RT-PCR实验方法总结大全
rtpcr实验报告
rtpcr实验报告RT-PCR实验报告一、引言RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA样本中的特定基因表达水平。
本实验旨在通过RT-PCR技术，对目标基因在不同组织或条件下的表达进行定量分析，以进一步了解其功能和调控机制。
二、实验材料与方法1. 材料：- RNA样本：从不同组织或条件下提取的总RNA。
- RT-PCR试剂盒：包括逆转录酶、聚合酶、引物等。
- DNA分子量标记物：用于测定PCR产物的大小。
- 离心管、PCR管、PCR仪等实验器材。
2. 方法：（1）RNA提取：采用某种RNA提取试剂盒，按照说明书提取不同组织或条件下的总RNA。
（2）逆转录反应：将提取的RNA模板与逆转录酶、引物和其他试剂混合，进行逆转录反应，将RNA转录为cDNA。
（3）PCR扩增：将逆转录反应产生的cDNA作为模板，与引物和PCR试剂混合，进行PCR扩增。
（4）电泳分析：将PCR产物与DNA分子量标记物一同进行琼脂糖凝胶电泳，根据PCR产物的大小判断目标基因的表达水平。
三、实验结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地获得了目标基因在不同组织或条件下的表达数据，并进行了初步的分析和讨论。
1. RT-PCR结果分析我们首先进行了RNA提取和逆转录反应，得到了各组织或条件下的cDNA样本。
然后，我们设计了特异性引物，进行了PCR扩增。
最后，通过琼脂糖凝胶电泳，观察到了PCR产物的带型。
根据PCR产物的带型，我们可以初步判断目标基因在不同组织或条件下的表达水平。
比如，在组织A中，我们观察到了明显的PCR产物带，说明该基因在组织A中高表达；而在组织B中，PCR产物带较弱，说明该基因在组织B中低表达。
2. RT-PCR结果验证为了验证实验结果的准确性，我们进行了重复实验和对照实验。
通过对照实验，我们可以排除PCR扩增的假阳性结果。
通过重复实验，我们可以评估实验的重复性和稳定性。
在重复实验中，我们发现，不同实验之间的PCR产物带型一致，表明实验结果具有较好的重复性。
RT-PCR实验方法大全(抽提RNA,RT,PCR)-6
RT-PCR实验方法大全(抽提RNA，RT，PCR)-6可能问题出在标本的保存：一般四小时之内就应处理，分离出细胞说的是套式PCR,可以在你的第一次PCR两个引物内,再设计一对引物进行第二次PCR就行了如果你的第一次PCR刚好包括目的片段,那只好设计个更长的了第二次的引物设计要求可以低一点以50μl体系为例引物各1μl第一次PCR产物5μl二次PCR和巢式PCR，即设计两对引物进行扩增，不是一个概念，它是拿第一次的PC R产物，稀释100-1000倍做模板，加入底物，从新进行扩增反应，以期增加产物的量我做RT-PCR时,提总RNA时,都是用灭菌DEPC水,按1:100稀释后测 OD260和OD280,后根据公式:RNA浓度=OD260*稀释度/25(ug/ul),后用1mg total RNA分离mRNA.做逆转录及PCR,效果很好.luoyu10 wrote:各位大哥：我有一个问题请教，RT- PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低为多少，如果太低是不是会影响结果？最低到1.8，最好2.0，我感觉稍微低一点影响不算太大。
问：我是ＲＴ－ＰＣＲ的新手，想请教引物如何设计？好的引物所具有的令人满意的特点：* 典型的引物18到24个核苷长。
引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。
较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
* 选择GC含量为40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。
* 设计5'端和中间区为G或C的引物。
这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
* 避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。
* 避免3'末端富含GC。
设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。
* 避免3'末端的错误配对。
rt-pcr的步骤和注意事项
RT-PCR的步骤和注意事项RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分析RNA的数量和表达水平。
下面是RT-PCR的基本步骤和一些需要注意的事项。
步骤1.提取RNA：RT-PCR的第一步是从样品中提取RNA。
常见的方法包括酚/氯仿提取法和商用RNA提取试剂盒。
2.逆转录：逆转录是将RNA转录成cDNA的过程。
逆转录反应需要逆转录酶和引物。
在逆转录反应中，RNA被逆转录酶逆转录为单链cDNA。
3.退火：将逆转录产生的单链cDNA进行退火，以得到双链cDNA。
退火的温度和时间应根据引物的特异性进行优化。
4.PCR扩增：将退火得到的双链cDNA作为模板进行PCR扩增。
PCR扩增需要DNA聚合酶和引物。
PCR扩增的温度和时间也应根据引物的特异性进行优化。
5.分析产物：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析或者实时荧光定量PCR分析，以检测和定量RNA的表达水平。
注意事项在进行RT-PCR实验时，有几个注意事项需要遵守：1.RNase污染：RNase是一种可以降解RNA的酶，极易污染实验室环境。
为了避免RNase污染，所有操作前都应使用RNase去除液对实验表面进行彻底清洁，并在操作过程中使用RNase-free的试剂和器具。
2.质控：在RT-PCR实验中应常规进行阴性对照和阳性对照。
阴性对照是用纯水代替RNA模板，而阳性对照是使用已知含有目标RNA的样品。
