猪瘟病毒蛋白的结构与功能
非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测摘 要：p30蛋白是非洲猪瘟病毒（ASFV ）免疫原性最强的结构蛋白之一，由CP204L 基因编码。
本研究利用Bac-to-Bac 昆虫杆状病毒真核表达系统将ASFV 中CP204L 插入pFastBac1载体下游，将形成的重组质粒pFastBac-p30以转座子的形式插入到DH10Bac 中的杆状病毒穿梭质粒（Bacmid ）中，筛选出重组Bacmid-p30后，将Bacmid-p30转染Sf9细胞，并继续传代3次，获得重组杆状病毒，命名为rBac-p30。
分别通过间接免疫荧光（IFA ）和免疫印迹（Western blot ）鉴定了ASFV 阳性血清可特异性识别Sf9细胞中表达的p30。
以此真核表达p30蛋白包被ELISA 板，可区分ASFV 阴阳性血清。
以上结果表明，本研究初步建立了检测ASFV 血清抗体的间接ELISA 方法，为后续建立非洲猪瘟抗体检测方法和p30亚单位疫苗研究奠定基础。
关键词：非洲猪瘟病毒；p30蛋白；杆状病毒表达系统中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）04-0170-06Production and Immunological Detection of African Swine Fever Virus p30 byBaculovirus Expression SystemLIAO Xinxin 1,2, ZHONG Qiuping 2, SHI Xinjin 2, WEI Changqing 2, SUN Haiwei 2, LIU Yingnan 2,AO Qingying 2, XIE Zhenhua 2, WU Jing 1, CHEN Hongjun 2(1. Hunan Engineering Research Center of Livestock and Poultry Health Care, Colleges of V eterinary Medicine, Hunan Agricultural University,Changsha 410128, China; 2. Shanghai V eterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)收稿日期：2021-11-01基金项目：十三五国家重点研发专项资助项目（2018YFC08400400，2017YFD0502300）；自然科学基金联合基金项目重点支持项目-区域创新发展联合基金项目（U19A2039）作者简介：廖欣欣，女，硕士研究生，临床兽医学专业通信作者：邬静，E-mail：****************.cn；陈鸿军，E-mail：***************.cn Abstract: The p30 protein encoded by CP204L gene is one of the most immunogenic structural proteins of African swine fever virus (ASFV). In this study, the Bac-to-Bac insect baculovirus eukaryotic expression system was used to insert CP204L in ASFV into the downstream of pFastBac1 vector, and the resulting recombinant plasmid pFastBac-p30 was inserted into Baculovirus shuttle plasmid (Bacmid) in DH10Bac as a transposon. After screening the