猪瘟病毒蛋白与功能
非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测摘 要：p30蛋白是非洲猪瘟病毒（ASFV ）免疫原性最强的结构蛋白之一，由CP204L 基因编码。
本研究利用Bac-to-Bac 昆虫杆状病毒真核表达系统将ASFV 中CP204L 插入pFastBac1载体下游，将形成的重组质粒pFastBac-p30以转座子的形式插入到DH10Bac 中的杆状病毒穿梭质粒（Bacmid ）中，筛选出重组Bacmid-p30后，将Bacmid-p30转染Sf9细胞，并继续传代3次，获得重组杆状病毒，命名为rBac-p30。
分别通过间接免疫荧光（IFA ）和免疫印迹（Western blot ）鉴定了ASFV 阳性血清可特异性识别Sf9细胞中表达的p30。
以此真核表达p30蛋白包被ELISA 板，可区分ASFV 阴阳性血清。
以上结果表明，本研究初步建立了检测ASFV 血清抗体的间接ELISA 方法，为后续建立非洲猪瘟抗体检测方法和p30亚单位疫苗研究奠定基础。
关键词：非洲猪瘟病毒；p30蛋白；杆状病毒表达系统中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）04-0170-06Production and Immunological Detection of African Swine Fever Virus p30 byBaculovirus Expression SystemLIAO Xinxin 1,2, ZHONG Qiuping 2, SHI Xinjin 2, WEI Changqing 2, SUN Haiwei 2, LIU Yingnan 2,AO Qingying 2, XIE Zhenhua 2, WU Jing 1, CHEN Hongjun 2(1. Hunan Engineering Research Center of Livestock and Poultry Health Care, Colleges of V eterinary Medicine, Hunan Agricultural University,Changsha 410128, China; 2. Shanghai V eterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)收稿日期：2021-11-01基金项目：十三五国家重点研发专项资助项目（2018YFC08400400，2017YFD0502300）；自然科学基金联合基金项目重点支持项目-区域创新发展联合基金项目（U19A2039）作者简介：廖欣欣，女，硕士研究生，临床兽医学专业通信作者：邬静，E-mail：****************.cn；陈鸿军，E-mail：***************.cn Abstract: The p30 protein encoded by CP204L gene is one of the most immunogenic structural proteins of African swine fever virus (ASFV). In this study, the Bac-to-Bac insect baculovirus eukaryotic expression system was used to insert CP204L in ASFV into the downstream of pFastBac1 vector, and the resulting recombinant plasmid pFastBac-p30 was inserted into Baculovirus shuttle plasmid (Bacmid) in DH10Bac as a transposon. After screening the recombinant Bacmid-P30 was transfected into Sf9 cells, and the recombinant Baculovirus rBac-p30 was obtained expression of p30 protein. Indirect immunofl uorescence (IFA) and Western blot were used to identify p30 expression in Sf9 cells by ASFV positive serum specifi city. The recombinant p30 protein was used to coat ELISA plates to distinguish positive and negative serum samples of ASFV . The development of an indirect ELISA method laid the foundation for further establishment of an ASFV antibody detection method and p30 subunit vaccine research.Key words: African Swine fever virus; p30 protein; baculovirus expression system2023,31(4):170-175廖欣欣1,2，钟秋萍2，史馨瑾2，魏常青2，孙海伟2，刘英楠2，敖清莹2，谢振华2，邬 静1，陈鸿军2（1.