报告基因法测定干扰素活性
制药工程生物实验报告
实验名称：重组人干扰素α2b的表达与纯化实验日期：2023年4月10日实验目的：1. 掌握重组蛋白的表达方法。
2. 学习重组蛋白的纯化技术。
3. 了解生物工程在制药领域的应用。
实验原理：重组人干扰素α2b（rhIFNα2b）是一种具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的生物活性蛋白。
本实验采用原核表达系统，将rhIFNα2b基因构建到表达载体中，转化大肠杆菌，通过诱导表达、离心分离、离子交换层析和凝胶过滤层析等方法，实现对rhIFNα2b的纯化。
实验材料：1. 基因组DNA2. 质粒载体3. 大肠杆菌DH5α4. 重组表达载体5. IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）6. 诱导剂（如甘油、葡萄糖等）7. 离心机8. 层析柱9. 超纯水10. 透析袋11. 紫外分光光度计12. 纯化试剂盒实验步骤：1. 基因克隆：将rhIFNα2b基因从基因组DNA中扩增，连接到质粒载体上，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。
2. 表达载体构建：将阳性克隆的质粒提取，进行PCR鉴定，确认目的基因的正确插入。
3. 重组表达菌株的诱导表达：将重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3），挑选阳性克隆，在含有IPTG的培养基中诱导表达。
4. 离心分离：收集诱导表达后的菌体，离心分离菌体和上清液。
5. 粗蛋白提取：将上清液用硫酸铵进行盐析，收集沉淀，复溶于超纯水中。
6. 离子交换层析：将粗蛋白溶液上样至离子交换层析柱，用不同浓度的NaCl溶液进行梯度洗脱，收集目标蛋白峰。
7. 凝胶过滤层析：将离子交换层析后的蛋白溶液上样至凝胶过滤层析柱，收集目标蛋白峰。
8. 蛋白纯度鉴定：利用SDS-PAGE电泳、紫外分光光度计等方法鉴定蛋白纯度。
实验结果：1. 成功构建了rhIFNα2b基因的原核表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3）后，诱导表达得到目标蛋白。
2. 通过离子交换层析和凝胶过滤层析，成功纯化了rhIFNα2b蛋白，纯度达到95%以上。
荧光素酶报告基因实验的用途
荧光素酶报告基因实验的用途
荧光素酶报告基因实验是一种常用的生物技术实验，其用途主要有两个方面。
一、检测基因转录活性
荧光素酶报告基因实验可以用来检测基因的转录活性，即某一特定基因在细胞中是否被转录成RNA。
实验中，将荧光素酶基因与待测基因的启动子序列连接，构建成荧光素酶报告基因，然后将其转染到细胞中。
若待测基因的启动子序列在该细胞中被活化，则会促使荧光素酶基因转录成mRNA，再进一步转化成荧光素酶，从而发出荧光信号。
通过测量荧光信号的强度，可以判断待测基因的转录活性。
二、筛选基因调控剂
荧光素酶报告基因实验还可以用来筛选基因调控剂，即寻找能够调节某一特定基因转录活性的化合物。
实验中，将荧光素酶基因与待测基因的启动子序列连接，构建成荧光素酶报告基因，然后将其转染到细胞中。
接着，将待测化合物加入细胞培养基中，观察荧光信号的变化。
若待测化合物能够促进或抑制待测基因的转录活性，则会对荧光信号产生影响。
通过比较不同化合物对荧光信号的影响，可以筛选出能够调节待测基因转录活性的化合物。
总之，荧光素酶报告基因实验是一种重要的生物技术实验，可用于检测基因转录活性和筛选基因调控剂，具有广泛的应用前景。
重组猪_干扰素的纯化及生化性质鉴定
重组猪α-干扰素的纯化及生化性质鉴定邵 菁1,2,于瑞嵩2,3,董世娟2,3,朱于敏2,3,沈世缘2,3,曹祥荣1,李 震2,3(1.南京师范大学生命科学学院,江苏南京210046)(2.上海市农业科学院畜牧兽医研究所,上海201106)(3.上海市农业遗传育种重点实验室,上海201106)[摘要] 对巴斯德毕赤酵母高效分泌表达的猪α2干扰素(Po I F N 2α)纯化工艺和纯化后重组蛋白的部分生化特性进行了研究,结果表明:猪α2干扰素(Po I F N 2α)发酵液经离心、透析、过滤处理之后,依次利用亲和层析和离子交换层析使目的蛋白得到了纯化.经N 端氨基酸测序,W estern 2bl ot,对酸、热、巯基乙醇的稳定性和糖基化程度等检测后发现,所表达的猪α2干扰素N 端氨基酸序列(前5个)正确,对酸和热基本稳定,二硫键对目的蛋白的活性至关重要,没有发现目的蛋白的糖基化.