎ ｇ － ｙ ａ ｎ ， ＣＨＥ Ｎ Ｊ ｉ ａ ｎ － ｆ ｅ ｉ 。 ， Ｆ ｅ ｎ ｇ Ｌｉ ， Ｚ ＨＡＮＧ Ｘｉ ｎ ２ ， ＨＵ Ｇｕ ｉ — ｘ ｕ ｅ
第３ ６卷 第 １ 期
２ ０ １ ４ 年 １ 月
中 国 预
防 兽
医 学 报
Ｖｅ １ ． ３ ６． ＮＯ ． １ Ｊ ａ ｎ ． ２ ０ １ ４
Ｃｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｊ ｏ ｕ ｎａ ｒ ｌ ｏ ｆ Ｐ ｒ ｅ ｖ ｅ ｎ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ
ｃ ｙ ｔ ｏ ｐ ｌ ａ ｓ ｍ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ， ｓ ｕ ｇ ｇ ｅ ｓ ｔ ｉ ｎ ｇ ＣＳ Ｆ Ｖ ｃ ａ ｐ ｓ ｉ ｄ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｈ ａ ｄ ｈｅ ｔ ａ ｂ ｉ ｌ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｌ ｏ ｃ ａ ｌ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｏ ｌ ｕ ｓ ， ｗｈ ｉ ｃ ｈ ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｄ ｅ ｄ ｔ ｈ ｅ
Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ａ ｃ ａ ｄ ｅ ｍｙ ｏ ｆ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ， Ｈａ ｒ ｂ ｉ ｎ １ ５ ０ ０ ０ １ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
抗非洲猪瘟病毒NP419L蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用
畜牧兽医学报 2023,54(6):2509-2520A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.06.029开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):抗非洲猪瘟病毒N P 419L 蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用王 映,朱家宏,赵加凯,纪品品,陈 旭,张 路,刘宝元,孙亚妮*,赵 钦*(西北农林科技大学动物医学院,农业农村部国家动物疫病数据中心杨凌观测实验点,杨凌712100)摘 要:非洲猪瘟(A f r i c a n s w i n e f e v e r ,A S F )是猪的一种高度传染性疾病,严重威胁全球养猪业的发展㊂本研究旨在筛选抗非洲猪瘟病毒(A S F v i r u s ,A S F V )N P 419L 蛋白的纳米抗体并对其在A S F 抗体检测中的应用进行初步评价㊂大肠杆菌表达和N i -N T A 亲和层析纯化等技术表达纯化重组N P 419L 蛋白;将纯化的重组蛋白免疫双峰驼,5次免疫采集外周血淋巴细胞提取总R N A ,经反转录㊁巢式P C R ㊁酶切㊁连接和电转化等构建抗N P 419L 蛋白的噬菌体展示文库;利用噬菌体展示筛淘技术,经三轮筛淘获得抗N P 419L 蛋白的纳米抗体;构建纳米抗体与辣根过氧化物酶(H R P )融合蛋白的真核表达载体,转染H E K 293T 细胞,E L I S A 和间接免疫荧光(I F A )等鉴定融合蛋白的分泌表达及其与N P 419L 蛋白的结合;竞争E L I S A 初步评价获得的纳米抗体与H R P 融合蛋白在A S F 抗体检测中的应用㊂结果显示,成功制备了纯度较高的预期大小为48k u 的重组N P 419L 蛋白;构建获得了阳性率为89.5%,库容量为6ˑ108的噬菌体展示文库;筛淘获得了6株抗N P 419L 蛋白的纳米抗体;分泌表达了该6株纳米抗体与H R P 的融合蛋白,E L I S A 检测发现该6株融合蛋白可特异性结合重组N P 419L 蛋白,I F A 检测发现1株融合蛋白与真核表达的N P 419L 蛋白结合,该融合蛋白可作为探针应用于A S F 抗体的检测㊂本研究成功筛选出6株抗A S F V N P 419L 蛋白的特异性纳米抗体,并对其进行了结合蛋白特性的鉴定和抗体检测初步应用的评价,为后续A S F 诊断技术的研发和N P 419L 蛋白功能研究奠定了基础㊂关键词:非洲猪瘟病毒;N P 419L 蛋白;纳米抗体中图分类号:S 852.659.1 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)06-2509-12收稿日期:2022-11-04基金项目:国家自然科学基金面上项目(32273041);中央级公益性科研院所基本科研业务费院级统筹项目作者简介:王 映(1996-),女,山东烟台人,硕士生,主要从事动物疫病诊断和防治技术研究,E -m a i l :1076396765@q q.c o m *通信作者:孙亚妮,主要从事重大动物疫病病原感染和致病机制研究,E -m a i l :s u n ya n i @n w s u a f .e d u .c n ;赵 钦,主要从事动物重大疫病㊁分子病毒与细胞免疫生物学研究,E -m a i l :qi n z h a o _2004@n w s u a f .e d u .c n S c r e e n i n g a n d I d e n t i f i c a t i o n o f N a n o b o d i e s a ga i n s t N P 419L P r o t e i n o f A f r i c a n S w i n e F e v e r V i r u s a n d I t s P r e l i m i n a r y A p p l i c a t i o n o f A n t ib o d y De t e c t i o n WA N G Y i n g ,Z HU J i a h o n g ,Z H A O J i a k a i ,J I P i n p i n ,C H E N X u ,Z H A N G L u ,L I U B a o yu a n ,S U N Y a n i *,Z H A O Q i n*(Y a n g l i n g O b s e r v i n g a n d E x p e r i m e n t a l S t a t i o n o f N a t i o n a l D a t a C e n t e r o f An i m a l H e a l t h ,C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y ,Y a n g l i n g 712100,C h i n a )A b s t r a c t :A f r i c a n s w i n e f e v e r (A S F )i s a h i g h l y i n f e c t i o u s d i s e a s e o f p i g s ,w h i c h s e r i o u s l y t h r e a t -e n s t h e d e v e l o p m e n t o f t h e g l o b a l p i g i n d u s t r y .T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y i s t o s c r e e n s p e c i f i c n a n o b o d i e s a g a i n s t t h e N P 419L p r o t e i n o f A S F v i r u s (A S F V )a n d e v a l u a t e i t s a p pl i c a t i o n o f a n t i -A S F V a n t i b o d y d e t e c t i o n .W e p r e p a r e d t h e r e c o m b i n a n t N P 419L p r o t e i n b y E .c o l i e x pr e s s i o n s y s t e m a n d N i -N T A a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y pu r i f i c a t i o n .T h e p u r i f i