转基因水稻潜在致敏性的安全性评价

转基因水稻潜在致敏性的安全性评价摘要:利用基因工程技术已经成功培育出抗虫､抗病､抗逆､耐除草剂和改善营养品质的转基因水稻,其安全性问题成为研究热点｡对转基因水稻上市前进行严格和科学的安全性评估是当前一个亟待解决的课题,其中一项重要内容是评估转基因食品的致敏性｡对当前国内外水稻过敏原的研究､对转基因食品潜在致敏性的安全性评价以及加工处理对致敏原的影响等研究进展进行了综述｡关键词:水稻过敏原;转基因水稻;潜在致敏性;安全性评价The Safety Evaluation on Potential Allergenicity of Genetically Modified RiceAbstract: As genetically modified rice, like insect and disease resistance, stress resistance, herbicide tolerance and improved nutritional quality, and so on, had been successfully produced by genetic engineering techniques, the security issues became a research focus. Safety assessment of transgenic rice pre-market has been a rigorous and scientific problems to be solved, an important part of which was to assess the allergenicity of genetically modified foods. The current domestic and international research on rice allergens, safety evaluation on the potential allergenicity of genetically modified food, and the impact of allergen processing research were reviewed.Key words: rice allergen; transgenic rice; potential allergenicity; safety evaluation 水稻(Oryza sativa L.)作为世界上最重要的粮食作物之一,培育高产､优质的水稻品种对世界水稻生产具有重要的现实意义｡利用基因工程技术已经成功培育出抗虫､抗病､抗逆､耐除草剂和改善营养品质的转基因水稻｡转基因水稻给人类带来的经济､社会､营养等方面的效益是明显的,然而在2005年的非法转基因水稻污染中国大米事件发生后,对转基因水稻生物安全问题的关注程度日益加强,加快推进转基因水稻产业化进程中如何最大限度地降低其可能带来的风险;发展和完善蛋白致敏原的检测､鉴定和分析方法;加强对转基因水稻的致敏性评价研究,保障其健康有序地发展,是目前面临的关键问题｡本文就转基因水稻的潜在致敏性的研究进展进行了综述｡1 水稻过敏原的研究作为人类主食被消费的谷物食物如大米､小麦､玉米等发现过敏现象后,引起科学界的高度关注｡1978年Shibadaki等[1]报道水稻蛋白具有过敏作用,1988年Matsuda等[2]运用HPLC､ELASA､SDS-PAGE及亲和层析法分离纯化得到一种存在于水稻种子胚乳中的过敏原,进一步研究发现该过敏原分子中脯氨酸(Pro)和半胱氨酸(Cys)含量比谷蛋白和球蛋白要高｡且这种过敏蛋白在100 ℃处理60 min后仍然可保持60%的过敏反应活性｡Urisu A等[3]通过进一步分离得到6种过敏蛋白,分子量分别为14､15､16､26､33､56kDa｡发现14~16 kDa过敏蛋白具有α淀粉酶抑制剂活性[4,5],33 kDa过敏原蛋白(Glb33)与细菌乙二醛酶Ⅰ有较高的同源性,具有乙二醛酶Ⅰ活性,存在于水稻成熟种子及其茎叶[6]｡