质控实验的结果应该符合预期，以确保实验的准确性和可靠性。
3.引物设计：引物是RT-PCR实验中非常重要的因素，合适的引物设计可以提高实验的特异性和灵敏度。
引物的选择应避免自身互补性，长度一般为18-24个碱基，GC含量在40-60%之间。
此外，引物的Tm值应相近，以确保PCR扩增的效果。
4.反应体系：RT-PCR反应体系的准备需要精确的计量。
反应的组分通常包括模板RNA，引物，逆转录酶，逆转录缓冲液，核苷酸混合液，PCR缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs和MgCl2等。
RT-PCR实验方法总结大全
RT-PCR实验方法总结大全第一篇：RT-PCR实验方法总结大全RT-PCR实验方法总结大全RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2.RT按要求做，一般不会出太大问题。
3.PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。
（promega）。
2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
3.RACE 我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。
RT-PCR实验报告
逆转录pcrrt-pcr 为反转录rcr（reverse transcription pcr ）和实时pcr（real time pcr）共同的缩写。
逆转录pcr，或者称反转录pcr(reversetranscription-pcr, rt-pcr)，是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。
在rt-pcr中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。
由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的pcr。
原先的rna模板被rna酶 h降解，留下互补dna。
rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。
rt-pcr广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。
（检测基因表达的方法，参见northern blot法。
）rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-time pcr)。
为了与逆转录pcr相区别，通常被写作“定量pcr”(quantitative pcr)或者rtq-pcr(real-time quantitative pcr)。
实时pcr 实时pcr(real-time pcr)，属于定量pcr（q-pcr）的一种，以一定时间内dna的增幅量为基础进行dna的定量分析。
real time pcr 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。
一种是在ds dna中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time pcr 与 reverse transcription pcr 相结合，能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种rt pcr的组合又被称之为“定量rt-pcr（quantitative rt-pcr）”rt-pcr技术相关试剂oligo: 多聚体，相当于mrna引物amv（m-mlv）：逆转录酶dntp：脱氧核苷酸rnase：rna酶抑制剂pcr buffer：rt-pcr缓冲液mgcl2：2价镁离子pcr各步骤的目的（一）预变性：破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。
RT-PCR实验
1.PCR反应基本步骤
（1）变性：高温使双链 DNA解离形成单链 （94℃，30s） （2）退火：低温下，引 物与模板DNA互补区结 合（55-60℃，30s） （3）延伸：中温延伸。 DNA聚合酶催化以引物 为起始点的DNA链延伸 反应（72℃，60s)
2.PCR体系
上游引物 下游引物 模板cDNA dNTP Taq酶(final) 0.5ul 0.5ul 0.5ul 1ul 0.5ul
(2)电泳跑胶：琼脂糖溶液凝固后，拔出梳子， 放入到电泳槽中（电泳槽中有缓冲液），取 5ul的RNA样品加入1ul的loading buffer，用 枪头吹打混匀，然后加入到凝胶上做好的加 样孔中。将电泳槽连接到电泳仪的正负极， 启动开始电泳。（ RNA电泳的电压200v，10 分钟左右，方向负极到正极）
RT-PCR实验总结
RT-PCR是从RNA中扩增目的DNA的技术，其步 骤是将RNA逆转录成cDNA，再以此cDNA为模板进行 PCR。
一.组织RNA提取 二.逆转录（RT） 三.PCR
1.操作步骤： （1）将100mg左右组织放入研钵中，加液氮将组织 研磨成粉末状，然后加1ml的Trizol（有毒，切勿 沾到皮肤上），继续加液氮，研磨成粉末状，然 后将粉末导入到离心管中，冰上5min。 （2）往离心管中加入0.2ml氯仿，剧烈震荡混匀， 冰上5min。 （3）4℃，12000g离心 15min（冰冻离心机），取 上清液移入新的离心管中（切勿吸入离心管下层 的沉淀），然后往新管中加入等体积的异丙醇， 轻微混匀，冰上10min。
（3）评价RNA提取纯度的方法 跑胶结束后，在紫外透射分析仪中观察到三条 条带，最靠近加样孔的是28s,然后依次是18s,5s 的条带。 是否降解 a b 纯度 a b c 条带宽窄 有无拖尾现象 加样孔有无条带 28s：18s ≧2 5s条带不太亮
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