e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n w a s u s e d t o i mm u n i z e t h e B a c t r i a n c a m e l s .A f t e r t h e f i f t h i mm u n i z a t i o n ,p e r i p h e r a l b l o o d l y m ph o -畜牧兽医学报54卷c y t e s w e r e c o l l e c t e d a n d t o t a l R N A w a s e x t r a c t e d.A p h a g e d i s p l a y l i b r a r y a g a i n s t N P419L p r o-t e i n w a s c o n s t r u c t e d b y n e s t e d P C R,e n z y m e d i g e s t i o n,l i g a t i o n a n d e l e c t r o p o r a t i o n.N a n o b o d i e s a g a i n s t N P419L w e r e o b t a i n e d t h r o u g h t h r e e r o u n d s o f s c r e e n i n g u s i n g p h a g e d i s p l a y s c r e e n i n g t e c h n o l o g y.T h e e u k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r s o f n a n o b o d i e s f u s e d w i t h h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e (H R P)p r o t e i n s w e r e c o n s t r u c t e d a n d t r a n s f e c t e d i n t o H E K293T c e l l s.T h e s e c r e t o r y e x p r e s s i o n o f t h e f u s i o n p r o t e i n a n d i t s b i n d i n g t o N P419L p r o t e i n w e r e i d e n t i f i e d b y E L I S A a n d i n d i r e c t i m-m u n o f l u o r e s c e n c e(I F A),a n d p r e l i m i n a r y e v a l u a t i o n o f t h e o b t a i n e d n a n o b o d y f u s e d w i t h H R P p r o t e i n s i n A S F d e t e c t i o n u s i n g c o m p e t i t i v e E L I S A.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e N P419L r e c o m-b i n a n t p r o t e i n w i t h t h e e x p e c t e d s i z e o f48k u w a s s u c c e s s f u l l y p r e p a r e d w i t h h i g h p u r i t y;a p h a g e d i s p l a y l i b r a r y w i t h a p o s i t i v e r a t e o f89.5%a n d a l i b r a r y c a p a c i t y o f6ˑ108w a s c o n s t r u c t e d;s i x s t r a i n s o f a n t i-N P419L p r o t e i n n a n o b o d i e s w e r e o b t a i n e d b y s c r e e n i n g;t h e f u s i o n p r o t e i n s o f t h e s e s i x n a n o b o d i e s w i t h H R P w e r e s e c r e t i v e l y e x p r e s s e d,t h e r e s u l t s o f E L I S A s h o w e d t h a t t h e s i x f u s i o n p r o t e i n s s p e c i f i c a l l y b i n d t o t h e r e c o m b i n a n t N P419L p r o t e i n,o n e f u s i o n p r o t e i n w a s f o u n d t o b i n d t o N P419L p r o t e i n e x p r e s s e d w i t h e u k a r y o t i c s y s t e m b y I F A,a n d t h i s f u s i o n p r o-t e i n c a n b e u s e d a s a p r o b e f o r t h e d e t e c t i o n o f A S F V a n t i b o d i e s.I n t h e s t u d y,s i x n a n o b o d i e s a-g a i n s t A S F V N P419L p r o t e i n w e r e s u c c e s s f u l l y s c r e e n e d.T h e p r e l i m i n a r y c h a r a c t e r i z a t i o n o f i t s b i n d i n g p r o t e i n a n d i t s a p p l i c a t i o n o f a n t i b o d y d e t e c t i o n w e r e a l s o c a r r i e d o u t,w h i c h p r o v i d e d t h e b a s i s f o r t h e s u b s e q u e n t d e v e l o p m e n t o f A S F d i a g n o s t i c t e c h n o l o g y a n d t h e f u n c t i o n a l s t u d y o f N P419L p r o t e i n.K e y w o r d s:A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s;N P419L p r o t e i n;n a n o b o d y*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r s:S U N Y a n i,E-m a i l:s u n y a n i@n w s u a f.e d u.c n;Z H A O Q i n,E-m a i l: q i n z h a o_2004@n w s u a f.e d u.c n非洲猪瘟(A f r i c a n s w i n e f e v e r,A S F)是由非洲猪瘟病毒(A f r i c a n s w i n e f e v e r v i r u s,A S F V)感染家猪和野猪引起的一种急性㊁出血性㊁高度接触性传染病,被世界动物卫生组织(WO A H)列为必须报告的动物疫病[1]㊂家猪感染A S F V强毒株可引起严重的出血性疾病,致死率高达100%[2]㊂2018年, A S F传入我国并迅速扩散[3],给我国的养猪业造成了巨大的经济损失㊂由于A S F V基因类型多,免疫逃避机制复杂多样,目前还没有开发出针对该病毒的疫苗和有效的防治药物,只能依靠隔离和扑杀等严格的生物安全防控方式来控制疫情[4]㊂A S F V属于非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属,是一种大型双链D N A病毒,病毒基因组为170~ 190k b,可编码150多种蛋白质,包括多种结构蛋白及参与D N A复制和修复的各种酶等[5-6]㊂迄今为止,仅有60多种病毒蛋白的生物学功能被报道,严重阻碍该病疫苗和防治药物的研发㊂A S F