水稻种子过敏蛋白(RA)属于α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂家族,RNA印迹分析,水稻种子在开花后15~20 d能最大限度地积累RA基因[7]｡2 转基因水稻潜在致敏性评价方法2001年FAO/WHO组织专家咨询委员会[8]提出了转基因食品潜在致敏性评估程序｡该程序的第一步判断基因来源;第二步进行序列相似性比较;第三步血清学试验;第四步模拟胃肠液消化试验,如有可能还要进行动物模型试验｡根据各步测试,给出致敏性的高低等级,与2000年公布的评估程序相比,去除了皮肤穿刺和双盲法食物攻击试验,增加了动物模型试验｡2.1 氨基酸序列分析根据FAO/WHO决策方案,使用SDAP､Farrp和NCBI三大数据库对蛋白潜在致敏性进行评估｡倪挺等[9]收集了目前已知的过敏原氨基酸序列以及已经研究的过敏原决定簇,建立了一个食物过敏原数据库(),专门用于过敏性评估中的序列相似性比较,该数据库提高了序列相似性分析的准确性,还包括模拟胃肠液消化试验､放射性变应原吸附抑制试验(RAST INHIBITION)等在过敏性评估中非常重要的试验方法｡在进行序列相似性比较时,使用合理的运算法则和参数十分关键｡天然过敏原的细胞表位还包括非线性的构象表位,仅通过鉴定连续的氨基酸残基是否相同来判断蛋白的过敏性可能会造成失误,局限于氨基酸一级序列的比较,并不包括蛋白质之间空间结构相似性的比较,将连续相同的氨基酸数量和相同氨基酸含量联合比较能够得到更合理的结果[10]｡目前主要采用FASTA(Fast alignment)或BLAST(Basic local alignment search too1)､Allergen online等程序[11]｡转基因表达蛋白是否引起过敏,还取决于外源基因表达产物在人的消化系统中能否快速被降解和消化,以及与高过敏患者血清学反应检测等[12]｡2.2 特异血清学试验特异血清筛选试验是判定基因表达产物是否致敏的直接方法,即检测表达蛋白与对转入基因源过敏个体的IgE反应｡然而,食物过敏不全是由IgE介导｡以IgE介导的食物致敏性评估为基础,过敏患者过敏原特异性IgE抗体有限､食品蛋白及其他过敏原之间的交叉反应性和加工食品中蛋白质修饰等都是要考虑的问题[13]｡Baldo等[14]发现,不同种谷物,例如禾本科家族的水稻､玉米､小麦､大麦､黑麦之间有交叉免疫反应,且其交叉反应程度与他们在分类学上的亲缘关系的远近相一致｡目前,治疗小麦或玉米过敏症的重要方法之一,便是用日本小米或意大利小米代替饮食中的小麦､玉米[3]｡Cry蛋白由Cry1Ac､Cry1Ab､Cry2Ab编码,存在潜在的过敏交叉反应,利用生物信息学搜索工具,识别分析任何潜在过敏原的蛋白质氨基酸序列[15]｡目前迫切需要对不同种谷物之间的交叉过敏原性及各自的免疫原性的产生机制作深入的了解｡2.3 模拟胃肠液消化稳定性20世纪70~80年代进行蛋白质的营养价值评价时,胃蛋白酶消化法被建立和发展于预测氨基酸生物利用率｡1996年,Astwood等[16]首次将体外胃蛋白酶消化方法系统地应用于食物致敏原的消化稳定性评价｡从1996~2003年FAO/WHO食品法典委员会(CAC)公布的新的转基因食品致敏性评价策略,消化稳定性试验一直是评价新外源蛋白质,尤其是通过基因工程转入传统食品中新表达的蛋白质可能致敏性的必选实验项目[17]｡很多蛋白都建立体外模拟胃肠液消化稳定性和热稳定性试验,蟹类过敏蛋白､淡水鱼类小清蛋白､鲤鱼胶原蛋白等其他水产过敏原的消化稳定性,相对于非过敏蛋白具有一定的消化稳定性[18-21]｡牛初乳IGF-I的模拟胃肠液稳定性研究表明[22],牛初乳IGF-I在模拟胃液中的稳定性随胃液pH的升高而增加,随消化时间延长而降低;初乳乳清粉中的IGF-I对模拟胃肠液消化的耐受性高于纯化的IGF-I｡2.3.1 模拟消化的影响因素体外模拟消化试验中,因为消化酶对氨基酸肽段的特异性分解位点不同有差异,不同的消化酶对同一种过敏蛋白所产生的降解产物不同｡