湖南农业大学动物医学院 畜禽保健湖南省工程研究中心，长沙410128；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241· 171 ·廖欣欣等：非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测第31卷第4期非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的猪的一种热性、急性、高度接触性传染病[1]。
非洲猪瘟流行特点及临床检测
48 | 2020年第40卷第12期 总第287期 |非洲猪瘟流行特点及临床检测顾永远1，钱忠辉2，张华弟2，王瑞阳2，张春玲2*(1.上海市闵行区三农综合服务中心，上海 201109；2. 上海佳牧生物制品有限公司，上海201403)非洲猪瘟(Africa Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africa Swine Fever Virus，ASFV)引起的一种急性、出血性、烈性、高度接触性传染病，发病率高，死亡率高，可达100％，世界动物卫生组织将其列为必须报告的动物疫病，我国将该病列为一类动物疫病。
非洲猪瘟于1921年首次在非洲东部的肯尼亚地区暴发，之后在非洲大部分国家和地区流行。
在最初的几十年中，非洲猪瘟一直在非洲暴发，并未传播到其他洲。
直到1957年，非洲猪瘟在欧洲的葡萄牙被发现，之后开始在欧洲其他国家流行。
2007年，非洲猪瘟传入格鲁尼亚，很快侵入俄罗斯。
2018年8月，我国首例非洲猪瘟在辽宁省沈阳市暴发，之后在短短的一年时间内各个地区相继暴发，给养猪业带来了极大的经济损失，由此导致猪肉价格的持续上涨，严重破坏了市场交易秩序。
目前，中国养猪业进入后非洲猪瘟时代，清楚地了解非洲猪瘟的流行特点，认真严谨地做好临床检测对确保养猪生产正常进行至关重要。
1 非洲猪瘟病毒1.1 病毒的形态和结构ASFV 是一种单分子线状双链DNA 病毒，是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属唯一的成员，也是迄今发现的唯一的DNA 虫媒病毒。
ASFV 呈二十面体对称，在胞浆内复制，病毒直径为175 nm ～215 nm，病毒粒子由内到外依次为核质体、核衣壳、囊膜，囊膜又分为内层和外层。
国际病毒分类委员会在第六次报告中将ASFV 列入“类非洲猪瘟病毒属”，1998年正式将其列入非洲猪瘟病毒科，2005年最终将其列为非洲猪瘟病毒属。
ASFV 的DNA 核心位于病毒中间，二十面体衣壳与含类脂的囊膜形成病毒外周。
病毒粒子的结构蛋白有很多种，其中p72蛋白位于病毒衣壳的表面，是二十面体衣壳的重要组成部分，具有良好的反应原性和抗原性。
猪瘟病毒主要抗原蛋白研究进展
抑制试验表明 ，猪瘟病毒最初结合到细胞上是通过 Ｅ ０蛋 白
介导 的 ， 试验还证 实 ， Ｅ ０ Ｃ端的肽段（ ４ ８ ０ 一 Ｋ Ｋ Ｌ Ｅ Ｎ Ｋ Ｓ Ｋ 一 ４ ８ ７ ） 是相互作用所必须的。
２ ． ２ Ｅ ２蛋 白
Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ的基 因组大小约 １ ２ ． ３ ｋ ｂ ， 由５ ’ 端非编码 区， 开放阅 读框和 以及 ３ 。 端非编码 区三部分组成 。 开放阅读框编码 一个
病毒表达 了 Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ Ｅ ２（ 不包 括跨膜 区） ，Ｅ ２的 Ａ区及 Ｅ ２的
Ｍ 或Ｅ Ｄ Ｔ Ａ的影 响 ，但 能够被 ｚ ｎ “离 子抑 制。Ｅ ０对 Ｄ Ｎ Ａ 没有活性 ，只作用于 Ｒ Ｎ Ａ，对富含 Ｕ序列活性最高 。Ｅ ０的
Ｒ Ｎ ａ ｓ ｅ活性 能够影 响宿主细胞 中病 毒 Ｒ Ｎ Ａ的复制 ，并且对
专 论 与 综 述
猪瘟病 毒主 要 抗 原 蛋 白研 究进 展
余 姣
（ 西南 大学 动物 科技 学 院 ，重庆 ４ ０ ０ ７ １ ５）
摘 要： 猪 瘟病毒是黄病毒科瘟病毒属成 员， 能引起各种年龄段猪 的急性 、 热性和 高度致死性的传染病。本文就猪 瘟