recombinant Bacmid-P30 was transfected into Sf9 cells, and the recombinant Baculovirus rBac-p30 was obtained expression of p30 protein. Indirect immunofl uorescence (IFA) and Western blot were used to identify p30 expression in Sf9 cells by ASFV positive serum specifi city. The recombinant p30 protein was used to coat ELISA plates to distinguish positive and negative serum samples of ASFV . The development of an indirect ELISA method laid the foundation for further establishment of an ASFV antibody detection method and p30 subunit vaccine research.Key words: African Swine fever virus; p30 protein; baculovirus expression system2023,31(4):170-175廖欣欣1,2，钟秋萍2，史馨瑾2，魏常青2，孙海伟2，刘英楠2，敖清莹2，谢振华2，邬 静1，陈鸿军2（1.湖南农业大学动物医学院 畜禽保健湖南省工程研究中心，长沙410128；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241· 171 ·廖欣欣等：非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测第31卷第4期非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的猪的一种热性、急性、高度接触性传染病[1]。
猪瘟病毒主要抗原蛋白研究进展
抑制试验表明 ，猪瘟病毒最初结合到细胞上是通过 Ｅ ０蛋 白
介导 的 ， 试验还证 实 ， Ｅ ０ Ｃ端的肽段（ ４ ８ ０ 一 Ｋ Ｋ Ｌ Ｅ Ｎ Ｋ Ｓ Ｋ 一 ４ ８ ７ ） 是相互作用所必须的。
２ ． ２ Ｅ ２蛋 白
Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ的基 因组大小约 １ ２ ． ３ ｋ ｂ ， 由５ ’ 端非编码 区， 开放阅 读框和 以及 ３ 。 端非编码 区三部分组成 。 开放阅读框编码 一个
病毒表达 了 Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ Ｅ ２（ 不包 括跨膜 区） ，Ｅ ２的 Ａ区及 Ｅ ２的
Ｍ 或Ｅ Ｄ Ｔ Ａ的影 响 ，但 能够被 ｚ ｎ “离 子抑 制。Ｅ ０对 Ｄ Ｎ Ａ 没有活性 ，只作用于 Ｒ Ｎ Ａ，对富含 Ｕ序列活性最高 。Ｅ ０的
Ｒ Ｎ ａ ｓ ｅ活性 能够影 响宿主细胞 中病 毒 Ｒ Ｎ Ａ的复制 ，并且对
专 论 与 综 述
猪瘟病 毒主 要 抗 原 蛋 白研 究进 展
余 姣
（ 西南 大学 动物 科技 学 院 ，重庆 ４ ０ ０ ７ １ ５）
摘 要： 猪 瘟病毒是黄病毒科瘟病毒属成 员， 能引起各种年龄段猪 的急性 、 热性和 高度致死性的传染病。本文就猪 瘟
病毒 的分类 、 形态及及病毒 的基 因组 结构进行 了综述 ， 并 对其 编码的几种 主要 抗原蛋 白 Ｅ ０ 、 Ｅ ２ 、 ＮＳ ３的功 能等进行
Ｅ ０是一种尿 嘧啶特异的有神经毒性 、 抗蠕虫和免疫抑制活性 ， 其活
性在 ｐ Ｈ ４ ． ５ ～ ６ ． ５时最高 ， 最适温度为 ５ ５ ℃， 酶活性不受 ｃ ａ 、