如胃蛋白酶A优先选择苯丙氨酸或酪氨酸残基的C末端降解[23],胰蛋白酶有较强的特异性,优先选择靠近亲水性氨基酸残基Lys和Arg的P1位置,胰凝乳蛋白酶具有较宽广的特异性,它强烈地优先选择靠近芳香族氨基酸(Tyr､Trp､Phe)和Leu的Pl位置[24]｡选择合适的酶/蛋白的比值来反映人体的正常生理分泌情况是很重要的｡按照文献[25]推算,将人体分泌的胃蛋白酶活力换算成商业酶活力,人体每天分泌的胃蛋白酶与每天摄入的蛋白的比值为1∶7 500(w/w)｡振荡的速率应该和胃肠道消化过程中蠕动的速率相关｡胃中的转动和短波的移动通常大约为每分钟3次｡而在小肠中的蠕动速率则不同,十二指肠中为11.7次/min,回肠为8.9~9.8次/min｡因此,把胃和小肠的蠕动速率调到3次/min和10次/min是相对合理的[26]｡在pH 1.2蛋白质消化率比pH 2.0的高[27]｡pH和胃蛋白酶浓度的差异,只轻微影响中等稳定的蛋白质消化:刀豆素A､卵清蛋白､溶菌酶;不影响极易消化或稳定的蛋白质｡通过胃蛋白酶活性的验证和消化的目标端点的确定,食物中新蛋白质的安全性评估结果更具有可比性[28]｡2.3.2 模拟胃肠液消化研究王兴等[29]探索苦荞蛋白质体外消化过程中的动力学特性及其抗氧化活性变化,建立苦荞蛋白质体外消化动力学模型,所得水解度指标与抗氧化活性指标有较强的相关性,建立模型与实际观测结果符合良好｡研究转基因大豆的消化稳定性评估下的生理体外消化和发酵模型,未经胃肠液完全降解的蛋白片段,可能会导致结肠癌｡研究蛋白在结肠发酵后的降解情况,结合美国药典和模仿人类生理条件的胃肠道分泌,食物的摄入量与唾液､胃液､胆汁､胰液的比例分别为2.5∶1.0∶1.5∶1.0∶1.0｡结果显示结肠发酵24 h后没有发酵产物,证实新的蛋白质不会导致结肠癌;在胃液中其完全消化的时间很短,转基因大豆CP4EPSPS没有潜在的致敏性[30]｡王利民等[31]将大豆凝集素设为1､2､3､4､5 mg/mL 5个浓度梯度,分别与等体积的模拟胃液或模拟肠液混合,胃蛋白酶降解大豆凝集素主要发生在反应的初始阶段,随着反应时间的延长降解速率逐渐变慢,但反应一直在进行;随着大豆凝集素浓度的增加,降解速率增大,但彻底降解所需的时间延长,底物浓度从1 mg/mL增加到5 mg/mL,完全降解的时间为9.5和23.0 min ｡蛋白质消化稳定性是评价其潜在致敏性的重要参考依据,其与食物过敏的关系须考虑试验条件､食物致敏原类别和食物基质及食物加工等多因素的影响[32]｡进一步促进体外消化稳定性试验的标准化,建立成熟､完整的体外消化模型进行外源蛋白质的消化稳定性评价｡2.4 动物模型研究根据2001年FAO/WHO生物技术食品过敏性联合专家咨询会议的转基因食品潜在致敏性树状评估策略,定向筛选血清学试验和动物模型成为探测未知过敏原的新方法,并明确提出动物模型是评价转基因作物潜在致敏性的更有决定性的､也更为整体的一种方法[8]｡2.4.1 啮齿类动物模型许多动物模型如小鼠､大鼠､猪等在揭示食品过敏机理方面已有较多报道[33-38]｡其中啮齿动物相对容易饲养,费用低,试验时间短,便于研究致敏和激发期不同阶段的过敏反应,小鼠模型具有高水平IgE反应､多样的免疫学和分子学反应物,小鼠和人类之间相似的抗体决定簇也证明小鼠是用于人类食品过敏研究的有效模型｡建立动物模型试验系统标准,对过敏性反应表征的测试,包括免疫､过敏性反应的测量､材料标准化､验证资格和程序等[39]｡理想的模式应试验方法简单,重现性好,可区分出与人类的过敏性反应有关的过敏性预测阈值以及足够的特异性和敏感性[40]｡通过大米过敏原的BALB/c小鼠经口灌胃模型,了解大米蛋白的致敏性和免疫学潜在的食物过敏症发展的病理､生理机制｡结果显示搔抓行为和血管通透性增加,大米蛋白特异IgE､小肠上皮炎症损伤等出现阳性结果｡水稻过敏BALB/c小鼠模型的研究,将为进一步分析免疫机制､评价各种大米或其他谷物过敏原的致敏性､大米过敏原免疫疗法等提供基础[41]｡孙拿拿等[42]研究C3H/HeJ小鼠可以作为食品致敏性评价动物模型,经口灌胃途径及腹腔注射途径的最佳致敏周期分别为14和28 d｡