rtpcr实验报告
rtpcr实验报告标题：rtpcr实验报告摘要：本实验使用了rtpcr技术对特定基因进行检测，通过分析实验结果，得出了基因表达水平的定量数据。
实验结果表明，该基因在不同条件下的表达水平存在显著差异，为进一步研究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。
引言：rtpcr（reverse transcription polymerase chain reaction）是一种常用的分子生物学技术，可以用于检测特定基因的表达水平。
通过rtpcr实验，我们可以定量分析基因在不同组织、不同条件下的表达情况，从而深入研究基因在生物学过程中的作用。
材料与方法：1. 样本准备：收集不同组织或细胞系的样本，提取总RNA。
2. 反转录：使用反转录酶将RNA转录成cDNA。
3. pcr扩增：设计引物，进行实时荧光定量pcr扩增。
4. 数据分析：利用实时pcr仪器收集数据，进行定量分析。
结果：通过rtpcr实验，我们得到了不同组织或细胞系中特定基因的表达水平数据。
实验结果显示，在不同条件下，该基因的表达水平存在显著差异。
例如，在刺激条件下，基因的表达水平明显上调；而在抑制条件下，基因的表达水平则显著下调。
这些数据为我们进一步探究该基因在生物学过程中的作用提供了重要参考。
讨论：rtpcr实验结果表明，特定基因在不同条件下的表达水平存在显著差异。
这表明该基因可能在特定生物学过程中发挥重要作用，或者受到外部环境的调控。
进一步的研究可以探究该基因在细胞信号传导、代谢调控等方面的作用机制，为相关疾病的治疗提供理论依据。
结论：通过rtpcr实验，我们成功地分析了特定基因在不同条件下的表达水平。
实验结果表明，该基因在生物学过程中可能发挥重要作用，为进一步研究该基因的功能和调控机制提供了重要参考。
这项研究为深入探究基因在生物学过程中的作用提供了重要的实验基础。
RTPCR实验方法总结大全
RTPCR实验方法总结大全.docRT-PCR实验方法总结大全引言逆转录聚合酶链反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR）是一种分子生物学技术，它结合了逆转录酶（Reverse Transcriptase, RT）和聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）两种方法，用于从RNA模板中合成cDNA并进行扩增。
RT-PCR广泛应用于基因表达分析、病原体检测、克隆和基因功能研究等领域。
实验原理逆转录: 逆转录酶将RNA模板转录成cDNA。
PCR扩增: 利用特定的引物对cDNA进行特异性扩增。
实验流程1. 样本准备收集样本，如细胞、组织或血液。
提取RNA，确保纯度和完整性。
2. 逆转录设计并合成特异性的逆转录引物。
将RNA与逆转录引物混合，加入逆转录酶。
在特定温度下进行逆转录反应。
3. PCR扩增设计并合成特异性的PCR引物。
将cDNA与PCR引物、聚合酶、dNTPs等反应体系混合。
进行PCR循环，包括变性、退火和延伸。
4. 结果分析通过凝胶电泳或实时定量PCR（qPCR）分析PCR产物。
根据条带大小或荧光信号判断扩增效果。
实验关键点引物设计引物应具有特异性，避免非特异性扩增。
引物长度通常为18-25个核苷酸。
避免引物二聚体和发夹结构。
逆转录酶的选择选择高保真度和高效率的逆转录酶。
考虑逆转录酶的热稳定性。
反应条件优化优化逆转录和PCR反应的温度、时间和循环次数。
调整反应体系中的Mg2+浓度。
避免污染使用无菌技术操作。
使用负对照和正对照验证实验结果。
数据分析使用适当的软件分析qPCR数据。
通过凝胶电泳分析PCR产物的特异性。
常见问题与解决方案1. 非特异性扩增优化引物设计。
调整Mg2+浓度。
减少循环次数。
2. 低效率逆转录检查RNA质量和完整性。
更换逆转录酶。
3. PCR产物不清晰优化PCR条件。
RT-PCR方法
半定量RT-PCR 方法一反转录—第一链cDNA 的合成参照Promega RT-PCR试剂盒说明书进行。
取2 μg植物total RNA，与Oligo （dT）引物以0.5 ug primer/ug total RNA 的比例混合，体积不超过11 μL，70℃ 5 min，冰上冷却。
加入各种反转录试剂混合：10× reverse transcript buffer 2.5 μL；RNase Inhibitor 0.5 μL；dNTP Mixture 2.0 μL；Reverse Transcriptase 1.0 μL；RNase free Water 补足25 μL；混匀后，42℃ 1 h；75℃10 min。
PCR 合成第二链取第一链产物0.5 μL为模板，按常规PCR程序进行PCR扩增。
以拟南芥Actin7基因为反应的内标对照。
方法二反转录-聚合酶链反应（RT-PCR扩cDNA）第一步：1.0 μg拟南芥总RNA和1.0 μL oligo(dT) 引物，用水稀释到总体积5.0 μL的体系，70℃加热5 min后，迅速置冰上。
第二步：在反转录作用下由随机引物引导反转录成cDNA第一条链。
反应体系如下：表1 RT-PCR反应体系Table 1 The reaction system of RT-PCRMgCl2（25mM）5×Rxn BufferdNTP Mixture（25mM）rRNasin Ribonuclease inhibitor Reverse Transcriptase总RNA 2.0 μL 4.0 μL 1.0 μL0.5 μL1.0 μL 1.0 μgRNAtal 25.0 μL反转录反应先在25℃下进行5 min，然后在42 ℃条件下进行50 min。
转录反应物在70℃加热15 min后置于冰上，取反转录反应物的0.5 μL为模板，用如下的特异引物进行PCR反应。