[关键词] 重组猪α2干扰素(Po I F N 2α),亲和层析,离子交换层析,糖基化,生化性质[中图分类号]S852.4 [文献标识码]A [文章编号]100124616(2008)022*******Pur i f i ca ti on of Recom b i n an t Porc i n e 2αI n terferon and the Iden ti f i ca ti on of its B i ochem i ca l Character isti csShao J ing 1,2,Yu Ruis ong 2,3,Dong Shijuan2,3,Zhu Yum in2,3,Shen Shiyuan2,3,Cao Xiangr ong 1,L i Zhen2,3(1.School of L ife Science,Nanjing Nor mal University,Nanjing 210046,China )(2.Ani m al Husbandry and Veterinary Research I nstitute,Shanghai Acade my of Agricultural Sciences,Shanghai 201106,China )(3.ShanghaiMunici pal Key Laborat ory of Agri 2Genetics and B reeding,Shanghai 201106,China )Abstract:I n this study,we devel oped the technique f or purifying recombinant porcine 2αinterfer on (Po I F N 2α)that was efficiently exp ressed by Pichia Past oris and studied the bi oche m ical characteristics of Po I F N 2α.Recombinant porcine I F N 2αwas purified t o homogeneity by affinity chr omat ography and i on 2exchange chr omat ography stepwisely after centrifu 2gati on 、dialysis and filtrati on .The results of its bi oche m ical characteristics showed that the first five a m ino acids of N -ter m inal of the purified p r otein was correct .The p r otein was heat and acid 2stable and the dithi olate 2bond was crucial t o the p r otein activity .No glycosylati on were f ound on the target p r otein .Key words:recombinant porcine α2interfer on (Po I F N 2α),affinity chr omat ography,i on 2exchange chr omat ography,glyco 2sylati on,bi oche m ical characteristics 收稿日期:2007207202.基金项目:上海市农业科学院青年科技发展基金(农青年科技2005-02)资助项目.通讯联系人:李 震,研究员,研究方向:动物生物技术,E 2mail:zhenli@ 干扰素(I nterfer on,I F N )是一类重要的细胞因子,具有种属特异性,在同种细胞上具有广谱的抗病毒、抗细胞增殖、免疫调节等多种生物活性.根据干扰素的来源和性质可分为Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素[1,2].猪干扰素(Po I F N )也可分为I 型和Ⅱ型,I 型包括α、β、ω和τ4种,Ⅱ型仅有γ1种.I 型猪干扰素基因无内含子,基因组中一般含有多个I 型猪干扰素基因[3].猪I F N 2α(Po I F N 2α)基因家族分为二类同源的、但明显不同的基因类型:Po I F N 2α1和Po I F N 2α2.目前,Po I F N 2α1基因已经在真核和原核细胞中得到表达,但相关的分离纯化报道很少.