V主要感染猪巨噬细胞,这些细胞具有氧化性并对病毒基因组造成持续损害[7]㊂在众多参与病毒复制和修复的酶中,有一类酶可修复宿主因子对A S F V基因组的损伤[8],统称为碱基切除修复系统(b a s e-e x c i s i o n r e p a i r,B E R),包括A P核酸内切酶(A S F V A P)[9-10]㊁D N A修复聚合酶(A S F V P o l X)[11]和D N A连接酶(A S F V L I G)[12]㊂其中,A S F V L I G (N P419L)是修复系统中唯一的D N A连接酶,它在A S F V的D N A修复过程中催化D N A加入反应,将D N A链上的缺口连接起来,并在病毒基因组的诱变中起重要作用[13]㊂有研究认为抑制其活性可能会破坏A S F V的D N A修复过程并损害基因组稳定性[13],因此深入研究N P419L蛋白的功能有助于了解A S F V复制的机制㊂此外,目前多数使用p30㊁p72㊁p54和p p62等A S F V的结构蛋白作为靶抗原检测A S F的抗体[14-15],而N P419L蛋白能否做为抗体检测的靶抗原仍未见相关报道㊂因此,为了能够深入研究N P419L蛋白的生物学功能和免疫学特性,需要制备抗该蛋白的抗体㊂骆驼科动物体内存在一种特殊的抗体,天然缺失轻链和重链第一恒定区,被称为重链抗体(h e a v y c h a i n a n t i b o d i e s,H c A b s)[16]㊂与传统抗体不同, H c A b仅通过重链可变区(v a r i a b l e d o m a i n s o f01526期王映等:抗非洲猪瘟病毒N P419L蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用h e a v y c h a i n o f H c A b,V HH)识别抗原㊂V HH分子量仅有15k u左右,是目前已知最小完整的功能抗原结合片段,被称为纳米抗体(n a n o b o d y, N b)[17]㊂与传统抗体相比,纳米抗体具有分子量小㊁稳定性高㊁免疫原性低㊁特异性强等优点,在病毒性疾病的诊断和治疗方面有广阔的开发前景[18]㊂目前纳米抗体已被广泛的应用于人和动物重大疫病创新型诊断试剂和防治药物的研发中,例如新型冠状病毒肺炎[19]㊁中东呼吸综合征[20]㊁口蹄疫[21]和高致病性禽流感[22-23]等㊂抗A S F V的p30和p54等蛋白的纳米抗体也已有应用于A S F抗体检测中的报道,并表现出了较高的敏感性和特异性[24-25]㊂此外,该两个蛋白纳米抗体的制备也为A S F V感染和复制机制的研究提供了有效的材料支撑㊂为了能够筛选制备抗A S F V N P419L蛋白的纳米抗体,本研究利用原核表达系统表达纯化了该蛋白,免疫双峰驼并采集外周血淋巴细胞,通过噬菌体展示技术筛选获得了6株抗N P419L蛋白的纳米抗体,构建并表达了纳米抗体与辣根过氧化物酶(h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e,H R P)融合蛋白,并对其进行了初步的鉴定和抗体检测应用的评价㊂本研究为后续A S F V N P419L蛋白功能的深入研究以及基于纳米抗体的A S F诊断技术的研发提供了一种新的策略㊂1材料与方法1.1材料1.1.1质粒㊁菌株和细胞原核表达载体p E T-28a(+)㊁噬菌体展示载体p M E C S和真核表达载体p C A G E N等商品化载体均为本实验室购买并保存;真核表达载体p C M V-N1-H R P以商品化p E G F P-N1载体为骨架进行基因改造[26],该载体引入了分泌信号肽㊁HA㊁H R P和H i s标签;大肠杆菌感受态细胞T r a n s5α和B L21(D E3)购自北京全式金生物技术公司;E.c o l i T G1感受态细胞购自B e y o t i m e公司;辅助噬菌体M13K O7购自N E B公司;H E K293 T细胞为本实验室保存㊂1.1.2主要试剂T4D N A连接酶和限制性核酸内切酶B a m HⅠ㊁X h oⅠ㊁P s tⅠ㊁N o tⅠ等购自N E B公司;R N A提取试剂盒(R N e a s y P l u s M i n i K i t)购自Q I A G E N公司,R T-P C R反转录试剂盒(T r a n s S c r i p t R e v e r s e T r a n s c r i p t a s e)㊁鼠抗H A抗体㊁鼠抗H i s抗体㊁鼠抗F L A G抗体㊁H R P 标记的羊抗鼠I g G和羊抗兔I g G均购自北京全式金生物技术公司;兔抗骆驼多克隆抗体由实验室制备保存[27];转染试剂P E I购自P o l y s c i e n c e s公司;无机试剂均为国产分析纯产品;临床34份阳性和47份阴性A S F抗体猪血清为实验室收集并保存,上述血清均通过非洲猪瘟病毒E L I S A抗体检测试剂盒(北京金诺百泰生物技术有限公司)鉴定㊂1.2方法1.2.1 A S F V N P419L蛋白的原核表达与纯化A S F V编码N P419L蛋白的基因序列(G e nB a n k: N C_001659.2)由G E N E W I Z公司合成,连接至p U C56载体㊂由G E N E W I Z公司合成扩增该基因的引物(表1)㊂以合成的N P419L基因为模板,A S-F V-N P419L-F和A S F V-N P419L-R为引物,PC R 扩增目的基因片段㊂限制性内切酶B a m HⅠ和X h oⅠ酶切P C R产物和p E T-28a(+)表达载体, T4连接酶将目的基因连入载体中㊂测序鉴定正确后得到重组表达质粒p E T-28a-N P419L㊂阳性重组质粒转化至B L21(D E3)感受态细胞,表达重组蛋白㊂阳性菌液培养至O D600n m值为0.6~0.8,加入终浓度为1mm o l㊃L-1的I P T G, 37ħ诱导表达8h后收集菌体㊂以180W功率超声3s,暂停3s,超声40m i n裂解菌体后分别收集上清和沉淀,参考N i-N T A使用说明书纯化目的蛋白㊂S D S-P A G E和W e s t e r n b l o t分析目的蛋白的表达㊁纯化和抗原性㊂1.2.2动物免疫及血清效价测定 1m L纯化的重组N P419L蛋白(2m g㊃m L-1)与等体积佐剂乳化,颈部皮下多点免疫4周龄雌性双峰驼,共免疫5次㊂每两周免疫一次,第一次采用完全弗氏佐剂进行乳化,后四次采用不完全弗氏佐剂㊂第五次免疫一周后采集免疫骆驼的颈静脉血,分离血清和外周血淋巴细胞㊂参考刘红亮等描述的方法[28], E L I S A检测骆驼血清中抗N P419L蛋白的抗体效价㊂1.2.3噬菌体展示文库的构建参考R N A提取试剂盒说明书提取外周血淋巴细胞总R N A㊂以提取的R N A为模板,O l i g o(d T)20为反转录引物,参考T r a n s S c r i p t Ⅱ反转录试剂盒的说明书,合成c D N A㊂以c D N A为模板,参考刘红亮等描述的方法[28],巢式P C R扩增V HH基因片段㊂第一轮P C R以C A L L001㊁C A L L002为引物(表1),P C R产物经12g㊃L-1的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定,回收大小约700b p的条带;以第一轮P C R回收产物为模1152畜 牧 兽 医 学 报54卷表1 目的基因扩增引物T a b l e 1 P r i m e r s f o r a m p l i f i c a t i o n o f t a r g e t ge n e 引物名称P r i m e r n a m e引物序列(5'ң3')P r i m e r s e qu e n c e 酶切位点R e s t r i c t i o n s i t e sA S F V -N P 419L -FC G C G G A T C C A T G C T A A A T C A A T T T CB a m H ⅠA S F V -N P 419L -RC C G C T C G A G A A T G A T T T C T A A A A C AX h o Ⅰp C A G E N -N P 419L -F C C G A A T T C A T G C T A A A T C A A T T T C C T G G CE c o R I pC A G E N -N P 419L -R C G G C G G C C G C C T A A G C G T A G T C T G G G A C G T C G TA T G G G T A A A T G A T T T C T A A A A C AN o t IC A L L 001G T C C T G G C T G C T C T T C T A C A A G GC A L L 002G G T A C G T G C T G T T G A A C T G T T C