猪瘟病毒基因组蛋白结构及蛋白表达技术的研究进展

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新型猪瘟疫苗研究进展

新型猪瘟疫苗研究进展

接触性传染 病 , 养猪业 危 害极 大 , 病 原猪瘟 病毒 对 其
( lsi ls n e e i s C F 为 单 股 正 链 Casc wie fvr vr , S V) a u R NA病毒 , 于 黄 病 毒 科 ( lvrd e 属 F a iia )瘟 病 毒 属 ( et iu ), P si r s 研究 证 明 , v 猪瘟 病 毒 的抗 原 蛋 白主要 是 E 。E 、 2 0世 纪 7 、 1 E 。2 O年 代 后 期 , 瘟 的 流行 猪 形 式发生 了很 大变 化 , 区散 发 性 流 行 及 非 典 型猪 地 瘟 症状 的发生 , 明猪 瘟病 毒 的抗 原 性 可 能 存 在 着 表 变异 , 特别是 近年来 国 内外 应 用 单 克 隆抗 体 对 C株 检 测时发现 有不 同 的反 应模 式 , 瘟 兔 化 弱 毒疫 苗 猪 免 疫失败 也有报 道 , 示 随着 传 代 次 数 的 增 加 和对 提 不 同细胞 的适 应性 繁殖 , 苗 毒 株 可 能 发 生 异质 性 疫 或抗 原漂移 。加之数 十年 来猪瘟 病 毒在 大规 模 免疫 接种 压力下 出现抗 原 变 异 , 有 的传 统疫 苗 已不 能 现 完全适 应新形 势 的需 要 , 究 和 开 发 新 型猪 瘟 疫 苗 研 成为 大势所趋 , 分子 生物 学技术 的发展 , 新 型猪 而 为 瘟疫苗 的研究和 开发奠 定 了基础L 。 1 ] 1 猪瘟 病毒基 因缺 失型弱 毒疫 苗 病毒 编码毒 力 的 基 因可 以删 除 , 当某 些 与 病毒 复制无关 的毒 力基 因缺 失突 变 后 , 毒 毒 力 丧 失 或 病 明显减弱 , 但病毒 复制能 力并 不丧 失 , 同时还保 持 着 良好的免疫 原性 , 因此 , 过基 因工 程 技术使 病 毒基 通 因组 中的毒力基 因缺 失 , 以 获 得基 因缺 失 型 弱 毒 可 疫苗株 。

猪细小病毒研究进展_刘占通(PDF)

猪细小病毒研究进展_刘占通(PDF)

猪细小病毒研究进展刘占通王书丽(河南省兽药监察所河南郑州450008)猪细小病毒(P PV)是M ayr和M ahnel于1966年在用猪肾原代细胞进行猪瘟病毒组织培养时发现的112,是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一,其特征是母猪孕前期受到感染,经胎盘使胚胎或胎儿受到侵袭,引起初产母猪流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等,同时还可引起仔猪的皮炎和腹泻。

各种类型、年龄段的猪均可感染PP V,但除怀孕母猪和仔猪外,其他类型的猪感染后均无明显临床症状12,32。

猪细小病毒病在世界各地广泛存在,严重影响着养猪业的发展,因此本病一直是猪病研究的热点之一,P PV又常同猪伪狂犬病毒、乙型脑炎病毒、圆环病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒等混合感染而加重了其危害。

自20世纪60年代中期以来,相继从欧洲、美洲、亚洲等很多国家分离到该病毒或检测出其抗体,我国也先后在北京、上海、吉林、黑龙江、四川、浙江等地分离到了多株P PV,血清学调查的阳性率为80%。

近几年来,该病毒给世界养猪业造成了严重的经济损失,因此受到了高度重视,国内外学者对该病毒的研究也逐渐深入。

1猪细小病毒病原学研究1.1形态和理化特性PP V属于细小病毒科、细小病毒属。

P PV外观呈六角形或圆形,无囊膜,直径为20~30nm,二十面体轴立体对称,核衣壳由32个壳粒组成,核心含单股线状负链DN A,核酸约占整个病毒粒子的26.5%,其G+C=48%。