通过研究表明,Po I F N 2α可被用作动物疫苗的免疫增强剂和猪病毒病的治疗剂[4,5],因此,在获得较高水平表达产物的基础上,探索重组Po I F N 2α的分离纯化工艺,具有重要的理论意—79—第31卷第2期2008年6月 南京师大学报(自然科学版)JOURNAL OF NANJ I N G NOR MAL UN I V ERSI TY (Natural Science Editi on ) Vol .31No .2Jun,2008义和实践价值.1 材料和方法111 材料111.1 试剂 磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、Tris 、甲醇、氯化钠、三氟甲基磺酸、苯酚、脱氧胆酸钠和三氯乙酸购自上海国药生物公司,辣根过氧化物酶、P VDF 膜和咪唑购自上海西唐生物公司,BCA 试剂盒购自Pierce 公司.11112 设备及仪器高速离心机(Sig ma ),凝胶电泳仪(B i o 2rad ),凝胶图像处理系统(上海Tanon ),pH 计(M illi pore ),M il 2li pore 012μm 滤器(Pall ),截留相对分子质量3500的透析袋(上海华美),FP LC 分离纯化系统和H isTrap HP Kit 亲和预装柱(安玛西亚),H isTrap DE AE FF 离子交换预装柱(GE Healthcare ),真空干燥器(Sa 2vant ).112 方法11211 纯化 发酵液于4℃12000r/m in 离心15m in,收集上清液;上清液用pH810、P O -3420mmol/L 、NaCl 500mmol/L 透析24h 后,于4℃10000r/m in 离心15m in,再次收集上清液;上清液经过012μm 微孔滤器过滤后上样金属N i 2+亲和预装柱(1mL ),通过不同浓度的咪唑进行阶段洗脱,收集流出峰并测其活性;活性峰用pH 716、Tris 20mmol/L 透析24h 后,上样DEAE FF 离子交换预装柱(1mL ),通过不同浓度的NaCl 阶段洗脱,收集流出峰并测其活性.11212 活性检测猪α2干扰素的活性检测采用W I SH 细胞(人羊膜传代细胞株)-VS V (滤泡性口炎病毒)抗病毒系统[6].I F N 抗病毒活性单位的定义是指能抑制50%细胞病变或50%病毒空斑形成效应的I F N 最高稀释度的倒数.11213 纯度检测S DS -P AGE 银染电泳鉴定纯度[7].11214 蛋白浓度测定蛋白浓度用BCA 试剂盒,具体步骤见盒中说明书.11215 蛋白质免疫印迹样品先进行S DS -P AGE 电泳,结束后切下含有目的蛋白的胶;将NC 膜和3mm 滤纸按海绵垫—滤纸(3张)—凝胶—NC 膜—滤纸(3张)—海绵垫的结构放入转印电泳槽,冰浴下200mA 恒流转印3h .结束后将NC 膜依次置于:封闭液中振摇1h,用封闭液稀释为1∶6000的鼠抗Po I F Nα一抗中振摇1h;P BST 中洗3次,每次10m in;用封闭液稀释为1∶5000的HRP 标记山羊抗小鼠I g G 的二抗中振摇1h;P BST 洗3次,每次10m in .最后将膜浸入底物溶液中直至适中的颜色出现,用去离子水冲洗终止反应.11216 蛋白质N 端氨基酸序列、等电点(p I )的测定委托上海中科院生化与细胞所测试中心检测.11217 对酸、热、巯基乙醇稳定性的检测①猪α2干扰素对酸的稳定性:将1mL 纯化的蛋白样液在4℃下置于pH 210、20mmol 的磷酸二氢钠溶液中透析24h .②猪α2干扰素对热的稳定性:将1mL 纯化的蛋白样液放入Eppendorf 离心管中,置于56℃水浴锅内1h .③猪α2干扰素对巯基乙醇的稳定性:将200mmol β-巯基乙醇加入纯化的蛋白样液中,在4℃下置于pH 714的磷酸二氢钠溶液中透析24h .通过抗病毒系统检测猪α2干扰素的活性[8].11218 糖基化修饰的初步鉴定(1)辣根过氧化物酶(HRP )的糖链切割:取一定量HRP 于Eppendorf 离心管中,依次加入100μL 三氟—89—南京师大学报(自然科学版) 第31卷第2期(2008年)甲基磺酸和50μL 苯酚,于0℃1000r/m in 旋转1h,加100μL 20mmol/L Tris 终止反应,并于4℃pH 714、20mmol 磷酸缓冲液内透析24h;用三氯乙酸沉淀法沉淀,加入适量的样品缓冲液后进行S DS -P AGE 电泳[9,10].(2)猪α2干扰素的糖链切割:先通过三氯乙酸沉淀法将目的蛋白沉淀,冷冻抽干后,按方法(1)对目的蛋白进行糖链切割.2 结果与分析211 纯化 图1显示亲和层析后(泳道4)的杂蛋白量已经大幅减少,再经离子交换层析分离纯化后(泳道6),可以获得较为单一的目的蛋白.表1显示了这一纯化路线的纯化效果,最终的蛋白比活为115×104I U /mg,蛋白回收率为1133%,纯化倍数为0127.