病毒 的分类 、 形态及及病毒 的基 因组 结构进行 了综述 ， 并 对其 编码的几种 主要 抗原蛋 白 Ｅ ０ 、 Ｅ ２ 、 ＮＳ ３的功 能等进行
Ｅ ０是一种尿 嘧啶特异的有神经毒性 、 抗蠕虫和免疫抑制活性 ， 其活
性在 ｐ Ｈ ４ ． ５ ～ ６ ． ５时最高 ， 最适温度为 ５ ５ ℃， 酶活性不受 ｃ ａ 、
助于从疫 苗接种猪群 中筛查 出野毒感染猪。Ｖ ａ ｎ等利用杆状
了 简要 介 绍 。
关键词 ： Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ； Ｅ ０ ； Ｅ ２ ； ＮＳ ３ ＤＯ ｌ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ Ｊ ． Ｉ ＳＳＮ． １ ６ ７１ — ６ ０ ２ ７ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ４ ． ０ ０ ５
猪瘟(CSF)
2.新型疫苗
• 猪瘟病毒基因缺失型弱毒疫苗 • 猪瘟病毒亚单位疫苗 • 猪瘟病毒活载体疫苗 • 猪瘟病毒核酸疫苗 • 猪瘟病毒全长感染性cDNA标记疫苗
①猪瘟病毒基因缺失型弱毒疫苗
• 当某些与病毒复制无关的毒力基因缺失突变后， 病毒毒力丧失或明显减弱，但病毒复制能力并不 丧失，同时还保持着良好的免疫原性
七、疫苗研究进展
• 近年来国内外应用单克隆抗体对C株检测时发现有不同的 反应模式，猪瘟兔化弱毒疫苗免疫失败也有报道，提示随 着传代次数的增加和对不同细胞的适应性繁殖，疫苗毒株 可能发生异质性或抗原漂移 • 加之数十年来猪瘟病毒在大规模免疫接种压力下出现抗原 变异，现有的传统疫苗己不能完全适应新形势的需要 • 研究和开发新型猪瘟疫苗已成大势所趋，而分了生物学技 术的发展，为新型猪瘟疫苗的研究和开发奠定了基础
患猪肾脏肿大、点状出血
患猪肾脏皮质出血、髓质水肿
左：肾脏小点出血 右：肾皮质区域小点出血，肾盂粘膜出血斑块
患猪扁桃体出血
患猪喉头点状出血
患猪喉头坏死
患猪肺脏点状出血
患猪胃粘膜斑点状出血
左：肺散在出血斑点 右：胃粘膜有出血斑点
混合型猪瘟，肺大理石样变化
左：心外膜出血 右：心内膜出血
患猪肠浆膜点状出血、胶样渗出
结肠粘膜上的单个“纽扣状肿”
盲、结肠粘膜上单个及融合溃疡
肠道粘膜出血
盲结肠扣状肿
患猪膀胱粘膜点状出血
患猪脑水肿、脑脊液增多
脾出血性梗死，脾脏边缘呈紫黑色，边界清楚的隆起斑块
诊断
• 尸体剖检中，诊断性的病理变化为淋巴结、肾脏 和其它器官的出血以及脾脏梗死 • 实验室诊断方法包括：血清学诊断、分子生物学 诊断
猪瘟（CSF）
2025届高中生物学一轮复习检测案43 基因工程及生物技术的安全性与伦理问题(含解析)
检测案43基因工程及生物技术的安全性与伦理问题[基础巩固练]1．下列关于基因工程的叙述，错误的是（）A．目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物B．限制性内切核酸酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶C．人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性D．载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达2．[2024·九省联考·安徽]依据《中华人民共和国生物安全法》，生物安全是指国家有效防范和应对危险生物因子及相关因素威胁，生物技术能够稳定健康发展，人民生命健康和生态系统相对处于没有危险和不受威胁的状态，生物领域具备维护国家安全和持续发展的能力。
下列叙述错误的是（）A．高致病性微生物须在高等级生物安全实验室中开展实验活动B．生物技术可广泛应用在人类自身基因组改造和新物种创造中C．外来入侵物种可能增加本土食物来源却给自然生态造成破坏D．动物饲料中的抗生素会通过食物链使人体微生物耐药性增强3．下列有关生物技术安全性和伦理问题的观点，不合理的是（）A．对于转基因技术，我们应该趋利避害，理性看待B．我国禁止生殖性克隆和治疗性克隆C．我国不发展、不生产、不储存生物武器，并反对其扩散D．对于基因检测应该保护个人遗传信息隐私权[提能强化练]4．[2024·九省联考·江西]萤火虫的荧光素酶能催化ATP激活的荧光素氧化发光，这一现象在生物检测和成像方面有重要的应用价值。
为了解决天然荧光素酶不能高效催化人工合成的荧光素DTZ发光的问题，研究人员采用蛋白质工程（又称为第二代基因工程）对它进行了改造。