P PV具有较强的耐热能力,适应pH范围极广,pH在3~10范围内,感染性无明显变化。

对酶、脂溶剂及有机溶剂具有很强的抵抗力,但0.5%漂白粉或氢氧化钠5min可杀死P PV,甲醛蒸汽和紫外线需要相当长的时间才能杀死P PV。

病毒培养液在pH9.0的甘油缓冲盐水中或在-20e及-70e以下保存1年以上其感染效价和血凝性都不减弱。

1.2细胞培养特性PP V的复制需要借助宿主细胞的蛋白质和核酸合成体系,因此P PV对培养细胞有一定的选择性。

猪 瘟

猪  瘟


体内带毒时间短。在免疫猪体内仅保毒14d,不从 尿、粪中排毒,也不引起非免疫猪同居感染
对不同毒力株均有非常高的保护作用,免疫猪保 护率达100% 免疫期长。1~1.5年,保护力为100%


免疫剂量小:淋巴结、脾脏中含毒10-4~10-5PFU 即可产生保护力
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 2)免疫程序
后备母猪于配种前15d免疫1此,产仔后10d免疫1次
猪瘟:肾盂肾乳头出血
猪瘟:膀胱粘膜出血
猪瘟:喉头粘膜出血
猪瘟:肺脏散在出血斑点
心冠脂肪、心肌、心内外膜、心包膜出血

扁桃体出血、坏死
小肠、大肠黏膜充血、出血;盲肠(特别是回盲瓣 处)和结肠的淋巴组织坏死 脑炎。脑膜出血,毛细血管周围,大量淋巴细胞聚 集,形成“袖套状”。小胶质细胞增多或局灶坏死



持续感染型或迟发性猪瘟:目前我国猪场常
见类型,多见于有CSF流行病史的猪场

感染猪通常无临床症状,但长期带毒、排毒;感染母猪 可垂直感染胎儿,发生流产、早产、木乃伊胎、死胎、 弱仔、颤抖仔猪或外表健康仔猪 生后存活的仔猪大部分发病死亡,不死者终身带毒、不 定期排毒,成为重要的传染源,并产生免疫耐受,对 CSFV不产生抗体应答,或发生过敏反应耳病情恶化、死 亡
酶标抗体技术:检测病猪外周血白细胞涂片及组
织压片中的CSFV

病毒分离培养和鉴定:病料接种于 PK-15 细胞, 48~72h后,用FA或酶标抗体技术检测 新城疫病毒强化法(END法):猪睾丸细胞,先接 种病料(4d),再接种NDV(106个蚀斑单位, 3d),出现CPE。此法可区分强毒和兔化毒
病势重、死亡率高
五、临床症状