表1 猪α2干扰素的分离纯化的效果Table 1 Par i f i ca ti on eff i c i ency of Po I FN 2α样品蛋白浓度/(mg/mL )蛋白活力/(×104I U /mL )蛋白比活/(×104I U /mg )蛋白收率/%纯化因子上样前发酵液3100237167100—亲和上样前透析液116461183177541670149亲和上样收集的峰017321062182241330175离子交换前透析液01110161515531671197离子交换收集的峰01040106115011330127212 W estern bl ot 、蛋白质N 端氨基酸序列和等电点(p I )的测定检测发现相对分子质量16100和210002条蛋白的N 端前5个氨基酸序列均是E -A -E -A -X,对照猪α2干扰素N 端前5个氨基酸序列(C -D -L -P -Q )和载体α信号肽最后5个氨基酸序列(R -E -A -E -A )发现,所测的前4个氨基酸序列是载体α信号肽末端未切除的部分;X 在一般情况下是C,正好是目的蛋白的第一个氨基酸,这样连同W estern bl ot 分析结果(图2)均证明,在16100和21000出现的2条蛋白N 端保持完好,且均是猪α2干扰素.另外,相对分子质量16100的目的蛋白等电点为415～418,而用软件分析猪α2干扰素裸蛋白的等电点为614.表2 猪α2干扰素对酸、热、巯基乙醇的稳定性Table 2 The st ab ility of Po I FN 2αi n face of ac i d 、hea t and m ercaptoethanol条件活性未经处理酸(pH210)热(56℃,1h )巯基乙醇(200mmol )干扰素滴度/(I U /mL )628503312邵 菁,等:重组猪α-干扰素的纯化及生化性质鉴定213 对酸、热、巯基乙醇稳定性的检测表2说明在酸、热和巯基乙醇存在的条件下:猪α2干扰素在pH210时基本稳定,在56℃1h内具有一定的稳定性,而它对巯基乙醇则十分敏感,表明二硫键对维持其活性有着非常重要的作用.214 糖基化修饰的初步鉴定图3显示HRP经TF MS切割后相对分子质量由40000左右移至30000附近,说明TF MS法确实能够切除糖蛋白的糖链.图4显示16100和21000这2条带经TF MS法切割后,并没有出现位置上的明显变化,所以初步认为表达的猪α2干扰素没有发生糖基化.3 讨论在金属螯合亲和层析纯化过程中,本文选用咪唑为竞争性物质,通过改变咪唑浓度来洗脱目的蛋白.实验中目的蛋白洗脱下的咪唑浓度较低,显示目的蛋白结合不很牢固,可能与蛋白质的空间结构有关,也可能与目的蛋白C末端H is的降解有关;在离子交换层析纯化过程中,缓冲液的pH值是影响分离效果的关键因素之一,实验中选用的pH716缓冲液可以较好地达到分离纯化重组猪α2干扰素的目的.从整个纯化效果来看,蛋白回收率、比活和纯化因子都不理想,可能的原因是:在纯化过程中,①一些含有目的蛋白组分较高、但纯度不是很高的样品不得不被放弃;②有相当一些目的蛋白可能因为外界条件的变化而改变了其空间构象,造成目的蛋白的失活.本实验中的目的蛋白C端理论上带有15个氨基酸残基的抗原表位和6个组氨酸残基,如果表达完整,相对分子质量应该在21000左右.实验结果显示相对分子质量在16100和21000的2条蛋白均是目的蛋白,造成两者相对分子质量差异的原因可能是:大部分目的蛋白C末端的6个H is,甚至15个抗原表位氨基酸残基已经降解.另外,目的蛋白理论等电点应在614左右,这与所测的415～418也有明显差异,可能的原因是:目的蛋白C端的15个抗原表位氨基酸序列(E-Q-K-L-I-S-E-E-D-L-N-S-A-V-D)中有5个是酸性氨基酸,只有1个是碱性氨基酸,这也说明目的蛋白C末端6个H is可能已经部分或全部降解,从而导致整个蛋白的电负性增加.三氟甲基磺酸法(TF MS)可以切除与肽链直接相连的单糖以外的所有糖基,而肽键则在同样的条件下保持稳定,最后通过电泳比较糖链切割前后蛋白相对分子质量的变化来判断某一蛋白是否糖基化.该法反应温和,速度很快,对糖基化类型没有选择性,可以作用于所有类型的糖链.经过TF MS法切割后的目的蛋白(图3、图4)相对分子质量未发生明显变化,故初步判断目的蛋白没有糖基化.(下转第104页)[9] Nadl ong L.Sepueira L.I ncrease in per oxidase activities are not directly involved in induced resistance in t obacco[J].Physi2ol Plant Pathol,1980(16):128.[10] 宋平,曹显祖,吴永宏,等.水稻矮秆基因对G A3敏感性的酶学基础[J].江苏农学院学报,1994,15(4):10213.[11] Giannopolitis C N,R ice S K.Super oxide dis mutase.Purificati on and quantitative relati onshi p with water2s olube p r otein inbreeding[J].Phant Physi ol,1977(59):3152318.[12] 刘惕若,陈洁敏,郭彦太,等.小麦品种对赤霉病的抗性研究[J].黑龙江八一农垦大学学报,1995(1):125.[13] 刘道宏.植物叶片的衰老[J].植物生理学通讯,1983(2):14219.[14] 林植芳,李双顺,林桂珠,等.水稻叶片的衰老与超氧化物歧化酶活性及脂质过氧化作用的关系[J].植物学报,1984,26(6):6052615.[15] 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报告基因法测定干扰素活性