C V HH -F C A G G T G C A G C T G C A G G A G T C T G G G G G A G RP s t ⅠV HH -RC T A G T G C G G C C G C T G A G G A G A C G G T G A C C T G G G TN o t Ⅰ下划线为酶切位点T h e u n d e r l i n e i s t h e r e s t r i c t i o n s i t e板,VHH -F ㊁V HH -R 为上下游引物(表1)进行第二轮P C R ,P C R 产物经15g ㊃L -1的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定,回收大小约为400b p 的条带㊂限制性内切酶P s t Ⅰ和N o t Ⅰ对第二轮P C R 产物和p M E C S 噬菌体展示载体进行双酶切,T 4D N A 连接酶将目的基因连入载体㊂连接产物电转化至大肠杆菌T G 1感受态细胞,涂布于含葡萄糖且氨苄抗性的L B (L B /A m p-G L U )固体平板,37ħ培养6~8h ,收集菌苔,即为构建的抗N P 419L 的噬菌体展示文库㊂取20μL 培养物进行10倍比稀释,取10-3至10-6稀释度的样品涂布于L B /A m p-G L U 固体平板,37ħ培养8h ,计数平板上的菌落㊂次日,随机挑取48个单克隆加入1m L L B /A m p-G L U 液体培养基,37ħ振荡培养4~6h ,引物V HH -F 和V HH -R 进行P C R 鉴定,测定文库的阳性率,计算构建的纳米抗体库的库容㊂阳性克隆送至西安擎科生物技术有限公司,测序获得序列后分析文库的多样性㊂1.2.4 A S F V -N P 419L 特异性纳米抗体的淘选构建的噬菌体文库接种于含葡萄糖且氨苄抗性的Y T (2ˑY T /A m p-G L U )液体培养基,培养至O D 600n m 值为0.6~0.8,加入M 13K O 7辅助噬菌体,静置离心,加入氨苄和卡那霉素双抗性Y T (2ˑY T /A m p-K a n )液体培养基㊂过夜培养后收集上清,加入预冷的P E G /N a C l ,离心收集沉淀并用P B S 重悬,再次离心后收集上清即为救援的重组噬菌体㊂重组噬菌体进行10的倍比稀释后浸染对数生长期的T G 1,涂布于L B /A m p -G L U 固体平板,计算重组噬菌体滴度㊂原核表达纯化的重组N P 419L 蛋白包被E L I S A 板,加入救援的重组噬菌体,37ħ孵育2h ,加入新鲜配制的三乙胺溶液(0.1m o l ㊃L -1)洗脱结合的噬菌体,加入等体积的T r i s -H C l (1m o l ㊃L -1,pH=7.4)中和,即为第一轮洗脱液㊂参考上述救援噬菌体滴度的测定方法,测定第一轮洗脱液中的噬菌体滴度㊂将洗脱液浸染对数生长期的T G 1,进行第二轮的救援和筛淘㊂参考上述方法,对构建的噬菌体文库共进行三轮的救援和筛淘㊂第三轮淘选后测定滴度的平板上随机挑取96个单克隆,接种于L B /A m p-G L U 培养基,37ħ培养至对数生长期,加入终浓度为1mm o l ㊃L -1的I P T G 诱导表达㊂离心收集菌体沉淀,冻融3次,上清即为包含纳米抗体的粗提物㊂E L I S A 鉴定特异结合N P 419L 蛋白的粗提物㊂原核表达纯化的重组N P 419L 蛋白包被E L I S A 板,2.5%脱脂奶粉封闭;加入上述制备的粗提物,37ħ孵育1h ;加入抗H A 单抗,37ħ孵育1h ;加入H R P 标记的羊抗鼠I gG 抗体,37ħ孵育1h ,加入T M B 室温显色15m i n,用3m o l ㊃L-1H 2S O 4终止反应后,读取O D 450n m值㊂以包被的血清4型禽腺病毒(f o w l a d e n o v i r u s,F A d V )的H e x o n 蛋白为阴性对照㊂以N P 419L 蛋白为包被抗原的O D 450n m 值大于阴性对照的3倍以上,初步鉴定为特异性结合靶蛋白的粗提物㊂阳性粗提物对应的单克隆菌液送至西安擎科生物技术有限公司测序,获得的序列用M e g A l i gn 软件比对,纳米抗体高变区(C D R 3区)的氨基酸序列相似性大于95%的定义为同一株纳米抗体㊂1.2.5 纳米抗体与H R P 融合蛋白的表达 以21526期王映等:抗非洲猪瘟病毒N P419L蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用上述获得的包含编码阳性纳米抗体基因序列的单克隆菌液为模板,VHH-F和V HH-R为引物扩增基因序列,P s tⅠ和N o tⅠ将P C R产物和p C MV-N1-H R P载体进行双酶切,酶切产物用T4D N A连接至载体,转化至T r a n s5α感受态细胞,测序鉴定㊂阳性质粒利用P E I转染试剂转染至H E K293T细胞,培养48h,收取细胞上清即为表达制备的抗N P419L纳米抗体与H R P融合蛋白㊂间接免疫荧光试验(i n d i r e c t i mm u n o f l u o r e s-c e n c e a s s a y,I F A)鉴定融合蛋白在H E K293T细胞内的表达㊂4%多聚甲醛溶液固定转染细胞,1% B S A溶液封闭;依次孵育抗H i s单抗和F I T C标记的羊抗鼠I g G;D A P I染细胞核后,倒置荧光显微镜观察㊂E L I S A鉴定融合蛋白被分泌表达至细胞上清并具有H R P的反应活性㊂将收集的上清直接包被E L I S A板,2.5%脱脂奶粉封闭1h,直接加入TM B 显色液避光显色,加入3m o l㊃L-1H2S O4终止反应,读取O D450n m值㊂与阴性对照相比,鉴定上清中是否含有纳米抗体与H R P融合蛋白㊂1.2.6融合蛋白与原核表达N P419L蛋白结合的鉴定 E L I S A鉴定表达制备的纳米抗体与H R P 融合蛋白与原核表达的重组N P419L蛋白的结合㊂重组N P419L蛋白包被E L I S A酶标板,相同载体和系统表达制备的A S F V-p30和F A d V-H e x o n蛋白为无关蛋白对照,2.5%脱脂奶粉封闭;分别加入收集的上清(包含抗N P419L纳米抗体与H R P融合蛋白),室温孵育后加入T M B显色液,避光显色15 m i n后加入3m o l㊃L-1H2S O4终止反应,读取O D450n m值㊂E L I S A测定上清中不同纳米抗体与H R P融合蛋白与N P419L蛋白的结合效价㊂收集的转染细胞上清进行10的倍比(1ʒ10㊁1ʒ102㊁1ʒ103㊁1ʒ104)稀释后加入E L I S A板中,然后显色㊁终止反应,根据读取的O D450n m值确定不同融合蛋白的结合效价㊂1.2.7融合蛋白与真核表达N P419L蛋白的结合构建带有F L A G标签的N P419L蛋白的真核表达载体㊂以p E T-28a-N P419L质粒为模板,引物为p C A G E N-N P419L-F和p C A G E N-N P419L-R (表1),P C R扩增靶基因㊂E c o RⅠ和N o tⅠ将P C R 产物和p C A G E N真核表达载体分别双酶切,T4 D N A连接酶将靶基因连接至p C A G E N载体,测序鉴定㊂将阳性质粒转染至H E K293T细胞,培养24h,4%多聚甲醛固定细胞以及1%B S A溶液封闭;依次孵育抗F L A G单抗和F I T C标记的羊抗鼠I g G,D A P I染核后,倒置荧光显微镜下观察重组N P419L蛋白的表达㊂确定蛋白表达后,I F A鉴定表达制备的纳米抗体与H R P融合蛋白结合真核表达的N P419L蛋白㊂质粒转染的细胞固定封闭后,加入纳米抗体与H R P融合蛋白室温孵育1h;依次孵育抗H i s单抗和F I T C标记的羊抗鼠I g G,D A P I 染核后倒置荧光显微镜观测结果㊂1.2.8融合蛋白在A S F抗体检测中的初步应用竞争E L I S A初步评价制备的纳米抗体与H R P 融合蛋白在A S F抗体检测中的应用㊂重组N P419L蛋白(400n g㊃孔-1)包被E L I S A板,2.5%脱脂奶粉封闭;制备的纳米抗体与H R P融合蛋白分别与A S F抗体阳性(34份)和阴性(47份)猪血清混匀后,加入E L I S A板中,37ħ孵育1h;洗板后每孔加入T M B显色液,避光显色15m i n后加入3m o l㊃L-1H2S O4终止反应,读取O D450n m值㊂比较分析阳性和阴性血清的O D450n m值,初步评价筛选获得的纳米抗体在A S F抗体检测中的应用㊂2结果2.1A S F V N P419L重组蛋白的原核表达、纯化及鉴定构建的A S F V N P419L蛋白原核表达质粒转化至B L21(D E3),经I P T G诱导表达后,S D S-P A G E 结果显示,成功获得预期大小为48k u的重组N P419L蛋白(图1A);菌体超声裂解后,该重组蛋白主要以包涵体的形式存在(图1A);N i-N T A亲和层析纯化获得了纯度较高的目的蛋白(图1A)㊂W e s t e r n b l o t结果显示,表达制备的N P419L重组蛋白与A S F阳性猪血清具有良好的反应性,说明原核表达的重组N P419L蛋白具有良好的抗原性(图1B)㊂2.2免疫骆驼抗N P419L蛋白抗体效价的测定5次免疫后,采集免疫骆驼的血清,E L I S A结果显示,免疫骆驼中抗N P419L蛋白特异性抗体效价可达1ʒ128000(图2),表明制备的重组N P419L蛋白具有良好的免疫原性,可刺激骆驼产生较好的免疫应答反应㊂2.3抗A S F V N P419L蛋白纳米抗体噬菌体展示文库的构建5免后1周采集免疫骆驼的外周血并提取总3152畜 牧 兽 医 学 报54卷M.