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/special/experiment/RealtimePCR.htmRT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。
要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。
2. RT按要求做，一般不会出太大问题。
3. PCR，按常规。
但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。
如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。
如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！解答：1.RT-PCR有两种做法：条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。
但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。
（promega）。
2.RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5…，3‟RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。
3.RACE我做过RACE（3‟RACE是宝生物的Kit；5…RACE是Gibico），但现在再进行另一个同源基因的3…RACE 时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3‟UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3…UTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b－actin 和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。
有关内参：RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的mixture 统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。
问：我曾经作过同一管的PCR，内有actin 和目的基因引物。
虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。
请教mxbdna2003 ，你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度？答： it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convi enent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amount just using "accurate piptte" is wrong. it shoud be r emembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.在同一管中做RT，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶本来就是过量的^-^，（平时做pcr的时候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八两就可以了，我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。
Mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。
能看到均一条带就很好了。
关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但是摸上3、5摸总是必要的，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸的好了，还要考虑比较的不同的模板中的量，所以我们不建议再同一管中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。
有关内参的建议：一定要做内参的，每一次，我想。
不作内参的结果是不可信的电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几封帖子里都谈了，再说一边我得观点，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。
2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，3、半定量RT-PCR应该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，GC含量相似，或者实在穷的要省PCR管和taq。
关于平台期和线性期的问题，实际上线性期是指数期，只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。
看上去任何一个时期都可以，实际上是不对的，因为牵涉到酶促动力学的问题，这个我也不懂，有一些专门的文章，好像，涉及到很多化学的东西。
我们学医的，也没必要知道那些，但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系，这种反应单靠改变其中一种成分没有用的，酶一直是过量，再加酶也没用，引物ntp都是这样。
烟鬼正传，最好选线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种的契合点。
给你一张图你就明白了，再开始的时候酸的是切线，这图我在*** 帖过。