助于从疫 苗接种猪群 中筛查 出野毒感染猪。Ｖ ａ ｎ等利用杆状
了 简要 介 绍 。
关键词 ： Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ； Ｅ ０ ； Ｅ ２ ； ＮＳ ３ ＤＯ ｌ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ Ｊ ． Ｉ ＳＳＮ． １ ６ ７１ — ６ ０ ２ ７ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ４ ． ０ ０ ５
猪瘟病毒的分子生物学及其猪瘟的分子发病机理
• CSFV另一种可能的受体是低密度脂蛋白受体(lowdensity lipoprotein, LDL), 因为已证实黄病毒科的许多不 同种类的成员如：HCV、BVDV、GBV和HGV均可通过 LDL受体的介导以细胞内吞作用的方式进入到细胞中。
(三) CSFV的非结构蛋白
• NS3具有蛋白消化酶(催化从NS3 到 NS5B 各个蛋白的切 割)、解链酶和NTPase酶活性，与病毒基因组的复制有 关。但在一些瘟病毒生物型中，NS2-3并不发生裂解， 而是以融合形式存在。如：在非细胞病变型BVDV中， 主要以NS2-3融合蛋白形式存在，而在细胞病变型 BVDV感染的细胞中，却有高水平的NS3存在，并且与 病毒RNA在细胞中的增多相关，这说明细胞内NS3浓度 与病毒的复制能力相关。而细胞病变型BVDV的NS2-3 能得到有效切割，NS3的多种功能均能充分得以发挥， 而病毒复制能力，能大量生成病毒粒子而导致细胞病变。 在CSFV中， NS2、NS3以什么形式存在还有待研究。 除有缺损颗粒的病毒外，CSFV均不能产生细胞病变。 这是否与非细胞病变形式BVDV一样，感染细胞中只有 NS2-3融合蛋白，病毒的繁殖能力不强所致还有待研究。
猪瘟病毒的分子生物学及 猪瘟的分子发病机理
一、病 原
• 猪瘟病毒（CSFV）属于黄病毒科瘟病毒属。 • 与同属的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、羊边
界病毒(BDV)之间，基因组序列有高度同源性， 抗原关系密切，存在交叉反应。与同科的乙脑、 登革、丙肝等病毒基因组结构相似。 • 野毒株毒力差异很大
一、CSFV
猪瘟病毒分子生物学研究进展
译 区 ｆ ＴＲ） 其 中 ５ＮＴ 长 约 ３ ３个 核 甘 酸 ， 有 Ｎ ， Ｒ ７ 含 多 个 ＡＵＧ 密 码 子 和 一 个 核 糖 体 进 入 位 点 （ＲＥ ） Ｉ Ｓ 。
医 局 （ Ｅ） 为 Ａ 类 动 物 传 染 病 ， 此 开 展 猪 瘟 病 ｏ１ 列 因
毒 分 子 生 物 学 研 究 具 有 重 要 的 经 济 意 义
１ Ｃ 单 股 正 链 ＲＮＡ， 约 ｌ ｂ． Ｓ 长 ２ ３ｋ 含 有 一 个 大 的 开 放 阅 读 框 架 ， 由 其 编 码 一 种 约 并 ３ ８ ８ 氨 基 酸 的 多 聚 蛋 白 ， 聚 蛋 白在 翻 译 的 同 时 ９个 该 和 翻 译 后 经 病 毒 和 宿 主 细 胞 的 蛋 白酶 加 工 成 １ ２种
２ Ｃ Ｆ 的几种 主要 的病毒 蛋 白 ＳＶ
在 ＣＳ ＦＶ 的 ｌ ２种病 毒 蛋 白 中 ， Ｅ Ｅｌ和 Ｅ２ Ｃ、 、 为 结 构 蛋 白 ， 他 均 为 非 结 构 蛋 白 。 构 蛋 白的 加 工 其 结
成 熟 的 病 毒 蛋 白 ， 在 聚 蛋 白 上 从 Ｎ 端 到 Ｃ 端 的 顺 其
收 韬 Ｅ期 ： ０ １ ０ １ ｌ ２ ０ ～ ０
的 质 量 不 但 关 系 畜 牧 业 的 健 康 发 展 ， 关 系 着 人 类 也 社 会 的 可 持 续 发 展 上 述 几 种 毒 草 灾 害 性 疾 病 均 多
见 于 我 国 西 部 地 区 ， 从 一个 侧 面 反 映 西 部 大 开 也 发 战 略 中 的 生 态 环 境 建 设 与 保 护 的 紧 迫 性