蛋白质相对分子质量标准;1.p E T -28a 空载诱导表达菌体;2.未诱导表达菌体;3.诱导表达菌体;4.菌体裂解后沉淀;5.菌体裂解后上清;6.纯化的重组蛋白M.P r o t e i n m a r k e r ;1.N e ga t i v eb ac t e r i a w i t h i nd u c t i o n ;2.P o s i t i ve b a c t e r i a w i t h o u t i n d u c t i o n ;3.P o s i t i v e b a c t e r i a w i t h i n -d u c t i o n ;4.P e l l e t s af t e r s o n i c a t i o n ;5.S u pe r n a t a n t af t e r s o n i c a t i o n ;6.P u r i f i e d r e c o m b i n a n t p r o t e i n 图1 S D S -P A G E (A )和W e s t e r n b l o t (B )鉴定原核表达纯化的A S F V N P 419L 重组蛋白F i g .1 I d e n t i f i c a t i o n o f t h e r e c o m b i n a n t A S F V N P 419L p r o t e i n b y S D S -P AG E (A )a n d W e s t e r n b l o t a n a l ys i s (B)图2 E L I S A 检测免疫骆驼中抗N P 419L 抗体的效价F i g .2 T i t e r s o f a n t i -N P 419L a n t i b o d yt i t e r i n t h e i m m u n i z e d b y de t e c t i o n of E L I S A R N A ,以R N A 为模板,经巢式R T -P C R 成功扩增得到了编码V HH 的基因片段,其预期大小为400b p(图3A )㊂经酶切,连接和电转化后,成功构建了库容量为6ˑ108的抗N P 419L 蛋白的V HH 噬菌体展示文库㊂经菌液P C R 鉴定,文库阳性率约为89.5%(图3B )㊂阳性单克隆测序结果表明插入的V HH 基因没有重复序列(图3C ),说明构建的文库多样性较好㊂2.4 抗A S F V N P 419L 蛋白特异性纳米抗体的淘选以表达制备的N P 419L 重组蛋白为包被抗原,三轮噬菌体展示淘选后,结果显示与对照相比,抗N P 419L 蛋白的特异性噬菌体比例逐渐升高,由0.7升至85(表2),表明抗N P 419L 特异性噬菌体得到有效富集㊂将第三轮淘选的噬菌体进行滴度测定,结果显示与阴性对照组相比,抗N P 419L 的噬菌体得到明显富集(图4A )㊂第三轮淘选后测定滴度的平板上随机挑取96个单克隆,经I P T G 诱导制备可溶性的纳米抗体粗提物㊂利用制备的粗提物进行E L I S A ,结果显示制备的96个粗提物中有23个可能与N P 419L 蛋白发生特异性结合(图4B )㊂将阳性粗提物对应的单克隆进行测序,根据获得的23个V HH C D R 3的氨基酸序列比对结果,成功筛淘获得6株抗N P 419L 蛋白的特异性纳米抗体,分别命名为A S F V -N P 419L -N b 18㊁-20㊁-34㊁-46㊁-49和-89,且6株纳米抗体均在F R 2区存在典型的亲水性氨基酸替换(图5)㊂2.5 抗A S F V N P 419L 蛋白与H R P 融合蛋白的表达获得的抗N P 419L 纳米抗体的基因序列连接至pC MV -N 1-H R P 载体,成功构建了纳米抗体与H R P 融合蛋白的真核表达载体㊂阳性质粒转染H E K 293T 细胞48h 后,I F A 结果显示抗N P 419L 纳米抗体与H R P 融合蛋白成功在细胞中表达(图6A )㊂利用收集的上清直接包被E L I S A 板显色,结果显示,融合蛋白成功分泌至细胞培养上清中,具有H R P 与其底物T M B 反应的特性(图6B )㊂该6株融合蛋白命名为A S F V -N P 419L -N b 18-H R P ㊁-20-H R P ㊁-34-H R P ㊁-46-H R P ㊁-49-H R P 和-89-H R P ㊂2.6 6株纳米抗体与H R P 融合蛋白与A S F V N P 419L 蛋白的结合原核表达制备的N P 419L 蛋白为包被抗原,收集的6株纳米抗体与H R P 融合蛋白上清为孵育的一抗,直接E L I S A 结果显示,与无关抗原相比6株融合蛋白均可特异性结合原核表达制备的A S F V41526期王 映等:抗非洲猪瘟病毒N P 419L 蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用A.巢式P C R 扩增V HH 基因(M.D N A 相对分子质量标准;1.第一轮P C R 扩增;2.第二轮P C R 扩增);B .P C R 鉴定V HH 文库阳性率;C .阳性克隆序列A.A m p l i f i c a t i o n o f V HH g e n e b y ne s t e d P C R (M.D N A m a r k e r ;1.T h ef i r s t r o u n d o f P C R ;2.T h e s e c o n d r o u n d o f P C R );B .I d e n t i f i c a t i o n o f V HH l i b r a r y p o s i t i v e r a t e b y P C R ;C .T h e s e q u e n c e s o f t h e p o s i t i v e P C R p r o d u c t s i n t h e l i b r a r y 图3 V H H 噬菌体展示文库的构建F ig .3 C o n s t r u c t i o n o f V H H ph a g e di s p l a y l i b r a r y表2 N P 419L 特异性噬菌体富集情况T a b l e 2 E n r i c h m e n t o f p h a g e p a r t i c l e s c a r r y i n g s pe c if i c a n t i -N P 419L n a n o b o d i e s 淘选轮数R o u n d o f p a n n i n g投入量/(p f u ㊃w e l l -1)I n p u t p h a g e 阳性洗脱量/(p f u ㊃w e l l -1)P o u t p u t 对照洗脱量/(pf u ㊃w e l l -1)N o u t pu t 特异性噬菌体比例P /N 第一轮R o u n d 15.0ˑ10102.1ˑ1063.0ˑ1060.7第二轮R o u n d 25.0ˑ10106.4ˑ1082.2ˑ10729.1第三轮R o u n d 35.0ˑ10101.7ˑ1082.0ˑ10685.0N P 419L 蛋白(图7A )㊂E L I S A 分析6株融合蛋白结合重组N P 419L 蛋白的效价,结果表明A S F V -N P 419L -N b 20-H R P 的结合效价最高,达104;A S F V -N P 419L -N b 89-H R P 的结合效价最低,在1ʒ102稀释时已不能结合;其余4株结合效价为103(图7B)㊂经E c o RⅠ和N o t Ⅰ双酶切鉴定后,琼脂糖凝胶电泳结果显示成功构建了重组N P 419L 蛋白的真核表达质粒(图7C )㊂阳性质粒转染H E K 293T 细胞,利用抗F L A G 单抗进行I F A 检测发现,重组N P 419L 蛋白成功在细胞质中表达(图7D )㊂利用收集的抗N P 419L 蛋白纳米抗体与H R P 融合蛋白为一抗进行I F A 检测,结果发现A S F V -N P 419L -N b 20-H R P 与H E K 293T 细胞中表达的N P 419L 蛋白结合,其余融合蛋白不结合(图7D )㊂2.7 A S F V -N P 419L -N b 20-H R P 融合蛋白在A S F V 抗体检测中的应用A S F V -N P 419L -N b 20-H R P 融合蛋白作为检测探针,竞争E L I S A 检测A S F 抗体阳性和阴性猪血清,结果发现47份阴性血清的O D 450n m 值在1.17~1.35之间㊂34份阳性血清中,32份的5152畜 牧 兽 医 学 报54卷A.