关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内含子（不过，根据要求，还可以专门设计隔内含子的，这样还可以用于基因组PCR）、长度小于500bp－600bp等等。
引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的，要在一台机器里啊。
我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这样任何几个都可以拿来披，也不用查。
我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因在它出软件的时候，还没发现呢，跟不要说在基因组的位置和序列了，怎么考虑内含子的问题呢？18s的引物也和著名的βactin一样是设计的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用总RNA为模板，但是比actin和bubulin等可准多了，更不要说GAPDH这个破烂了。
18s除了在细胞中更相同（量）外，主要是它占的比例远远高于看家基因，所以定量更加准确，我想，不知对不对，请几位主任和eeflying指教。
我认为，就像你用某一种东西的数量去概括，因该选那种多的东西，说一座房子是由2000块砖造成的，比说又29根梁更准确吧。
更不要说没有看家基因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。
PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒，就是用18s，不过我们看懂使用的那条序列，不知有没有人用过，告知其序列和genbank号。
正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上的actin的荧光探针还没有完，当初和成了一堆。
有那位高手用过18s的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列）？原位杂交最好用RNA做探针，效果好一些，反正你有钱卖roche的盒子，而且量也能保证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是了。
正义反义也容易理清。
我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。
因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明：做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。
记得我开始我的ＲＴ－PCR时，按常规方法，提取总ＲＮＡ后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了Ｎ次均没有结果。
后来考虑到本人的克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中，而该同学已经用RT-PCR克隆出她的片断（尽管她用这些ＲＴ－ＰＣＲ产物做模版再进行ＰＣＲ时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断，然后用她的ＲＴ－ＰＣＲ产物作模板（有点改进，逆转录反应换用了９mers随机引物），用我的引进物进行一般PCR，终于得到我的产物，测序结果完全正确。
尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以说明实验可以有自己的模式，书本的知识和别人的经验很重要，但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制请问：1 引物的特异退火温度怎样设定？可以根据gc 和at含量算出吗？可以用引物报告单上的Tm值吗？2 PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适？MgCl2应加多少？各个成分的量有无确定标准？3 PCR结果跑电泳，actin有，但跑不出目的条带，有几种原因？与cDNA的量少有关吗？Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性？一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的.20中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul都可以的.mg要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了.在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。
而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA 酶）的污染。
由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。
因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。
在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。
RNA 酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。
外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。
在其它分子生物学实验中使用的R NA酶也会造成污染。
这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。
而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。
一、防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。