猪瘟病毒蛋白与功能
有待进一步发现其他非结构蛋白对病毒毒力的影响
诱导免疫应答相关蛋白-结构蛋白E2
• CSFV糖蛋白中E2是最主要的免疫原性蛋白，其能够诱导机体 产生中和抗体并且能够保护CSFV强毒的攻击。 • E2的抗原位点主要分布在N 端690-866 位氨基酸残基上，分为 4 个抗原区：A、B、C 和D 区，分别位于766-865、690-799、 690-799和775-788位氨基酸残基之间。 • 693-716肽段可提供免疫保护（Dong et al，2006）。 • 目前报道的E2蛋白抗原表位主要位于775-865和775-812。 • E2单克隆抗体WH303识别一个在CSFV 中高度保守的表位， 其表位829TAVSPTTLR837（Lin et al，2000）。 • 我们小组鉴定771LLFDGTNP778为一保守的线性抗原表位 （Peng et al，2008）。
病毒复制相关蛋白
• CSFV NS5B蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶活性（RdRp） （Xiao et al，2002）。 • CSFV的复制起始于NS5B蛋白结合病毒的3-NCR，从而起始 病毒RNA的复制（Steffens et al，1999）。 • NS5A以及NS4B与NS5B蛋白能形成高度有序的复制酶复合体， 共同对CSFV的复制起作用（Sheng et al，2010）。 • NS3蛋白的RNA解旋酶活性能够提高病毒的翻译（Xiao et al，
2008）。
病毒复制相关蛋白-假说A
Moulin et al, 2007
• NS2通过与细胞的辅助因子Jiv的作用，将NS2-3蛋白剪切 成NS2、NS3蛋白，其中NS3蛋白与NS4A、NS4B、NS5A、 NS5B形成蛋白复制复合体，起始病毒的复制。
猪瘟病毒
猪瘟病毒猪瘟（swine fever）是猪的一种急性、接触性传染病，是猪的最主要的传染病之一，该病1883年首先发现于美国，死亡率可以达到80%～90%，往往给养猪业造成严重的经济损失。
1、形态猪瘟病毒粒子直径为34～50nm，有20面体对称的核衣壳，内部核心直径约30nm，病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜，病毒粒子表面有脆弱的纤突结构。
猪瘟病毒可以通过各种除菌滤器。
2、理化特性猪瘟病毒不耐热，56℃下60分钟即可被灭活，60℃10分钟就会丧失感染力。
猪瘟病毒在pH5～10之间比较稳定，低于pH3时病毒滴度下降较快。
猪瘟病毒对乙醚、氯仿和去氧胆酸盐敏感，迅速丧失感染性，对胰酶有中度敏感性。
二甲基亚砜（DMSO）对病毒中的脂质和脂蛋白有稳定作用，10%的二甲基亚砜（DMSO）溶液中的病毒对反复冻融一定的耐受性。
3、抗原性大多数资料认为猪瘟病毒只有一个血清型，国外发现了一些猪瘟的血清学变变种，不易被猪瘟特异性抗体所中和，但至今未确定其稳定的抗原型。
目前分离到了许多慢性猪瘟变异株和低毒力毒株，这些毒株通常免疫原性很差，不能产生明显的血清中和抗体，在用强毒攻击时，往往呈现厌食和高热等症状，但很少死亡。
弱毒疫苗株可以完全保护猪不受这些变异株的感染。
猪瘟病毒和牛粘膜-腹泻病毒（BVDV）具有公共的可溶性抗原，实验证明二者有交叉血清学反应，猪感染BVDV后可以表现为在一定程度上抵抗猪瘟强毒的攻击，有学者认为BVDV是猪瘟病毒的一个特殊的血清学变种，对猪已经减毒，但充分适应于牛和绵羊。
4、培养特性猪瘟病毒能够在猪肾细胞、猪睾丸细胞、犊牛睾丸细胞和其他许多哺乳动物细胞内增殖。
病毒成分在胞浆内合成和装配后释放到细胞外，细胞培养物中病毒的传播呈三种方式：一是被感染细胞释放病毒通过培养液感染新的易感细胞，二是被感染细胞通过有丝分裂将病毒传染给子代细胞，三是通过细胞间桥在细胞之间传播病毒。