下列关于蛋白质工程改造天然荧光素酶的叙述，正确的是（）A．通过化学诱变剂可定向改造天然荧光素酶的基因序列B．改造天然荧光素酶所用的基因表达载体不需要启动子和终止子C．可用PCR方法检测突变的荧光素酶基因是否翻译成蛋白质D．改造后的荧光素酶在一定条件下催化DTZ发光是将化学能转化为光能5．[2024·九省联考·甘肃]胰岛素可用于治疗糖尿病，我国科学家打破国外技术垄断，研发了拥有自主知识产权的重组人胰岛素药物，下列叙述错误的是（）A．用PCR技术扩增人胰岛素基因时，每次循环包括变性、复性、延伸三步B．构建人胰岛素基因表达载体时，需使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶C．大肠杆菌细胞经Ca2＋处理后，更容易吸收重组的人胰岛素基因表达载体D．抗原—抗体杂交法能检测人胰岛素基因表达载体是否导入大肠杆菌细胞6．（不定项）人染色体DNA中存在串联重复序列，对这些序列进行体外扩增、电泳分离后可得到个体的DNA指纹图谱。
猪瘟病毒 E0蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备
猪瘟病毒 E0蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备贾俊杰;张必凯;张莉;谢金鑫;郭焕成;龚文杰;涂长春【摘要】为表达猪瘟病毒 E0蛋白并制备其多克隆抗体，本研究构建 E0蛋白的原核表达载体，转化至BL21（DE3）菌株，IPTG 诱导表达，亲和层析及切胶回收纯化重组蛋白。
SDS-PAGE 和 Western blot 分析显示 E0重组蛋白主要以包涵体形式表达，亲和层析纯化获得了 E0重组蛋白，用其免疫 Balb／c 小鼠4次制备E0重组蛋白的多克隆抗体。
间接 ELISA 显示，免疫小鼠血清中 E0蛋白抗体效价为1∶50000。
获得的 E0蛋白多抗能与病毒感染细胞及 E0-EGFP 融合表达细胞中天然结构的 E0蛋白发生特异性反应。
本研究制备的 E0重组蛋白及其多克隆抗体为进一步研究 E0蛋白的功能和免疫原性奠定了基础。
%To express E0 protein of CSFV and prepare its polyclonal antibodies (pAb),the recombinant E0 protein of CSFV Shimen strain was expressed in E.coli BL21(DE3)with IPTG induction and successively purified by affinity chromatography and gel slice.Balb/c mice were immunized four times with the purified recombinant E0 protein.SDS-PAGE and Western blot analysis showed that recombinant protein was ex-pressed mainly in the inclusion body.The indirect ELISA showed that the antibody titers in the serum of immunized mice was at 1:50000.Moreover,the obtained anti-E0 pAb can specifically react with the E0 pro-tein expressed in virus-infected cells and E0-EGFP-expressing cells.The obtained E0 protein and its poly-clonal antibodies in this study will be useful for future studies on the function and immunogenicity of CSFV E0 protein.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2016(037)005【总页数】6页(P5-9,10)【关键词】猪瘟病毒;E0蛋白;原核表达;多克隆抗体【作者】贾俊杰;张必凯;张莉;谢金鑫;郭焕成;龚文杰;涂长春【作者单位】军事医学科学院军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130122;军事医学科学院军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130122;军事医学科学院军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130122;军事医学科学院军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130122;军事医学科学院军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130122;军事医学科学院军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130122;军事医学科学院军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春 130122【正文语种】中文【中图分类】S852.651猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的以免疫抑制和高病死率为主要特征的急性热性传染病。