非洲猪瘟亚单位疫苗生产国标

非洲猪瘟亚单位疫苗生产国标

非洲猪瘟亚单位疫苗生产国标非洲猪瘟(African Swine Fever,简称ASF)是一种猪类传染性疾病,由非洲猪瘟病毒引起。

该病在猪群中的传染性非常高,致死率也很高,目前没有特效药和治疗方法。

为了控制和预防非洲猪瘟的爆发,疫苗的研发和生产变得至关重要。

亚单位疫苗(subunit vaccines)是疫苗的一种类型,它使用病原体的部分成分来刺激免疫系统产生保护性免疫反应。

与传统疫苗相比,亚单位疫苗在安全性和稳定性方面具有明显优势。

研发和生产非洲猪瘟亚单位疫苗的国际标准对于确保产品质量、促进全球合作以及抗击ASF的传播具有重要意义。

非洲猪瘟病毒包含多种蛋白质成分,这些蛋白质可以作为制备亚单位疫苗的目标抗原。

其中,E2蛋白是病毒表面结构蛋白,它在病毒进入宿主细胞、免疫反应等过程中起着重要作用。

因此,E2蛋白成为制备ASF亚单位疫苗的主要目标。

非洲猪瘟亚单位疫苗的生产需要经过一系列的步骤。

首先,需要制备非洲猪瘟病毒的E2蛋白。

这可以通过基因工程技术来实现,利用重组DNA技术将病毒的E2蛋白基因导入到宿主细胞中,进而通过细胞表达系统产生大量的E2蛋白。

接下来,需要对E2蛋白进行纯化和浓缩处理。

这个步骤的目的是去除其他杂质分子,提高E2蛋白的纯度和浓度。

纯化和浓缩可以使用多种方法,如蛋白质层析、离心、凝胶过滤等。

在获得高纯度的E2蛋白后,需要将其包装成亚单位疫苗。

包装可以使用不同的载体或途径,如微球或脂质体。

这些载体可以提高E2蛋白的稳定性和免疫原性。

同时,还可以将其他辅助物质添加到疫苗中,如佐剂,以增强免疫效果。

接下来是非洲猪瘟亚单位疫苗的灭活处理。

这一步骤是为了确保疫苗中病毒失去活性,从而避免疫苗引起疾病的风险。

灭活可以通过化学处理、热处理或其他方法来实现。

在灭活处理后,疫苗需要进行质量控制检验,确保符合国际标准。

非洲猪瘟亚单位疫苗的生产国标是指制定和统一各国在疫苗生产过程中所需遵守的规范和要求。

猪圆环病毒基因结构及疫苗研究进展

猪圆环病毒基因结构及疫苗研究进展

猪圆环病毒基因结构及疫苗研究进展作者:杨大洪来源:《农家致富顾问·下半月》2017年第03期摘要猪圆环病毒在各养猪国家广泛流行,发病猪死亡率10%~30%不等,随着规模化养殖业的不断发展,由PCV-2引起的疫病呈上升趋势,给全世界养猪业带来了巨大的经济损失,同时也给各国科研人员带来了新的挑战和任务。

本文针对对猪圆环病毒及其疫苗进行了论述,以期对猪圆环病毒病的防治起到一定的指导意义。

关键词猪圆环病毒;研究进展猪圆环病毒病是危害全球养猪业的重大经济影响性疾病,也是我国养猪业的三大疾病之一,与猪瘟和猪蓝耳病并称我国养猪业的三座大山[1]。

目前研究中已分离获得2个不同血清型的猪圆环病毒(PCV),并命名为猪圆环病毒1型(PCV-1)和猪圆环病毒2型(PCV-2)。

研究表明,PCV-1对猪无致病性,而PCV-2不仅是断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的病原,而且能够引起多种猪病。

1 猪圆环病毒的基因结构猪圆环病毒粒子为正二十面体对称结构,大小为17-20 nm,无囊膜,PCV2对外界环境的抵抗力较强,在0℃可存活数天,56℃15min不能将其灭活。

PCV1与PCV2基本上没有交叉反应[2],是迄今为止发现的一种最小的动物病毒。

根据猪圆环病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列的差异, PCV 被划分为无致病性PCV-1和致病性PCV-2两个基因型。

PCV基因组为单股环状DNA , PCV-1 基因组全长为1759bp , PCV-2 基因组全长为1767bp和1768bp ,两者的同源性为68 %~76 %。

PCV-2 基因组共编码11个开放阅读框(ORFs), ORF1-ORF11 ,ORF1 、ORF5 、ORF7 、ORF10位于病毒DNA链上,ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9、ORF11则由互补链编码,其中ORF1、ORF2是两个最大的阅读框,目前仅发现ORF1、ORF2、ORF3 编码蛋白,还未见有其他蛋白研究[3] 。