许多研究者试用不同种类的细胞，主要是猪源细胞在体外增殖病毒，证明骨髓、睾丸、肺、脾、肾细胞及白细胞均能增殖病毒，经过鸡胚传代的猪瘟病毒可以在鸡胚成纤维细胞内生长。
猪瘟病毒
猪瘟病毒猪瘟（swine fevｅr）是猪的一种急性、接触性传染病，是猪的最主要的传染病之一，该病１88３年首先发现于美国，死亡率可以达到80%~90%,往往给养猪业造成严重的经济损失。
1、形态猪瘟病毒粒子直径为３4~50ｎm,有20面体对称的核衣壳,内部核心直径约30nm，病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜,病毒粒子表面有脆弱的纤突结构。
猪瘟病毒可以通过各种除菌滤器。
2、理化特性猪瘟病毒不耐热，５6℃下60分钟即可被灭活,6０℃１０分钟就会丧失感染力。
猪瘟病毒在ｐH5~１0之间比较稳定,低于pH3时病毒滴度下降较快。
猪瘟病毒对乙醚、氯仿和去氧胆酸盐敏感,迅速丧失感染性,对胰酶有中度敏感性。
二甲基亚砜(DMSＯ)对病毒中的脂质和脂蛋白有稳定作用，１0%的二甲基亚砜（DMSＯ）溶液中的病毒对反复冻融一定的耐受性。
３、抗原性大多数资料认为猪瘟病毒只有一个血清型,国外发现了一些猪瘟的血清学变变种,不易被猪瘟特异性抗体所中和,但至今未确定其稳定的抗原型。
目前分离到了许多慢性猪瘟变异株和低毒力毒株,这些毒株通常免疫原性很差,不能产生明显的血清中和抗体,在用强毒攻击时，往往呈现厌食和高热等症状，但很少死亡。
弱毒疫苗株可以完全保护猪不受这些变异株的感染。
猪瘟病毒和牛粘膜-腹泻病毒（ＢＶＤＶ）具有公共的可溶性抗原,实验证明二者有交叉血清学反应，猪感染BVＤV后可以表现为在一定程度上抵抗猪瘟强毒的攻击,有学者认为ＢVＤV是猪瘟病毒的一个特殊的血清学变种,对猪已经减毒,但充分适应于牛和绵羊。
4、培养特性猪瘟病毒能够在猪肾细胞、猪睾丸细胞、犊牛睾丸细胞和其他许多哺乳动物细胞内增殖。
病毒成分在胞浆内合成和装配后释放到细胞外，细胞培养物中病毒的传播呈三种方式：一是被感染细胞释放病毒通过培养液感染新的易感细胞,二是被感染细胞通过有丝分裂将病毒传染给子代细胞,三是通过细胞间桥在细胞之间传播病毒。
许多研究者试用不同种类的细胞,主要是猪源细胞在体外增殖病毒,证明骨髓、睾丸、肺、脾、肾细胞及白细胞均能增殖病毒,经过鸡胚传代的猪瘟病毒可以在鸡胚成纤维细胞内生长。
非洲猪瘟病毒结构蛋白CD2v的功能研究进展
非洲猪瘟病毒结构蛋白CD2v的功能研究进展①王曼沈宇清（东南大学医学院，南京210000）中图分类号S852.65+1R392文献标志码A文章编号1000-484X（2021）22-2734-05［摘要］非洲猪瘟是一种由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的急性、高致死性的猪传染病。
ASFV至今尚未研发出有效的ASFV疫苗，给家畜养殖业造成了巨大的经济损失。
ASFV编码的结构蛋白CD2v在病毒的复制、体内播散和免疫逃逸等方面发挥着重要作用。
本文将综述CD2v的功能，同时讨论CD2v在疫苗研究和病毒基因分型中的应用。
［关键词］非洲猪瘟病毒；CD2v；病毒复制；免疫逃逸；疫苗Research progress in function of ASFV structural protein CD2vWANG Man，SHEN Yu-Qing.Medical School of Southeast University，Nanjing210000，China［Abstract］African swine fever is an acute，highly lethal swine infectious disease caused by african swine fever virus（ASFV）. An effective vaccine of ASFV has not yet developed，which caused huge economic loss in livestock