报告基因法测定干扰素活性附录ⅩC 干扰素生物学活性测定法第2法报告基因法（适用于Ⅰ型干扰素）本法系将含有干扰素刺激反应元件和荧光素酶基因的质粒转染到HEK293细胞中，构建细胞系HEK293puroISRE-Luc，作为生物学活性测定细胞，当Ⅰ型干扰素与细胞膜上的受体结合后，通过信号转导，激活干扰素刺激反应元件，启动荧光素酶的表达，表达量与干扰素的生物学活性成正相关，加入细胞裂解液和荧光素酶底物后，测定其发光强度，，得到标准品溶液生物学活性对其化学发光强度的剂量反应曲线，以此测定Ⅰ型干扰素生物学活性。
试剂（1）完全培养液MEM培养液，含有2mM的L-谷氨酰胺，1mM的丙酮酸钠，0.01mg/L的非必需氨基酸，2μg/ml的嘌呤霉素，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素，10%的胎牛血清。
4℃保存。
（2）测定培养液除不含嘌呤霉素外，其它成分与完全培养液相同。
4℃保存。
（3）PBS 取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。
（4）消化液称取乙二胺四乙酸二钠0.2g、胰酶2.5g，用PBS溶解并稀释至1000ml，除菌过滤。
4℃保存。
（5）荧光素酶报告基因检测试剂盒包括细胞裂解液、荧光素酶底物等。
标准品溶液的制备取重组人干扰素生物学活性测定国家标准品，按说明书复溶后，用测定培养液稀释至每1ml约含10000IU。
在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。
在无菌条件下操作。
供试品溶液的制备将供试品按标示量溶解后，用测定培养液稀释成每1ml约含10000IU。
在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。
在无菌条件下操作。
测定法使HEK293puroISRE-Luc细胞在完全培养液中贴壁生长。
按1∶4传代，每周2～3次，于完全培养液中生长。
取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗1次后消化和收集细胞，用测定培养液配制成每1ml含3.5×105～4.5×105个细胞的细胞悬液。
实验报告——精选推荐
实验报告细胞培养实验写报告内容1⽬的2 原理3材料与⽅法（操作步骤）4实验结果5结论或结果分析实验⼀鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养实验⼆滤泡性⼝炎病毒（VSV）的增殖（纯培养）实验三 Hep-2细胞的传代培养实验四 VSV TCID50滴定实验五⼲扰素活性（效价）的测定实验六 VSV中和试验（稀释⾎清固定病毒法）实验⼆鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养⼀、⽬的1、掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤；2、掌握活细胞的显微镜下观察；3熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断⽅法。
⼆、原理离体动物组织通过温和的⼿段（机械和酶消化）形成单个细胞后，在适宜的外界环境中，包括温度、酸碱度和⽓相环境，并给予充⾜合适的营养条件，能⽣存、⽣长形成单层细胞，这种原代培养的细胞具有原来体内所具备的基本特性，⽐如肌⾁细胞的收缩功能；上⽪细胞的分泌功能等。
通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第⼀次进⾏传代之前的这⼀段时期称为原(初)代培养。
原代细胞最接近体内细胞的特性，因⽽对外界环境的变化也最敏感，因此⽐较适合病毒的增殖，药物的作⽤机制等的研究。
三、材料（按2⼈/组的量发放）四、操作步骤1、在DMEM和Hank’s 液中分别⽆菌操作以1％的量加⼊双抗，吸出10～15mlHank’s 液⾄⽆菌平⽫中备⽤；2、碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚⽓室外卵壳；3、取出两只⽆菌平⽫，并标记①和②，待⽤。