可用于非洲猪瘟的几种抗病毒药物

可用于非洲猪瘟的几种抗病毒药物

非洲猪瘟病毒(ASFV)具有双层囊膜结构,基因组为线性双链DNA分子,是非洲猪瘟病毒科(Dixon et al.2005)唯一的成员。

ASFV根据其B646L基因(一种编码p72的基因) (Quembo et al.2018)可分为24个不同的基因型。

由于ASFV 基因组可编码多种蛋白质,从而抑制和逃避宿主的免疫应答反应,使得ASF至今尚无有效疫苗用于防控。

在没有ASFV 疫苗的情况下,价格合理的抗病毒药物可产生非常有效的作用,通过抗病毒药物治疗和控制动物病毒感染是一种可推广方法。

因此,开发应用于动物的抗病毒药物与开发针对人类病毒的抗病毒药物同样重要。

ASFV的复制周期包括病毒附着、内在化、基因组增殖、子代病毒的组装和释放等几个步骤(Galindo et al.2015)。

能够直接或间接地阻断这些步骤之一的特异性药物可以成为抑制ASFV感染的潜在工具。

1几种抗病毒化合物IFNs在60多年前首次被鉴定为具有强抗病毒活性的可溶性糖蛋白(Isaacs et al.1957)。

早期研究表明,猪IFN-γ蛋白能显著抑制ASFV产物。

IFN-α和IFN-γ有协同抑制作用。

此外,IFN-α的持续治疗可能治愈由ASFV引起的细胞溶解和持续性感染的Vero细胞(Paez et al.1990)。

最近,Portugal et al(2018)表明,PKR,mx?, ISG15和Bst-2基因在细胞感染低毒性ASFV表达水平较高,暗示高度毒性ASFV株拥有逃避干扰素反应的进化机制(r?czyk et al.2016)。

有报道称,与对照组细胞相比,试验组除了MxB蛋白,MxA蛋白的表达也增加了100倍(Netherton et al.2009)。

这种对ASFV的抑制作用与MxA蛋白被募集到细胞核周病毒装配位点有关,在那里,它与ASFV粒子的相互作用类似于MxA和RNA病毒之间的相互作用。

植源化合物因其治疗潜力而受到越来越多的关注。

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种 功 能 蛋 白 ,对 病 毒 的免 疫 、识 别 、吸 附 和 进 入 宿 主 细 胞
十 分 重 要 。 它 可诱 导机 体 产 生 中 和 抗 体 ,用 其 免 疫 猪 可 诱 导
产 生 对 致 死 剂 量 的 保 护 性 免 疫 反 应 .也 是 病 毒 粒 子 吸 附 进 入
pl A oy()尾 巴结 构 ,在 所 有 瘟 病 毒 中 高 度 保 守 ,其 参 与 病 毒 基 因组 的复 制 、 多 聚蛋 白 的 翻译 和 病 毒 粒 子 的装 配 。猪 瘟 病 毒 的 O F翻 译 一 个 3 9 R 8 8个 氨 基 酸 的 多 聚 蛋 白 。 该 蛋 白在 细 胞 内 蛋 白 酶 和病 毒特 异 性 的 蛋 白酶 作 用 下 裂 解 成 各 种 成 熟 的
和 性 .N 2 3蛋 白为 双 功 能 蛋 白 ,具 有 丝 氨 酸 蛋 白酶 活 性 、 S—
核苷 i磷酸酶活性及 解旋酶 活性 ,其解旋作用 依赖于 C F SV