然而也有对BALB/c小鼠作为食物过敏动物模型的可行性持怀疑态度的,吕相征等[43]发现常见致敏食物蛋白质卵清蛋白(OV A)和大豆胰蛋白酶抑制剂(TI)､不常见致敏食物蛋白质牛血清白蛋白(BSA)和无致敏史食物蛋白质马铃薯酸性磷酸酶(PAP)均可使BALB/c小鼠产生过敏反应｡2.4.2 其他模型研究用短尾猴经口灌胃含7Crp(7-T细胞来自杉树花粉的抗原表位过敏原,可被利用来控制人类的花粉过敏)转基因水稻,进行26周以上的安全评估试验,各组之间血液或生化值无显著差异｡也没有病理症状和组织病理学异常的变化,表明经口灌胃含有7Crp转基因水稻无不良影响,是安全的[44]｡转基因Btl76玉米的安全性研究[45],用含该种抗虫基因玉米的饲料喂养母羊及它们的后代3年,未发现试验对受试动物的健康和各种性状有不利影响,也未检测到瘤胃中微生物或动物组织有任何横向基因变化｡用电镜对肝脏和胰腺的初步分析显示,小羊羔由于含较小细胞核而增加了异染色质颗粒和染色质旁颗粒的数量｡许多研究仍在继续,以期找到合适的动物模型,能较好地模拟人的抗体反应,甚至与致敏性病人同样的临床反应｡3 食品致敏原潜在过敏性的解决方法2006年国际生命科学学会健康和环境科学研究所蛋白质致敏技术委员会组织[46],讨论食品加工对食品潜在致敏性的影响,调查食物过敏机制,通过适当的方法验证和确定蛋白过敏原｡食品抗原表位的多重模式､食物过敏患病率的地理变异和遗传因素等都需要进一步探索｡食品加工可能增加或减少蛋白质的内在过敏性,然而目前的数据没有精确地确定影响蛋白质的致敏性的特定变量｡对过敏患者最重要的是避免接触过敏原,减少过敏反应的发生,不仅要求对过敏原的精确研究和鉴定,还要有降低食品过敏原潜在致敏性的科学方法｡3.1 加工处理发芽和热处理对可溶性蛋白质(包括14~16kDa和26kDa的过敏原)降解的影响表明,26kDa和14~ 16kDa的过敏原降解的最适pH分别为4､5~7,半胱氨酸蛋白酶参与降解｡两大过敏原以不同的方式降解,可能是谷物在发芽过程中产生不同蛋白酶的作用[47]｡3.2 体外免疫建立体外免疫产生抗原特异性的人类单克隆抗体｡对大米过敏蛋白(RA)的可溶性蛋白进行体外免疫,对AC7-1/F9､CB7-1/E2和CB7-8/F5 3个B细胞克隆,产生RA特定的人类单克隆IgM抗体｡RA分子可能会引发过敏反应抗原表位区域的信息,可以对大米过敏进行特异性免疫[48]｡3.3 过敏治疗目前对过敏治疗,接种疫苗是最有效的科学方法｡重组基因主要是改造过敏原,减少过敏活性分子和内在抗原性｡制定的过敏疫苗能显著降低与IgE抗体特异性结合作用,不会导致过敏性反应｡14~16 kDa的水稻盐溶蛋白,能与对水稻过敏的患者IgE抗体反应｡从水稻种子的cDNA文库中分离编码这些过敏性蛋白,采用反义RNA抑制成熟水稻种子过敏原基因的表达｡免疫印迹和16 kDa过敏原的单克隆抗体酶联免疫吸附分析表明,转基因水稻种子的过敏原的含量明显低于父母的野生型水稻种子[49]｡血清学和2D-DIGE分析相结合是一种在质量和数量上评估转基因食品过敏原的有效方法[50]｡分子生物学､生物化学和营养学的结合将为食品安全评估提供更有效的信息[51]｡可以进一步改善未来的测试方法｡4 总结转基因水稻的安全性一直是各国政府及消费者十分重视的问题,各国也在对不断涌现的转基因水稻进行极为严格､审慎的评估,评价方法和决策都在不断地发展｡结合我国转基因作物的发展态势,建立针对转基因水稻完善的致敏性评估体系,加快完善我国转基因产品潜在致敏性的评估系统,借鉴国际先进的风险评估标准和技术,完善转基因水稻风险评估方法和策略,特别是对有关数据库资料和特异性血清库的不断完善,以及测试方法的标准化工作亟待加强｡实现转基因水稻的安全､合理发展,实现转基因作物技术持续发展｡参考文献:[1] SHIBASAKI M,SUZUKI S,NEMOTO H,et al. 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