4、⼤镊⼦轻敲卵壳顶部然后⼩⼼去掉⽓室外卵壳；5、消毒镊⼦后⼩⼼撕破卵膜，两⼈互相配合取出鸡胚置于盛有Hank’s 液的平⽫①中，⼩⼼去头、内脏、⽖和粘液及⾎球，洗涤后置于盛有Hank’s 液的平⽫②中，再充分洗涤；6、取出洗净的组织块置于⼤青霉素瓶中，在⽕焰附近⽤⽆菌眼科剪⼑将其剪成约0.5～1mm3的⼩块（约250次），此时体积约0.5ml；⽤Hank s’液洗涤两次。
7、按照10倍量加⼊0.25％胰蛋⽩酶，调节pH⾄约7.3～8.0（⾁眼观为⾁红⾊）盖上瓶塞，写好标记；8、将上述细胞瓶置于37℃⽔浴中，开始计时，约15～30min，其间缓慢摇匀以充分消化。
SARS-CoV-2非结构蛋白1抑制Ⅰ型干扰素应答反应
•基础研究•SARS-CoV-2非结构蛋白1抑制I型干扰素应答反应马睿忆董晓婧肖霞雷晓波王健伟中国医学科学院北京协和医学院病原生物学研究所1〇〇730通信作者：雷晓波，Email:fyleixb@,电话：************【摘要】目的探讨新型冠状病毒（severe acute respiratory syn(lrome coronavirus 2, SARS-CoV-2 )非结构蛋白 1( nonstructural protein 1, NSPl )对I型干扰素（type I interferon, 1FN-I)应答的影响及其作用机制。
方法为研究SARS-C〇V-2的NSP1对I型IFN产生的影响，构建NSP1表达质粒，并通过免疫荧光检测其蛋白表达能力。
通过双荧光素酶报告基因实验检测NSP1对IF N-P启动子激活的作用。
构建NSP1突变体Ml (K163AH164A)和M2(A16卜180)，验证突变位点对IFN-P启动子激活的影响。
结果NSP1显著抑制维甲酸诱导基因蛋白I、黑色素瘤分化相关蛋白5、线粒体抗病毒信号蛋白、TANK结合激酶1、干扰素调节因子3、干扰素调节因子7诱导的下游IFN_p启动子的激活，并对丨型丨FN通路的各关键分子的蛋白表达具有抑制作用，NSP1C端的KH基序是其发挥抑制作用的关键位点。
结论SARS-C〇V-2N SPl能够拮抗宿主I型干扰素免疫应答，实现病毒的天然免疫逃逸。
【关键词】SARS-CoV-2; NSP1; I型干扰素基金项目：国家重点研发计划（ 2020YFA0707600 );国家自然科学基金（81971948 );国家科技重大专项课题（2018ZX10301401 )DOI：10.3760/cma.j.issn. 1673-4092.2021.02.007SARS-CoV-2 nonstructural protein 1inhibits type-I interferon responseMa Ruiyi, Dong Xiaojing, Xiao Xia, Lei Xiaobo, Wang JianweiInstitute o f Pathogen Biology, Chinese Academy o f Medical Science and Peking Union Medical College,Beijing 100730, ChinaCorresponding author: Lei Xiaobo, Email:***************,Tel: 0086-10-67855226【Abstract 】Objective To investigate the effect of nonstructural protein 1(NSP1) of severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) on the response of type-I interferon (IFN-I). Methods Theexpression plasmid of NSP1 was constructed and the protein expression was detected by immunofluorescencemethod. The effect of NSP1 on IFN-P promoter activation was detected by dual-luciferase reporter assaysystem. The NSP1 mutants Ml (K163AH164A) and M2 (A 161-180) were constructed to verify the effectof mutated sites on IFN-p promoter activation. Results NSP1 significantly inhibited the activation ofIFN-P promoter