噬菌体滴度;B .间接E L I S A 检测重组纳米抗体与N P 419L 的结合A.P h a g e t i t e r s ;B .D e t e c t i o n t h e r e a c t i v i t y o f r e c o m b i n a n t n a n o b o d i e s w i t h N P 419L p r o t e i n b yi n d i r e c t E L I S A 图4 间接E L I S A 筛选N P 419L 特异性纳米抗体F i g .4 S c r e e n i n g o f N P 419L -s p e c i f i c n a n o b o d i e s b y In d i r e c t E L I SA 图5 N P 419L 特异性纳米抗体氨基酸序列比对F i g .5 A m i n o a c i d s e q u e n c e s a l i g n m e n t o f N P 419L -s pe c if i c n a n o b o d i e s O D 450n m 值在0.21~0.67之间,平均竞争率为73%,统计学分析显示该32份阳性血清显著竞争抑制了A S F V -N P 419L -N b 20-H R P 融合蛋白与N P 419L 蛋白的结合(图8)㊂另外2份阳性血清用该竞争E L I S A 方法未检测出,而商品化试剂盒检测结果为弱阳性㊂上述结果初步表明,制备的A S F V -N P 419L -N b 20-H R P 融合蛋白可以作为A S F 抗体检测的竞争探针,应用于猪血清中A S F 抗体检测竞争E L I S A 试剂盒的开发㊂61526期王 映等:抗非洲猪瘟病毒N P 419L蛋白纳米抗体的筛选鉴定及其在抗体检测中的初步应用A.I F A 鉴定细胞中融合蛋白的表达;B .E L I S A 鉴定融合蛋白分泌至细胞上清中表达A.E x p r e s s i o n o f a n t i -N P 419L n a n o b o d y -H R P f u s i o n p r o t e i n s i n t h e H E K 293T c e l l s b y I F A a n a l y s i s ;B .S e c r e t o r y e x pr e s -s i o n o f a n t i -N P 419L n a n o b o d y -H R P f u s i o n p r o t e i n s i n t h e H E K 293T c e l l s b y E L I S A a n a l y s i s 图6 抗N P 419L 蛋白纳米抗体与H R P 融合蛋白在H E K 293T 细胞中的表达鉴定F i g .6 E x pr e s s i o n o f a n i -N P 419L n a n o b o d i e s f u s e d w i t h H R P i n t h e H E K 293T c e l ls A.融合蛋白特异性结合原核表达的重组N P 419L 蛋白;B .上清中融合蛋白结合N P 419L 蛋白的结合效价;C .重组N P 419L 真核表达载体的酶切鉴定(M.D N A 相对分子质量标准;1.阳性质粒的双酶切鉴定);D.I F A 鉴定融合蛋白结合真核表达的重组N P 419L 蛋白A.S p e c i f i c i t y ;B .A f f i n i t y ;C .E n z y m a t i c d i ge s t i o n of r e c o m b i n a n t p l a s m i d s p C A G E N -N P 419L (M.D N A m a r k e r ;1.E n -z y m a t i c d ig e s t i o n o f p C A G E N -N P 419L );D.D e t e c t i o n th e bi n d i n g o f N b 20t o N P 419L i n H E K -293T c e l l s b y IF A 图7 抗N P 419L 纳米抗体与H R P 融合蛋白结合不同表达形式N P 419L 蛋白的鉴定F i g .7 A c t i v i t y i d e n t i f i c a t i o n o f N P 419L -s pe c if i c n a n o b o d i e s 3 讨 论最近有研究发现,我国出现了基因Ⅰ型和低毒力的基因Ⅱ型A S F V 毒株[29-30],该类毒株可导致猪的轻度感染和慢性疾病,加大了早期诊断难度,给我国A S F 的防控带来更多问题和挑战㊂因此,仍需要制备抗A S F V 不同蛋白的抗体并深入研究它们的生物学特性,为该病诊断技术和疫苗的开发提供理论和材料支撑㊂纳米抗体作为第三代基因工程抗体,逐渐成为病原体特性研究及疫病诊断和防治技术研发的有效工具㊂基于A S F 对我国养猪业的危害以及纳米抗体易基因工程改造和体外表达成本低7152畜牧兽医学报54卷***.P<0.001图8竞争E L I S A检测A S F抗体阳性和阴性猪血清F i g.8C o m p e t i t i v e E L I S A f o r d e t e c t i o n o f A S F a n t i b o d y p o s i-t i v e a n d n e g a t i v e s w i n e s e r u m的优势,本研究成功筛选制备了6株抗A S F V N P419L蛋白的纳米抗体,并且初步评价了其中1株纳米抗体在A S F抗体检测中的应用㊂然而,目前针对该病抗体的检测,大多数使用p30㊁p72㊁p54和p p62等A S F V主要的结构蛋白为靶抗原㊂因此, N P419L蛋白与上述蛋白在A S F抗体检测中的差异以及其能否也成为一种理想的检测靶抗原,仍需要后续深入的研究,进而为A S F抗体的检测提供一种新的策略㊂本研究通过抗原表达㊁动物免疫和噬菌体展示筛淘等技术成功筛选了6株抗A S F V N P419L的特异性纳米抗体㊂然而,前期我们制备其它病原(如新城疫和禽流感病毒)和蛋白的纳米抗体,通常能够筛选到20株左右㊂比较整个试验的操作过程,作者发现免疫的抗原以可溶形式存在时,筛选获得的纳米抗体较多㊂本研究中原核表达制备的重组N P419L 蛋白以包涵体的形式存在,该蛋白在透析复性过程中也迅速析出而无法完全复性㊂面对该问题,作者也通过降低诱导表达温度(16ħ)和转速(150r㊃m i n-1)等表达条件,但是重组N P419L蛋白均以包涵体的形式存在㊂因此,为了后续能够筛选更多株的抗N P419L蛋白的纳米抗体,建议后续可以用真核表达系统表达制备可溶形式的N P419L蛋白进行免疫㊂本研究制备的6株纳米抗体通过体外原核表达的重组N P419L蛋白免疫双峰驼获得,需要鉴定该6株纳米抗体能否结合A S F V内源性N P419L蛋白㊂基于此,作者先鉴定了6株纳米抗体与H R P 融合蛋白与真核表达的N P419L蛋白的结合特性,发现仅A S F V-N P419L-N b20-H R P可特异性结合真核表达的N P419L蛋白㊂随后利用该融合蛋白为一抗,I F A和W e s t e r n b l o t检测了A S F V感染P AM细胞后的内源性N P419L蛋白,结果均为阴性,该结果似乎提示该融合蛋白不能结合病毒内源性N P419L蛋白㊂然而,该融合蛋白可作为竞争探针有效检测猪血清中的A S F抗体,提示该纳米抗体识别的表位在A S F V感染猪后可刺激机体产生抗体㊂因此,作者推测该融合蛋白不能结合内源性N P419L蛋白可能是由于融合蛋白亲和力低或上清中含量低㊂总之,后续仍需对该株纳米抗体进行免疫学特性研究,验证其作为A S F V N P419L蛋白功能研究工具的可行性㊂纳米抗体易被体外基因工程改造,近年来被广泛的应用于疫病诊断和食品检测技术的研发中㊂例如,在疫病诊断领域,利用纳米抗体与H R P融合蛋白为检测探针,目前已成功建立了鸡新城疫[26]㊁猪繁殖与呼吸综合征[31]㊁猪圆环病毒2型[32]等重要动物疫病的抗体竞争E L I S A检测方法[33]㊂此外,也有利用纳米抗体的生物素或胶体金标记,建立了病原的夹心E L I S A和胶体金检测试纸条[34]㊂与基于传统抗体建立的诊断或检测技术相比,该类创新技术展现了生产成本低,耐极端环境和操作简易的特点㊂本研究成功表达制备了6株抗A S F V N P419L 纳米抗体与H R P融合蛋白,其中1株融合蛋白可有效的作为竞争探针检测猪血清中A S F的抗体㊂但是利用该融合蛋白检测的34份A S F抗体阳性猪血清,结果2份为阴性㊂该结果提示该融合蛋白作为探针检测A S F的抗体,可能敏感性较低,后续仍需要优化竞争E L I S A相关条件,提高该检测方法的敏感性㊂4结论利用大肠杆菌表达系统成功表达并纯化了重组A S F V N P419L重组蛋白,该蛋白具有很好的抗原性;通过双峰驼免疫和文库构建等技术,成功构建了库容为6ˑ108的噬菌体展示文库,利用噬菌体展示技术成功筛选获得6株抗N P419L蛋白的特异性纳米抗体;真核表达了该6株纳米抗体与H R P的融合蛋白,其中1株融合蛋白A S F V-N P419L-N b20-H R P可结合真核表达的N P419L蛋白,并可与A S F抗体阳性猪血清竞争地结合N P419L蛋白㊂8152。