特 异 的单 链 R A,该 蛋 白在 病 毒 的 生 命 周期 中 至关 重 要 。还 N 有 其 他 一 些 非 结 构 蛋 白 ,比如 N 4 和 N 4 、N 5 SA SB S A和 N 5 SB 这 些非 结 构蛋 白的研 究还 不 多 ,其 中 N 5 S B也 与病 毒 复制 有关 。 2 猪瘟 病 毒 蛋 白表 达 技 术 21 原核 表 达 . 在 各 种 表 达 系 统 中 ,最 早 被 采 用 进 行 研 究 的 是 原 核 表 达 系 统 .这 也 是 目前 掌 握 最 为 成熟 的 表 达 系 统 。该 项 技 术 的 主 要 方 法 是 将 已 克 隆 人 目的 基 因 D A 片 段 的 载 体 ( 般 为 质 N 一
复 杂 的二 级 结 构 ,无 甲基 化 帽 子 结 构 。5 ’端 U R 与 病 毒 的 T 复 制 和 翻译 都 密 切 相 关 。3 ’端 U R 长 度 为 2 5 2 9 t T 1 ~ 3 n .无
染细 胞培 养上 清 液 中的 糖 蛋 白 。E s 是 一 个 结 构 蛋 白 又是 o r 既
N 4 、NS B、 NS A 和 NS B。 sA 4 5 5 11 结 构 蛋 白及 其 功 能 .
和爆 发 做 好 准备 。 同 时 .加 强 猪 瘟 病 毒 诊 断 中各 技 术 的研 究 对 预 防 和 控 制 本 病 具 有 非 常 重 要 的 现 实 意 义 。 本论 文 对 猪 瘟 病 毒 基 因组 结 构 和诊 断 技 术 中的 蛋 白表 达 技 术进 行 了 系统 的
阐述 。
111 C蛋 白 . .
C蛋 白也 称 p 4 1 ,是 病 毒 的 核 衣 壳 蛋 白 , 由 多 聚 蛋 白 上 Sr6 一 l27之 间 的氨 基 酸 组 成 .分 子量 为 1k a 在瘟 病 e19 A a6 4D 。
毒 ,C蛋 白 是 主要 区域 中极 为保 守 的 蛋 白 ,同源 性 大 于 9 %。 1 C蛋 白 N端 由 N r p o的水 解 作 用 而 产 生 ,C端 可 能 是 由宿 主 细 胞 的 信 号 肽 酶 作 用 所 致 。C蛋 白在 合 成 后 几 分 钟 便 与 基 因组
的研 究 表 明 .E 2蛋 白 的 抗 原 区 主 要 集 中在 蛋 白分 子 的 N 端 区 域 6 0a 86 a 9 a ~ 6 a ,包 含 4个 抗 原 结 构 域 ,即 A、B、C 、D。 E 2的 C端 有 一 段 核 心 序 列 为 Y E ( 9 ~ 9 a ) Y P 9 5 9 8 a ,存 在 于 一 个 线 性 表 位 中 ,该 表 位 被 认 为 是瘟 病 毒 共 有 的抗 原 表 位 。序
病 毒 颗 粒 构 型 的 主要 结 构 蛋 白 。 同 时 ,动 物 实 验 说 明 E 1蛋 白对 猪瘟 病 毒 的繁 殖 有 重 要 作 用 ,但 作 用 机制 不 明 了 。
11 E .. 2蛋 白 4
N 2 3蛋 白也 是 C F 中一 个 非 结 构 蛋 白 ,所 有 感 染 猪 S— SV 瘟 的 动 物 体 中 均产 生 N 2 3的抗 体 ,但 N 2 3 具 有 病 毒 中 S— S— 不
列 T V P L ( 2 ~ 3 a ) 表 位 在 猪 瘟 病 毒 中高 度 保 守 , A S 丌 R 8 9 8 7a 可 以作 为 鉴 别 牛 病 毒 性 腹 泻 病 毒 和 羊 边界 病 病 毒 的依 据 。
12 非 结 构 蛋 白 .
物 纯 化 困难 : 而 且 原 核 表 达 系 统 翻 译 后 加 工 修 饰 体 系 不 完