induced by retinoid acid-inducible gene I, melanoma differentiation-assoaciated protein 5,mitochondrial antiviral-signaling protein, TANK binding kinase 1, interferon regulatory factor 3, interferonregulatory factor 7, and significantly inhibited the protein expression. The KH motif at the C-terminal of NSP1was the key functional site. Conclusions SARS-CoV-2 NSP1 can antagonize the immune response of type Iinterferon and realize innate immune evasion of the virus in host cells.【Keywords】SARS-CoV-2; NSP1; Type I interferonFund programs: National Key R&D Program of China (2020YFA0707600); National NaturalScience Foundation of China (81971948); National Major Science and Technology Project for Control andPrevention of Major Infectious Disease in China (2018ZX10301401)DOI：10.3760/cma.j .issn. 1673-4092.2021.02.007新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019, C O V I D-19)对世界公共卫生和全球经济发 展带来巨大威胁，对新型冠状病毒的致病机制及 抗病毒药物的研究迫在眉睦。
干扰素(IFN)检测及临床意义
干扰素（IFN）检测及临床意义
一、概述
1、干扰素-γ(IFN-γ) 是细胞因子的一种，主要是T细胞和NK细胞等产生的一种促炎细胞因子。
它拥有不同的免疫作用机制，在多个信号通路中产生免疫调节反应；IFN-γ具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能。
2、根据干扰素细胞来源不同、理化性质和生物学活性的差异，可分为IFN-α、IFN-B、IFN-γ；IFN-γ也叫亚型干扰素，主要由活化T细胞和NK细胞产生，人IFN-γ成熟分子以同源二聚体糖蛋白形式存在。
二、检测方法
IFN-γ主要检测方法为生物素亲合素系统的双抗体夹心ELISA法和放射免疫法(RIA)。
三、临床意义
1、IFN-γ与感染
IFN-γ能诱导细胞对病毒感染产生抗性，它通过干扰病毒基因转录或病毒蛋白组分的翻译，从而阻止或限制病毒感染。
广谱抗病毒功能诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，增
强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，并协同促进机体对病毒感染细胞的清除。
2、IFN-γ与肿瘤
IFN-γ是体内最重要的细胞因子之一,它可以调节多条关于肿瘤增殖表达基因的途径.可以影响肿瘤细胞周期变化并加快肿瘤细胞凋亡，抑制细胞增殖与生长，有着重要的抗肿瘤作用。
恶性实体瘤患者外周血淋巴细胞产生干扰素的能力明显降低，细胞免疫缺陷的患者IFN-Y 产生能力下降，如AIDS 患者，这也是导致致死性病毒感染的原因之一。
3、IFN-γ与自身免疫性疾病
自身免疫性疾病患者血清中，IFN-γ水平明显上升，如类风湿关节炎、硬皮病、活动性红斑狼疮，而非自身免疫患者血清中很少能查到IFN-γ改变，因此血清IFN-γ水平测定能区分是否患自身免疫性疾病，以及了解疾病的活动期。
干扰素类药物的研究
干扰素类药物的研究摘要：干扰素是介导在对病毒感染、调节免疫功能以及细胞分化方面有重要作用的细胞因子，在现代的生物技术药物研究应用过程中，干扰素的作用逐渐被了解，并广泛应用于临床治疗中。
本文概述了干扰素类药物在临床应用中的生物学效应、生产技术、药物设计及分析方面的研究。