猪瘟病毒E2蛋白抗原表位集中区的原核表达及鉴定
ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ ＡＩ Ｖ ｃ ｅ ｌ ｌ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ，ｔ ｈ ｅ ｃ ｈ ｉ ｃ ｋ ｅ ｎ Ｓ Ｔ３ Ｇａ ｌ Ｉ ｇ ｅ ｎ ｅ ｗａ ｓ ｅ ｏ ｌ ｏ ｎ ｅ ｄ ａ ｎ ｄ ｉ ｎ ｃ ｏ ｒ ｐ ｏ ｒ ａ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｅ ｕ ｋ ａ ｒ ｙ ｏ ｔ ｉ ｃ ｅ ｘ —
石 出。
关键 词 ： 猪瘟病 毒 ； Ｅ ２蛋 白； 抗 原表 位 ； 原核表 达 ； 鉴定
中图 分 类 号 ： Ｑ７ ８ ６ 文献标识码 ： Ａ 文章 编 号 ： １ ０ ０ ７ — ５ ０ ３ ８ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ３ — ０ ０ １ ５ — ０ ６
猪瘟（ Ｃ ｌ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ａ ｌ ｓ ｗｉ ｎ ｅ ｆ ｅ ｖ ｅ ｒ ，Ｃ Ｓ Ｆ） 是 由猪 瘟 病
Ｓ Ｔ３ ＧＡＬ 工 Ｇｅ ｎ ｅ
Ｃ ＨＥ Ｎ Ｈｕ ａ ｎ 。 Ｌ Ｉ Ｍｉ ｎ ｇ — ｙ ｉ ， ＧＡＯ Ｘ ｕ ａ ｎ
（ １ ． Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆＡｎ ｉ ｍａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ａ ｎ ｄ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ， Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ Ｈｅ ｂ ｅ ｉ ， Ｂａ ｏ ｄ ｉ ｎ ｇ ， Ｍｅ ｂ ｅ ｉ ， ０ ７ １ ０ ０ ０ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ；
作者简介 ： 郭 东光 （ １ ９ ８ ７ 一） ， 男， 河 南 淮 阳人 ， 硕士研究生 ， 主要 从 事动 物 病 理 学 与 分子 免 疫 学研 究 。 ＊通 讯 作 者
Ｅｓ ｔ ａ ｂｌ ｉ ｓ ｈ ｍｅ ｎｔ ｏ ｆ ＢＨ Ｋ－ ２ １ Ｃｅ ｌ ｌ Ｌｉ ｎ ｅ Ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｙ Ｅｘ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｎ ｇ Ｃｈｉ ｃ ｋ ｅ ｎ
猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的高效表达及鉴定
３ ａ 均 作 为 阴 性 对 照 。 收 集 菌 液 ， 心 弃 上 清 用 Ｐ Ｓ进 ２菌 离 Ｂ
行 两 次 洗 涤 ， Ｐ Ｓ悬 浮 菌 体 。取 少 量 的菌 液 加 人 上 样 缓 冲 用 Ｂ 液 ， 沸 ５ ｒｉ ， ｌ ％ 的 分 离 胶 、 ％ 的 浓 缩 胶 进 行 Ｓ Ｓ— 煮 ｎ用 ２ ａ ５ Ｄ Ｐ Ｇ 电泳 ， ２ ． ， 考 马 斯 亮 蓝 Ｒ ５ Ａ Ｅ １０Ｖ １５ｈ 经 ２ ０染 色 后 ， 冰 用 乙酸 一乙醇 脱 色 液 进 行 脱 色 。
ＤＨ５ 。 碱 裂 解 法 小 提 质 粒 。 ａ
１２ ６ 酶 切 鉴 定 ： 据 设 计 的酶 切 位 点 进 行 双 酶 切 鉴定 ， ．． 根 用
１ ％的琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 进 行 鉴 定 。 同 时 把 部 分 质 粒 送 大 连 宝
氨基 酸 序 列 同 源 性 在 ９ ％ ～ １ ０ ６ ０ ％之 间
１ ２． 表 达 产 物 的 鉴 定 ： 上 述 表 达 的 ｐ ． ９ 取 ＥＴ一３ ａ—Ｎ 阳性 ２
・
６ ・
《 海 畜 牧 兽 医通 讯 》 ２ ０ 上 ０ ９年 第 ２期
猪 繁殖与 呼吸综 合征病 毒核衣 蛋白 效表 鉴定 壳 的高 达及
张 林 吉 ， 任 士 飞 。 李 明 义 杜 元 钊 ’ 刘 秀 梵
（１徐州 生物工程 高等 职业学 校
２ １０ ２扬 州大学 兽 医学 院 ３青 岛 易 邦 生 物 工 程 有 限 公 司 ） ２０ ６
琼 脂糖 凝 胶 电泳 。 １ ２ ４ 片 段 的 纯 化 回 收 ： Ｒ ７ Ｐ Ｒ 产 物 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 ．． Ｏ Ｆ Ｃ
泳 后 ， Ａｇ ｒｓ ｅ ＤＮＡ ｘ ｒｃｉｎｋｔ 产 品 说 明 书 回收 目 用 ａｏ ｅｇ ｌ ｅ ｔａｔ ｉ按 ｏ
猪瘟病毒研究进展
，
Ｃ
、
Ｅ。 Ｏ 、１ Ｅ ． 们 均 由Ｃ Ｆ 的 对致 死量Ｃ Ｆ （ ）Ｅ 和 ２它 Ｅ ＳＶ Ｓ Ｖ的保护 性免 疫。 由于编码
Ｎ － Ｒ５ 在结构蛋 白中 ． ｇ ４ ／ ８ ｐ ４ ４ 的核酸 序列 在属内比编码ｇ ５ ｐ５ 含有一个大的开放性阅读框架 （ Ｒ ）此 Ｒ Ａ Ｏ Ｆ 一端所编码 。 ＯＦ ．
Ｎ ５ 。 Ｓ －３ 被 加工 成 Ｎ ２ Ｎ ３ 式 存在于 囊膜 表面 。 ＳＢＮ ２ 可 Ｓ ， Ｓ 由于其分 子内缺乏
与病毒囊膜 结合力弱 ． （８ ）除 Ｃ Ｅ ，１ Ｅ 为 结 构 蛋 白外 ． Ｐ ０ ． 、Ｏ Ｅ 和 ２ 其 疏水的膜锚定区 ．
余均 为非结构蛋 白。
１ Ｓ Ｖ基因结构与功能的研究 Ｃ Ｆ
是各 国研究的热点 。
白在病毒Ｒ Ａ上的编码顺序为Ｎ 。Ｃ、ｒ Ｎ 、 Ｅ ｎ
（ Ｏ） Ｅ ， ２ Ｐ ＮＳ －３、 Ｅ 、 １ Ｅ 、 ７、 ２ ＮＳ４ ＮＳ Ｂ、 Ａ、 ４
ＮＳ Ａ ５
、
于细胞膜 表面 或被 分泌 到胞外 。 在病毒 粒子 中ｇ４ ／ ８ ７ Ｄ 的同源 二聚体形 ｐ ４ ４ 以９ Ｋ ａ
２ ２
２ ６ ００ ０３
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主题 策 划
■
发病特 征不典型 ． 以发热 、 精 ｙ残基则参与 同源 、 异源二聚体 的形 区性 散发 ． 的序列保守程度 高 ． 因此Ｅ 。 ｒ可作 为防治 个Ｃ ｓ ｎ
猪瘟的一种靶 蛋 白。 成。
神沉郁 、 食欲减退 、 咳嗽 、 共济失调 、 结膜
Ｅｎ 有Ｒ ａ ｅ 具 ｒ ｓ Ｎ ｓ 活性 ． 用于单链 的 作
ＲＮＡ
，
ｇ ５的抗 原决 定区在 其Ｎ端 部分 炎以及腹 泻、 Ｐ５ 围产期死亡 、 死胎、 流产 。 中
猪瘟
是猪的一种急性接触性传染病，又称猪霍乱。
1885年首先在美国发现，以后传播到世界各大洲。
中国大部分省都有发生。
1903年美国兽医学家德希尼兹和多赛特鉴定本病的病原是披盖病毒科的瘟病毒属(Pestivirus)中的猪瘟病毒。
主要通过直接接触，或由于接触污染的媒介物而发病。
消化道、鼻腔粘膜和破裂的皮肤均是感染途径。
一年四季都可发生，以春夏多雨季节为多。
中文名：猪瘟英文名：swine fever；hog cholera别名：猪霍乱病原学：猪瘟病毒季节分布：春秋传染病：是传播途径：直接接触传播为主要方式潜伏期：5~7天，短的2天，长的21天临床表现：发病急，高热稽留，细小血管壁变性，全身广泛性出血点，脾梗死并发症：非洲猪瘟，猪丹毒疫苗预防：是预防措施：坚持自繁自养，必须引进种猪时严格做好检疫发病时，严格隔离疫苗防治猪瘟病猪是猪的一种急性接触性传染病，又称猪霍乱。
1885年首先在美国发现，以后传播到世界各大洲。
中国大部分省都有发生。
1903年美国兽医学家德希尼兹和多赛特鉴定本病的病原是披盖病毒科的瘟病毒属(Pestivirus)中的猪瘟病毒。
主要通过直接接触，或由于接触污染的媒介物而发病。
消化道、鼻腔粘膜和破裂的皮肤均是感染途径。
一年四季都可发生，以春夏多雨季节为多。