资源育繁 l
猪瘟病毒 基 因组蛋 白结构及 蛋 白表达 技术 的研 究进展
张 月 兰邹然 王贵 升 孙 圣福 ( 东省动 物疫病预 防与控 制 中心 2 0 2 ) 山 5 0 2
摘 要 :猪 瘟是 威 胁 许 多 国 家 包括 我 国 在 内的 养 猪 业 的 重 要 疾 病 之 一 ,随 着 猪 瘟病 毒 ( S V) 的 突 变性 发展 ,从 分 子 水 平 CF
粒 )转 化 细 菌 ( 常 选 用 的是 大 肠 杆 菌 ) 通 ,通 过 IT P G诱 导 并
最 终 纯 化 获 得 所 需 的 目的蛋 白 。 其 优 点 在 于 能 够 在 较 短 时 间 内获 得 基 因表 达 产 物 。 而且 所 需 的成 本 相 对 比较 低 廉 。但 与
此 同 时 原 核 表 达 系 统 还 存 在 许 多难 以 克 服 的 缺 点 :如 通 常 使
E 2糖 蛋 白 由 O F 9 ~ 0 0位 编 码 的 3 0个 氨 基 酸 残 疾 R 6 0 16 7 组 成 ,根 据糖 基 化 程 度 的 不 同 ,分 子 量 在 5  ̄ 5 u之 间 内变 15k 动 。 它位 于 病 毒 囊 膜 表 面 ,参 与病 毒 的 感 染 过 程 ,是 猪 瘟 病 毒 的 编码 蛋 白中 最 不 保 守 的一 种 蛋 白 ,但 是 猪 瘟 病 毒 的 最 主
存 在 于病 毒 粒 子 表 面 或 被 分 泌 到 胞 外 ,是 唯 一 可 以 分 泌 到 感
的 囊 膜 包 裹 ,内 部 为 二 十 面 体 的对 称 核 衣 壳 。核 心 直 径 大 约 3h O m。 核 衣 壳 内包 裹 单 股 正 链 线 性 R A分 子 ,基 因组 大 约 N 1. b 5 25 。 ’端 U R 长 度 为 3 3 t 3 4 t k T 7n 或 7 n,有 茎 环 、 发 卡 等
探 索 C F 基 因组 及 蛋 白 结 构及 功 能 .可 以 为 预 防 猪 瘟 流行 SW 结 构 蛋 白 ( )和 非 结构 蛋 白 ( S 。从 N端 开始 至 C端 各 蛋 S N ) 白 质 分 别 是 N r 、 C E s E 、 E 、 p 、 N 2 N 3 po 、 r 、 1 o 2 7 S、 S、
R A 相结 合 ,包 装 形 成 核 衣 壳 ,除 此 之 外 ,还 在 病 毒 繁殖 和 N 基 因表 达 调 控 中 有 着 重要 作 用 。但 是 以 C基 因为 基 础 构 建 的 重 组 痘 苗 病 毒 活 载 体 疫 苗 免 疫 猪 ,不 能 诱 导 机 体 产 生 中 和 性 抗 体 ,无 法 保护 猪 免 受 强 毒 的攻 击 。
112 os蛋 白 .. Er
率较 高 ,给养 猪业 造 成 巨 大 的 经 济 损 失 , 国际 动 物 卫 生 组 织
将 此 病 被 列 为 A类 传 染 病 之 一 。世 界 上 .包 括 亚 洲 、欧 洲 、 中 南 美 洲 、部 分 非 洲 等 许 多 国家 采 取 了大 规 模 的疫 苗 防 控 净 化 措 施 ,但 是 猪 瘟 仍 然 普 遍 存 在 。 2 0世 纪 2 0年 代 我 国 首 次
易 感 细胞 的 必 须 蛋 白 。 En 还 具 有 R A 酶 活 性 ,对 病 毒 宿 rs N 主和 细 胞 嗜性 、致 病 性 、细 胞 凋亡 等 方 面 起 重要 作用 。
113 .. E1蛋 白
E 1糖 蛋 白 由病 毒 O F上 L u9 ~ l6 9之 间 15个 氨 R e 4 5 Gy8 9
对 该 病 进 行 了报 道 ,此 后 的 几 十 年 里 , 疫 情 接 连 不 断 的 发 生 。 15 9 4年 。Z o h u等 0 研 发 的 猪瘟 兔 化 弱 毒 疫 苗 虽 然 较 好 1
E n 蛋 白 由病 毒 O F G u 6 一 14 4之 间 的 2 7个 氨 基 rs R l2 8 A a 9 2 酸 残基 组成 ,是 一 种 高 度 糖 基 化 的 蛋 白 。 分 子 量 大 小 依 据 糖 基 化 程 度 的 不 同 而 不 同 . 为 4 ~ 8 D, 糖 蛋 白 分 子 量 约 占 4 4k E s总蛋 白分 子 量 的二 分 之 一 ,去 糖 基 的 蛋 白骨 架 分 子 量 约 o r
关 键 词 : 猪 瘟 病 毒 ; 基 因组 结 构 ;蛋 白表 达 技 术 ;技 术 应
用:研 究 进展
猪 瘟 ( l s a s i vr S )为 黄 病 毒 科 瘟 病 毒 属 Ca i l wn f e,C F sc e e 成员 ,是 严 重 危 害养 猪 业 的 传 染 病 之 一 ,传 染 性 很 强 ,致 死
123 ._ NS蛋 自
E 1与 E 2以异 源 二 聚 体 的形 式 存 在 , 目前 还 未 发 现 病 毒 免 疫 血 清 中有 抗 E 1的抗 体 。关 于 其 蛋 白 的研 究 很 少 ,E 1不 能 诱 导机 体产 生 中 和 抗 体 ,在 病 毒 中 ,E 一 2复 合 物 可 能 是 稳 固 1E
作 者 简介 : 张 月 ( 9 26 ,女 , 汉 , 山 东省 济 南 市人 ,硕 士 .研 究方 向 :动 物 疫 病 的预 防与 控 制 。 1 8 .一)
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