breeding industry.CD2v，a struc‐tural protein encoded by African swine fever virus，plays an important role in virus replication，in vivo dissemination and immune escape.This paper will review the function of CD2v and discuss the application of CD2v in vaccine research and virus genotyping.［Key words］African swine fever virus；CD2v；Virus replication；Immune escape；Vaccine非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）类属非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，是一种有包膜的、核衣壳呈二十面体对称形态的病毒。
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猪瘟病毒蛋白的结构与功能李 军 杨 威3 陈凤莲 赵 武 (广西兽医研究所 广西南宁 530001) 猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种急性、热性和高度接触性的病毒性传染病。
猪瘟因其流行广泛、发病率和死亡率高,给许多国家的养猪业造成巨大的经济损失,在世界动物卫生组织制定的《国际动物卫生法典》中,它被列为A类16种法定传染病之一;在我国制定的《家畜家禽防疫条例实施细则》中也被列为一类传染病。
当前猪瘟防治主要还是依赖于疫苗,虽然猪瘟疫苗的使用降低了猪瘟的发病率和死亡率,但是CSFV持续性感染导致的免疫失败,使人们开始把研究重点转向对病毒与宿主相互作用的研究。
反向遗传学技术的出现,为我们了解病毒的基因结构、蛋白功能、基因重组提供了技术平台,得以从整个基因组水平来研究错综复杂、相互关联的基因组和蛋白组,这使得CSFV的病原学研究取得了新突破。
本文现将国内外近年来对CSFV基因结构、病毒蛋白功能上的研究作一综述。
1 病毒的基因组结构CSFV是一种有囊膜的正链单股RNA病毒,与牛病毒性黏膜腹泻病毒(BVDV)和羊边界病毒(BDV)同属黄病毒科瘟病毒属成员。
CSFV基因组大小约12.3kb,5’非编码区由373个核苷酸组成,含有RNA复制所需的顺式作用元件和一个帽不依赖性翻译所需的内部核糖体进入位点;3’非编码区约由229～244个核苷酸组成,参与RNA的复制。
CSFV 只编码一个大约3900氨基酸残基的多聚蛋白开放阅读框(ORF),该多聚蛋白在翻译过程中和翻译后,在病毒编码的蛋白酶和宿主细胞酶的作用下,分解成为4个结构蛋白(C、E rns、E1和E2)和8个非结构蛋白(N pro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。
2 病毒的蛋白CSFV蛋白在病毒基因组的编码顺序为:N pro、C、E rns、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。
N pro、C、E rns、E1、E2、P7和NS2蛋白对于病毒RNA复制是非必需的,NS3、NS4A、NS4B和NS5A形成复制复合体与具有RNA依赖性RNA聚合酶活性的NS5B共同参与病毒RNA的复制。
2.1 N pro蛋白N pro蛋白由168个氨基酸残基组成,分子量为23K Da,是一种具有蛋白水解酶活性的半胱氨酸蛋白酶。
N pro是CS2 FV中最先翻译的非结构蛋白,能在Cys168与Ser169间自我裂解,产生自己的C端,成为成熟的病毒蛋白。