关键词：干扰素，生物技术，药物设计，药物分析Abstract:Interferon is a kind of cytokines which plays an important role in the virus infection, regulate immune function and cell differentiation .In the process of modern biotech drugs’research and application, the role of interferon is gradually understood, and is widely used in clinical treatment. This paper summarizes the biological effect, production technology, the drug designning and analysis research of interferon drugs in the clinical application .Keywords: interferon,biological technology, drug analysis, drug design干扰素是细胞因子家族中最早被发现的，是真核细胞对病毒感染和其他生物学诱导物反应时生成的天然的蛋白和糖蛋白家族。
干扰素介导在对病毒感染和其他生物学诱导物反应中抗病毒、抗增殖和免疫调节的细胞因子。
随着生物技术的发展，干扰素类生物技术药物研究不断加深，在临床上得到了大力的发展和应用。
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附录ⅩC 干扰素生物学活性测定法
第2法报告基因法（适用于Ⅰ型干扰素）
本法系将含有干扰素刺激反应元件和荧光素酶基因的质粒转染到HEK293细胞中，构建细胞系HEK293puroISRE-Luc，作为生物学活性测定细胞，当Ⅰ型干扰素与细胞膜上的受体结合后，通过信号转导，激活干扰素刺激反应元件，启动荧光素酶的表达，表达量与干扰素的生物学活性成正相关，加入细胞裂解液和荧光素酶底物后，测定其发光强度，，得到标准品溶液生物学活性对其化学发光强度的剂量反应曲线，以此测定Ⅰ型干扰素生物学活性。
试剂（1）完全培养液MEM培养液，含有2mM的L-谷氨酰胺，1mM的丙酮酸钠，0.01mg/L的非必需氨基酸，2μg/ml的嘌呤霉素，100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素，10%的胎牛血清。
4℃保存。
（2）测定培养液除不含嘌呤霉素外，其它成分与完全培养液相同。
4℃保存。
（3）PBS 取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释至1000ml，经121℃、15分钟灭菌。
（4）消化液称取乙二胺四乙酸二钠0.2g、胰酶2.5g，用PBS溶解并稀释至1000ml，除菌过滤。
4℃保存。
（5）荧光素酶报告基因检测试剂盒包括细胞裂解液、荧光素酶底物等。
标准品溶液的制备取重组人干扰素生物学活性测定国家标准品，按说明书复溶后，用测定培养液稀释至每1ml约含10000IU。
在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。
在无菌条件下操作。
供试品溶液的制备将供试品按标示量溶解后，用测定培养液稀释成每1ml约含10000IU。
在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做2孔。
在无菌条件下操作。
测定法使HEK293puroISRE-Luc细胞在完全培养液中贴壁生长。
按1∶4传代，每周2～3次，于完全培养液中生长。
取培养的细胞弃去培养液，用PBS洗1次后消化和收集细胞，用测定培养液配制成每1ml含3.5×105～4.5×105个细胞的细胞悬液。
将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入可用于细胞培养和化学发光酶标仪测定的96孔细胞培养板中，每孔加入100μl，然后将上述细胞悬液接种于同一96孔细胞培养板中，每孔100μl。
于37℃、5%二氧化碳条件下培养18～24小时。
小心吸净96孔细胞培养板中的上清液，按荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书加入细胞裂解液和荧光素酶底物，用化学发光酶标仪进行测定发光强度，记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。
并按下式计算试验结果：
D s×
E s
供试品生物学活性（IU/ml）=P r×------------
D r×
E r
式中P r为标准品生物学活性，IU/ml；
D s为供试品预稀释倍数；
D r为标准品预稀释倍数；
E s为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
E r为标准品半效稀释倍数。