古典猪瘟病毒基因组及ORF编码蛋白的结构和功能
古典猪瘟病毒基因组及ORF编码蛋白的结构和功能朱小甫;吴旭锦;徐德乾;杨萍【摘要】Classical swine fever was a serious disease hazard pig industry, studying classical swine fever virus of molecular biology could reveal viral replication and pathogenesis, find key sites of immune protection, and lay the foundation for the development of new vaccines. This paper summarized recent classical swine fever virus genome research and related proteins, ma-ded for future research prospects.%古典猪瘟是严重危害养猪业发展的重要疫病之一,对古典猪瘟病毒的分子生物学研究能揭示病毒复制和致病机理,寻找免疫保护关键位点,为新型疫苗开发奠定基础.文章综述了近年对古典猪瘟病毒基因组和相关蛋白的研究成果,对以后的研究方向作了展望.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2012(039)005【总页数】5页(P183-187)【关键词】古典猪瘟;基因组;蛋白;分子流行病学【作者】朱小甫;吴旭锦;徐德乾;杨萍【作者单位】咸阳职业技术学院生物科技系,动物疫病分子生物学诊断实验室,陕西咸阳712000;咸阳职业技术学院生物科技系,动物疫病分子生物学诊断实验室,陕西咸阳712000;咸阳职业技术学院生物科技系,动物疫病分子生物学诊断实验室,陕西咸阳712000;咸阳市动物疫病预防控制中心,陕西咸阳712000【正文语种】中文【中图分类】S852.65+1古典猪瘟（classical swine fever，CSF）是由古典猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的一种高度接触性传染病，迄今仍是中国最重要的猪传染病之一，每年引起猪发病死亡的损失巨大，因此中国农业部将其列为一类传染病。
猪瘟病毒基因组蛋白结构及蛋白表达技术的研究进展
种 功 能 蛋 白 ，对 病 毒 的免 疫 、识 别 、吸 附 和 进 入 宿 主 细 胞
十 分 重 要 。 它 可诱 导机 体 产 生 中 和 抗 体 ，用 其 免 疫 猪 可 诱 导
产 生 对 致 死 剂 量 的 保 护 性 免 疫 反 应 ．也 是 病 毒 粒 子 吸 附 进 入
ｐｌ Ａ ｏｙ（）尾 巴结 构 ，在 所 有 瘟 病 毒 中 高 度 保 守 ，其 参 与 病 毒 基 因组 的复 制 、 多 聚蛋 白 的 翻译 和 病 毒 粒 子 的装 配 。猪 瘟 病 毒 的 Ｏ Ｆ翻 译 一 个 ３ ９ Ｒ ８ ８个 氨 基 酸 的 多 聚 蛋 白 。 该 蛋 白在 细 胞 内 蛋 白 酶 和病 毒特 异 性 的 蛋 白酶 作 用 下 裂 解 成 各 种 成 熟 的
和 性 ．Ｎ ２ ３蛋 白为 双 功 能 蛋 白 ，具 有 丝 氨 酸 蛋 白酶 活 性 、 Ｓ—
核苷 ｉ磷酸酶活性及 解旋酶 活性 ，其解旋作用 依赖于 Ｃ Ｆ ＳＶ
特 异 的单 链 Ｒ Ａ，该 蛋 白在 病 毒 的 生 命 周期 中 至关 重 要 。还 Ｎ 有 其 他 一 些 非 结 构 蛋 白 ，比如 Ｎ ４ 和 Ｎ ４ 、Ｎ ５ ＳＡ ＳＢ Ｓ Ａ和 Ｎ ５ ＳＢ 这 些非 结 构蛋 白的研 究还 不 多 ，其 中 Ｎ ５ Ｓ Ｂ也 与病 毒 复制 有关 。 ２ 猪瘟 病 毒 蛋 白表 达 技 术 ２１ 原核 表 达 ． 在 各 种 表 达 系 统 中 ，最 早 被 采 用 进 行 研 究 的 是 原 核 表 达 系 统 ．这 也 是 目前 掌 握 最 为 成熟 的 表 达 系 统 。该 项 技 术 的 主 要 方 法 是 将 已 克 隆 人 目的 基 因 Ｄ Ａ 片 段 的 载 体 （ 般 为 质 Ｎ 一
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有待进一步发现其他非结构蛋白对病毒毒力的影响