G lu22、His49和Cys69是保持N pro蛋白水解酶活性所必需的氨基酸残基。
Tratschin等(1998)用鼠的泛素基因替换CSFV的N pro基因,证明了N pro对病毒在传代细胞内的复制是非必需的。
Mayer D等〔1〕将猪瘟中等毒力株Alfort/187和强毒株Eystrup的N pro基因分别缺失后感染猪,结果猪产生了高水平的抗体并可以抵抗强毒的攻击。
用疫苗株Riems的N pro基因置换强毒株Eystrup的N pro基因,得到重组病毒仍然为强毒株。
因此, N pro只是CSFV的一个毒力相关基因,对CSFV各毒株的毒力不起决定作用。
Ruggli N等〔2,3〕对CSFV干扰宿主细胞抗病毒机制进行了研究,发现CSFV感染巨噬细胞后,可以抑制poly(IC)诱导巨噬细胞产生IFN-α/β,缺失了N pro基因的病毒,虽然在生长特性和蛋白表达水平上与野型病毒相似,但是失去了抑制细胞产生IFN-α/β的能力。
La Rocca S A等〔4〕研究了N pro抑制细胞产生IFN-α/β的机制,发现N pro可以对参与IFN-α/β转录的干扰素调节因子3(IRF-3)起到抑制作用。
在辛德毕斯病毒感染的细胞,可以观察到IRF-3从细胞质移位到细胞核,启动IFN-α/β的转录;而CSFV感染的细胞却与未受感染的细胞相似,虽然也有IRF-3穿梭于细胞核与细胞质间,但IRF-3主要定位在细胞质内。
随后的研究证实,N pro蛋白是通过蛋白酶体降解途径降解IRF-3〔5〕。
这些结果表明N pro有助于CS2 FV逃避机体的天然免疫,建立持续性感染。
2.2 C蛋白C蛋白由99个氨基酸残基组成,分子量为14K Da,是CSFV的衣壳蛋白,其N端由有蛋白水解酶活性的N pro蛋白在Ser169处切割产生,其C末端是宿主细胞的信号肽酶在Ala265处切割产生〔6〕。
C蛋白除了与病毒基因组RNA结合,保护病毒RNA外,还具有转录调节作用。
C蛋白通过自身的核定位序列KKKGKV进入细胞核,激活热休克蛋白基因的启动子,启动热休克蛋白的转录。
热休克蛋白作为一种伴侣分子,它的大量表达有助于病毒蛋白的折叠和病毒粒子的装配。
2.3 E rns蛋白2.3.1 E rns蛋白的结构:E rns蛋白是分子量为26K Da的囊膜糖蛋白,由227个氨基酸残基组成(G lu268-Ala494),有9个潜在的N-糖基化位点。
多肽链中的9个半胱氨酸残基维持蛋白结构,其中Cys438起着维系E rns二聚体的作用,van G ennip H G等〔7〕将E rns的Cys438突变为Ser后,E rns单体不能形成二聚体,降低了病毒粒子与SK-6细胞表面受体硫酸乙酰肝素的亲和力,影响了病毒的复制效率。
2.3.2 E rns蛋白的RNase活性:Schneider等(1993)报道了E rns具有RNase活性,RNase活性最适p H为6.0～6.5,最适温度为55℃,酶活性不受Ca2+、Mg2+或EDTA(1mM)的影响。
E rns对DNA没有活性,只作用于单链RNA,对富含U序列活性最高。
E rns蛋白的His297和His346是酶的催化位点, His297和His346的突变虽然不会影响病毒在细胞中的增殖,但可使E rns丧失RNase活性,导致病毒毒力减弱,而且His297的缺失则可直接导致病毒无感染性。
由于E rns具有RNase活性,在体外试验中,它不仅可以完全抑制刀豆素A 诱导的淋巴细胞增殖,还可以导致淋巴细胞凋亡。
因此,E rns 的RNase活性不仅影响了病毒的毒力,而且还可能是CSFV 发生持续性感染的原因。
2.3.3 E rns蛋白在CSFV侵入中的作用:Hulst M M等(1997)的研究表明,CSFV感染传代细胞SK-6是通过其两个囊膜糖蛋白E rns和E2分别作用于细胞表面的不同受体来进行的。
首先是E rns与细胞表面受体的不可逆结合介导了病毒的吸附;其次是E2与细胞表面特异性受体的可逆结合介导病毒的穿入。