人工接种的猪，一般在36～48小时后体温升高。
而自然感染的潜伏期常为3～6天，间有延长到24天的。
典型病例表现为最急性、亚急性或慢性病程，死亡率高。
最急性型较少见，病猪体温升高，常无其他症状，1～2天内死亡。
急性型最常见，体温可上升到41℃以上，食欲减退或消失，可发生眼结膜炎并有脓性分泌物，鼻腔也常流出脓性粘液，间有呕吐,有时排泄物中带血液,甚至便血。
初期耳根、腹部、股内侧的皮肤常有许多点状出血或较大红点。
病程一般为1～2周，最后绝大多数死亡。
亚急性型常见于本病流行地区，病程可延至2～3周；有的转为慢性，常拖延1～2个月。
表现粘膜苍白，眼睑有出血点。
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Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｔ ｏ ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｙ ｔ ｈ ｅ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｏ ｌ ａ ｒ ｌ ｏ ｃ ａ ｌ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｉ ｇ ｎ ａ ｌ ｓ （ Ｎｏ Ｌ Ｓ ） ｏ ｆ ｃ ｌ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ａ ｌ ｓ ｗ ｉ ｎ ｅ ｆ ｅ ｖ ｅ ｒ ｖ ｉ ｅｓ ｒ （ Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ ） ｃ ａ ｐ ｓ ｉ ｄ（ Ｃ ） ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ
摘 要 ：为鉴定猪瘟病毒（ ｃ Ｓ Ｆ Ｖ ） 衣 壳蛋 白（ ｃ ） 在 细胞 中的核仁定位信号（ Ｎ ｏ Ｌ ｓ ） ，本研 究采 用截短表达的方法 将含 有 ｃ基 因不 同 片段 的真 核表 达 重 组 质粒 转 染猪 睾 丸 细胞 （ ｓ Ｔ ） 。 结果 表 明 ，瞬 时 表达 的 截短 Ｃ蛋 白的
ｗｅ ｒ ｅ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｓ ｗｉ ｎｅ ｔ ｅ ｓ ｔ ｉ ｃ ｌ ｅ（ Ｓ Ｔ ）ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ， ｒ ｅ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｌ ｙ ． Ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｓ ｈ ｏ ｗｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ａ ａ ５ １ 一 ａ ａ ７ １ ｐ ｅ ｐ ｔ ｉ ｄ ｅ ｏ ｆ Ｃ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｗａ ｓ
ａ ａ ５ １ ． ａ ａ ７ １多肽 定 位 于 ｓ Ｔ细胞 核 仁 中。 而将 Ｃ蛋 白的 ａ ａ ５ １ 一 ａ ａ ７ １ 缺 失 突 变后 ，Ｃ蛋 白则 丧 失 了其核 仁 定 位 的 能 力 。
此 外 ，将 Ｃ蛋 白 的 Ｋ Ｋ Ｋ ５ 突 变为 Ａ Ａ Ａ ，也 同样 导 致 Ｃ 蛋 白 丧 失核 仁 定位 能 力 ，表 明 该 序 列 为核 仁 定位 的核
第 ３ ７卷 第 ２期
２ ０ １ ５ 年 ２ 月
中 国 预
防 兽
医 学 报
Ｖｏ １ ． ３ ７． Ｎ ｏ． ２
Ｃｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｊ ｏ ｕ ｍａ ｌ ｏ ｆ Ｐ ｒ ｅ ｖ ｅ ｎ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ
心基 序 。本研 究 为进 一 步 分析 ｃ蛋 白在 ＣＳ Ｆ Ｖ 复制 过 程 中的功 能 提供 了实验 依 据 。 关 键 词 ：猪 瘟 病 毒 ；衣 壳蛋 白 ；核 仁 定 位 信 号 中 图分 类 号 ：￥ ８ ５ ２ ． ６ ５ 文 献标 识 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１ ０ ０ ８ ． ０ ５ ８ ９ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ２ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｏ ｌ ａ ｒ ｌ ｏ ｃ ａ ｌ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｉ ｇ ｎ ａ ｌ ｓ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｃ ａ ｐ ｓ ｉ ｄ
ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｏ ｆ ｃ ｌ ａ ｓ ｓ ｉ ｃ ａ ｌ ｓ ｗｉ ｎ ｅ ｆ ｅ ｖ ｅ ｒ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ
Ｆｅ ｂ ． ２ ０ｌ ５
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ￣ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ８ － ０ ５ ８ ９ ． ２ ０ １ ５ ． ０ ２ ． ０ ３
猪 瘟病 毒衣 壳蛋 白核 仁定 位信 号鉴 定
张 鑫 ，刘 宁 ， 时 洪艳 ，徐 佳
（ １ ． 中国 农业科 学 院哈尔 滨兽 医研 究所 兽 医生 物技 术国 家重 点实验 室 ／ 猪 传染病 研究 室 ，黑龙江 哈 尔滨 １ ５ ０ ０ ０ １ ； ２ ． 黑龙 江省 动物 卫生 监督 所 ，黑龙江 哈 尔滨 １ ５ ０ ０ ６ ９ ）
ｉ ｎ ｆ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ， ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ ｅ ｕ ｋ ａ ｒ ｙ ｏ ｉ ｆ ｃ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｐ ｌ ａ ｓ ｍｉ ｄ ｓ ｃ ｏ ｎ ｔ ａ ｉ ｎ ｉ ｎ ｇ ａ ｓ ｅ ｔ ｏ ｆ ｏ ｖ ｅ ｒ ｌ ａ ｐ ｐ ｉ ｎ ｇ ＤＮＡ ｆ ｒ ａ ｇ ｍｅ ｎ ｔ ｓ ｏ ｆ ｔ ｒ ｕ ｎ ｃ ａ ｔ ｅ ｄ Ｃ ｇ ｅ ｎ ｅ
ｌ ｏ ｃ ａ ｌ ｉ ｚ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｏ ｌ ｕ ｓ ｏ ｆ Ｓ Ｔ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ； Ｗｈ ｅ ｒ ｅ ａ ｓ ， ｔ ｈ ｅ ａ ａ ５ １ 一 ａ ａ ７ １ ｄ ｅ ｌ ｅ ｔ ｉ ｏ ｎ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ Ｃ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｌ ｏ ｓ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈ ｅ ａ ｂ ｉ ｌ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｏ ｌ ａ ｒ ｌ ｏ ｃ ａ ｌ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ， ｗｈ ｉ ｃ ｈ ｉ ｎ ｄ ｉ ｃ ａ ｔ ｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｐ ｅ ｐ ｔ ｉ ｄ ｅ ｏ ｆ ａ ａ ５ １ 一 ａ ａ ７ １ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ Ｃ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｗａ ｓ ｔ ｈ ｅ Ｎｏ Ｌ Ｓ ｆ ｏ ｒ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ｏ ｌ ａ ｒ ｌ ｏ ｃ ａ ｌ ｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ． Ｍｏ ｒ ｅ ｏ ｖ ｅ ｒ ， ｔ ｈ ｅ