诱导免疫应答相关蛋白-结构蛋白E2
• CSFV糖蛋白中E2是最主要的免疫原性蛋白，其能够诱导机体 产生中和抗体并且能够保护CSFV强毒的攻击。 • E2的抗原位点主要分布在N 端690-866 位氨基酸残基上，分为 4 个抗原区：A、B、C 和D 区，分别位于766-865、690-799、 690-799和775-788位氨基酸残基之间。 • 693-716肽段可提供免疫保护（Dong et al，2006）。 • 目前报道的E2蛋白抗原表位主要位于775-865和775-812。 • E2单克隆抗体WH303识别一个在CSFV 中高度保守的表位， 其表位829TAVSPTTLR837（Lin et al，2000）。 • 我们小组鉴定771LLFDGTNP778为一保守的线性抗原表位 （Peng et al，2008）。
病毒复制相关蛋白
• CSFV NS5B蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶活性（RdRp） （Xiao et al，2002）。 • CSFV的复制起始于NS5B蛋白结合病毒的3-NCR，从而起始 病毒RNA的复制（Steffens et al，1999）。 • NS5A以及NS4B与NS5B蛋白能形成高度有序的复制酶复合体， 共同对CSFV的复制起作用（Sheng et al，2010）。 • NS3蛋白的RNA解旋酶活性能够提高病毒的翻译（Xiao et al，
2008）。
病毒复制相关蛋白-假说A
Moulin et al, 2007
• NS2通过与细胞的辅助因子Jiv的作用，将NS2-3蛋白剪切 成NS2、NS3蛋白，其中NS3蛋白与NS4A、NS4B、NS5A、 NS5B形成蛋白复制复合体，起始病毒的复制。
病毒复制相关蛋白-假说B
Moulin et al, 2007 • 非剪切的NS2-3蛋白与NS4A、NS4B、NS5A、NS5B形成蛋 白复制复合体，起始病毒的复制。非剪切的NS2-3蛋白与 NS4A形成的复合物有利于感染性病毒粒子形成。
问题和展望
• CSFV与宿主相互作用的机制仍有待阐清，特别 是在对宿主细胞的调控上，CSFV是如何通过自 身蛋白与宿主蛋白发生相互作用，从而帮助病毒 在细胞内进行复制和增殖。 • 目前对于CSFV细胞受体方面的研究较少，CSFV 在细胞中的复制和增殖需要多个受体的参与，进 一步鉴定CSFV的受体将为深入了解病毒提供帮 助。 • 通过研究CSFV与宿主细胞相互作用蛋白和通路， 能为进一步研究CSFV致病机理提供线索，为猪 瘟的防控寻找到新的途径。
病毒复制相关Leabharlann 白• 目前关于CSFV的复制过程仍不清晰，参与病毒复制的蛋 白及其在病毒复制过程中的作用仍需要进一步深入研究。
宿主细胞嗜性相关蛋白
• 有研究者用CSFV的E2基因替换BVDV的E2基因， 拯救的嵌合BVDV能够感染PK-15细胞，并且在 PK-15细胞中培养病毒能够达到较高滴度 （Reimann et al，2004）。因此，E2蛋白可能是 CSFV细胞嗜性的主要决定因素。
Brescia强毒685-686插入19个aa(RB-C22v弱毒)，毒力减弱(Risatti et al, 2005) 糖基化位点806N和875N突变成A，每一个位点突变均导致毒力减弱(Risatti et al, 2007) E2
690 1062
829TAVSPTTLR837(WH303识别位点)对病毒毒力减弱起到重要作用(Risatti
猪瘟病毒
• 猪瘟病毒（classical swine fever virus, CSFV） 属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属 （Pestivirus）成员。 • 单股正链RNA病毒。 • 与BVDV和BDV有血清学交叉反应性。
猪瘟病毒
• 病毒核酸为RNA，含 有唯一ORF，编码一 多聚蛋白。 • 二十面体对称，有囊膜， 直径34-35 nm。 • 病毒抵抗力不强，一般 5-10%石灰乳、2-3% 氢氧化钠、5%漂白粉 可杀死病毒。
NS4A
NS4B NS5A NS5B
参与病毒穿入和吸附的蛋白 及其细胞受体
• 猪瘟病毒感染细胞是通过外膜糖蛋白Erns和E2与细 胞表面蛋白的相互作用介导的。 • Erns与细胞表面受体硫酸乙酰肝素（HS）作用， 帮助病毒吸附细胞表面（Hulst et al, 2009）。 • 猪瘟病毒的E2受体未见报道，我们小组初步证明 宿主细胞蛋白CDx与E2蛋白之间存在相互作用， 可能是E2的一个受体。 • CSFV 病毒蛋白受体将是CSFV研究的一个热点。
猪瘟病毒蛋白的结构与功能
主要内容
• • • • • • • • • 猪瘟和猪瘟病毒 猪瘟病毒的结构蛋白和非结构蛋白 参与病毒穿入和吸附的蛋白及其细胞受体 病毒复制相关蛋白 宿主细胞嗜性相关蛋白 病毒毒力相关蛋白 免疫应答相关蛋白 与宿主相互作用的病毒蛋白 问题和展望