CSFV Brescia株在SK-6细胞上连续传代后,位于E rns内的476位氨基酸由不带电荷的丝氨酸突变为带正电荷的精氨酸,病毒通过这种突变可以更好地吸附在细胞表面带负电荷的硫酸乙酰肝素上,提高了病毒的复制效率,其毒力只是轻微减弱或没有改变〔8～11〕。
巨噬细胞表面 3为通讯作者。
基金项目:广西自然科学基金(桂科自0728103)。
・96・《上海畜牧兽医通讯》 2007年第6期也有硫酸乙酰肝素表达,但是CSFV感染巨噬细胞后却没有观察到476位氨基酸残基由丝氨酸突变到精氨酸〔9〕,因此, CSFV可能采取一种不依赖硫酸乙酰肝素作为受体的方式来感染巨噬细胞,这表明了CSFV有复杂的感染机制,可选择多个细胞受体来介导病毒的侵入。
2.3.4 E rns蛋白的抗原特性:E rns单独诱导产生的中和抗体可以抵抗CSFV强毒的攻击,因此E rns也是防治猪瘟的一个靶蛋白。
E rns的抗原位点位于332～412位、351～427位和376～487位氨基酸残基三个重叠抗原区中〔12〕。
376～412位和376～427位氨基酸残基为构象型表位,具有高度敏感性,可识别CSFV感染后第7d所出现的抗体〔13〕。
Zhang F 等〔14〕用随机肽库进行E rns中和表位的鉴定,获得了分别针对3个单抗的3个中和表位,分别定位于351～356位或348～350位、384～386及322～323位、380～386位氨基酸区域。
2.4 E1蛋白E1蛋白是CSFV的囊膜蛋白,去糖基的蛋白骨架分子量为21.8K Da,由195个氨基酸残基组成(Leu495-G ly689),有3个潜在的N-糖基化位点。
该蛋白是由宿主细胞蛋白水解酶、信号肽酶及糖基化酶共同加工产生。
蛋白有两段疏水区,Thr659～G ly689是E1转位的信号肽,Leu548～Pro579是E1向内质网腔转位的终止信号。
在病毒粒子中,E1与E2的C端通过共价键形成异源二聚体,锚定在病毒粒子的囊膜表面,由于E1埋在病毒囊膜内,所以不能诱导产生中和抗体。
E1对病毒的毒力也有一定的影响,在E1C 端插入19个碱基会导致重组病毒无毒力,并可抵抗强毒的攻击〔15〕。
2.5 E2蛋白2.5.1 E2蛋白的结构:E2是CSFV的囊膜蛋白,去糖基的蛋白骨架分子量为41.5K Da,由373个氨基酸残基组成(Arg690-G lu1062)。
E2有5个N-糖基化位点,在每个位点上都可与一个2～3K Da的低聚糖相连,这些糖基化位点对CSFV的感染至关重要,若同时将它们突变,病毒则失去了感染性。
在这5个糖基化位点中,Asn805的糖基化对病毒的毒力至关重要,它的突变可导致病毒丧失毒力〔16〕。
E2有15个属内均保守的半胱氨酸残基(Cys),其中N端6个Cys 与其空间结构及抗原性密切相关,C端9个Cys参与同源或异源二聚体的形成。
2.5.2 E2蛋白的抗原特性:E2是CSFV的三个囊膜糖蛋白中保守性最低、最容易发生变异的囊膜糖蛋白,同时还是CS2 FV的主要保护抗原,可诱导产生中和抗体。
E2的抗原位点主要分布在N端690～866位氨基酸残基上,分为4个抗原区,A、B、C和D区分别位于766～865、690～799、690～799和775～788位氨基酸残基之间。
在空间结构上,A区和D 区、B区和C区间形成两个相对独立的结构单位,A区和D 区通过Cys792和Cys856、Cys818和Cys828之间形成的两对二硫键连接形成;B区和C区通过Cys693和Cys737之间的二硫键连接形成。
A区还可分为A1、A2、A33个亚区。
A1、A2亚区保守, A3、B、C和D区均呈不同程度的变异。
A1、B和C可诱导产生中和抗体,而且A1和B、A1和C之间诱导的中和反应有协同作用。
A、B、C和D各区域的抗原表位数分别是8、6、3和1,A1、A1和A3各亚区的抗原表位数分别是4、3和1。
A1和A2亚区相连,其抗原表位分别位于775～865和775～812位氨基酸残基之间,A3亚区靠近B和C区,位于766～813位氨基酸之间。