猪瘟
• 猪瘟（classical swine fever, CSF）是猪瘟病 毒引起的急性、发热性、出血性、高度致 死性传染病，死亡率高达80-90%。 • 世界动物卫生组织（OIE）将猪瘟列入须申 报动物疫病名录（ OIE-listed, notifiable disease），我国将其列为一类传染病。 • 可呈急性、亚急性或慢性经过。
E1
E2
猪瘟病毒非结构蛋白
Npro
p7 NS2-3 非结构蛋白
第一个非结构蛋白，抑制IRF3转录，拮抗IFN-/产生
含70个氨基酸残基，分子量为6-7 kDa，参与离子通道？ 进一步加工成NS2和NS3蛋白。存在3种形式，即NS2-3、 NS2和NS3，可能参与CSFV的致细胞病变作用 NS4A是由NS3的蛋白水解酶活性水解多聚蛋白产生的非 结构蛋白，由64个氨基酸残基组成 NS4B含有347个氨基酸残基，NS5A含有496个氨基酸残 基，NS4B和NS5A是病毒复制酶的组成成份 NS5B含有718个氨基酸残基，是病毒复制酶，具有RNA 依赖的RNA酶活性，NS5B识别并起始病毒基因组复制
诱导免疫应答相关蛋白-结构蛋白Erns
• Erns蛋白也可诱导中和抗体，针对Erns蛋白的抗体能够提供对猪 瘟的部分保护作用。 • 研究表明，Erns的抗原位点位于332-412位、351-427位和376487位氨基酸残基中（Lin et al, 2004）。 • 研究发现，Erns 376-412位和376-427 位氨基酸残基为构像依赖 型表位，可识别CSFV感染后所出现的抗体（Lin et al, 2005）。
• CSFV Npro蛋白能够通过抑制IRF3的转录，拮抗I 型干扰素的产生，从而逃避宿主的先天性免疫 （La Rocca et al, 2005）。
• 非结构蛋白在抑制宿主免疫中可能扮演着重要的 作用，尤其是抑制宿主的先天性免疫中。
与宿主相互作用的病毒蛋白
• CSFV引起一系列蛋白表达水平的变化。 • 膜联蛋白（Annexin 2，Ca2+-dependent cytosolic proteins binding to cellular membranes）HO-1（Heme oxygenase-1， 血红素加氧酶-1 ）表达上调；Annexin 2与 E2蛋白存在相互作用（Tu et al, in press）。 • C蛋白与波形蛋白（Vimemtin）存在相互作 用（Qiu et al, unpublished）。
et al, 2006)
CSFV的糖蛋白Erns、E1和E2对病毒的毒力均有影响
病毒毒力相关蛋白-非结构蛋白
Npro基因缺失导致CSFV毒力的减弱 (Mayer et al，2004)
Npro
1
168
NS4B的2566VGI2568位点突变成AAA之后，CSFV毒力明显减弱 (Sainz et al，2010) NS4B
• 用随机肽库技术在Erns鉴定了中和性抗原表位，分别位于384386及322-323位、380-386 位氨基酸区域（Zhang et al, 2006）。
诱导免疫应答相关蛋白-非结构蛋白
• 非结构蛋白NS2-3能够诱导抗体的产生，具 有CSFV特异性B细胞表位。 • NS2-3还存在T细胞表位 1446KHKVRNEVMVHWFDD1460（Armengol, et al, 2002）。 • 在NS4A上鉴定出的一个T细胞表位 （2276ENALLVALF2284）（Armengol, et al, 2002）。
多聚蛋白
猪瘟病毒结构蛋白
衣壳蛋白C 第一个结构蛋白，分子量14 kDa， 能够调控病毒基因表达 Erns 囊膜糖蛋白 高度糖基化蛋白，具有内切核酸酶 活性，能够诱导机体产生中和抗体 包埋于病毒囊膜内，不诱导机体产 生中和抗体 主要的诱导机体产生中和抗体的糖 基化蛋白，大小在51-55 kDa
结构蛋白
猪瘟病毒编码蛋白
• 多聚蛋白裂解为4个结构蛋白和7个非结构蛋白。 • 结构蛋白（C、Erns、E1、E2）。 • 非结构蛋白（Npro、p7、NS2-3、NS4A、NS4B、 NS5A、NS5B）。
5-NCR Npro C Erns E1 E2 p7 NS2 NS3 4A NS4B NS5A NS5B 3-NCR
• 糖基化蛋白Erns和E1是否对CSFV的细胞嗜性有影 响有待研究。
病毒毒力相关蛋白-结构蛋白
糖基化位点269N突变成丙氨酸A或谷氨酰胺Q，毒力减弱(Sainz et al, 2008) Erns
268 494
糖基化位点594N突变成A，毒力减弱(Sainz et al, 2009)
E1
495 689
谢谢大家！
已经鉴定的抗原表位定位
384DKN386
Erns
268
771LLFDGTNP778 829TAVSPTTLR837
494
995YYEP998