实验四 动物细胞的传代培养
动物细胞传代培养
动物细胞传代培养一、【实验目的】1、掌握消化法细胞传代培养的原理2、了解细胞传代培养所需专用设备、试剂3、学习细胞传代培养操作二、【实验原理】动物细胞原代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，会进一步扩展汇合，覆盖整个培养瓶底，细胞会因生存空间不足或密度过大，发生接触抑制，并引起营养物质枯竭和代谢产物积累，发生细胞中毒，影响正常生长。
这时需要进行分离培养，细胞由原培养瓶按1：2或1：3稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代。
80%汇合或刚汇合细胞是理想的传代阶段。
消化法细胞传代培养，是用一定含量的胰蛋白酶来进行消化，使贴壁的单层细胞脱离下来，形成分散的细胞悬液，然后用新鲜的培养液进行稀释、分装和培养。
三、【实验仪器及试剂】仪器：改良吸管、加样器、培养瓶（玻璃、塑料）、抽滤装置、超纯水器、倒置显微镜、二氧化碳培养箱试剂：PE液、0.25%胰蛋白酶液、MEM+10%小牛血清液其中，二氧化碳培养箱用于开放或半开放培养，使细胞代谢产生的CO2及时溢出至培养箱中，再通过稳定调节箱中5%的CO2，与培养基中的NaHCO3处于动态平衡状态，使PH保持稳定。
四、【实验内容及步骤】（1）内容成纤维细胞传代培养6天，细胞汇合长满培养瓶底，刚传代好的细胞，圆球型亮圈，呈流动状态，传代培养1天，细胞贴壁，数量还不太多，上皮细胞培养至细胞汇合长满培养瓶底。
1、用酒精棉球擦拭培养用液瓶盖，打开瓶盖在酒精灯火焰上一过，盖上瓶盖，但不必拧紧2、将培养瓶内的旧培养液倒入烧杯中（注意瓶盖在酒精灯火焰附近），旧培养液倒掉后，镜下观察细胞十分干净、清晰3、从布袋中取出已消毒的吸管，插入加样器，注意吸管的刻度面向上，加样器的柄面偏左侧，以便于操作时观察。
4、将吸管过火焰（竖向横向各过一到两次），吸取PE液5ml从侧面加入瓶内，平放轻摇40下，放置2~5分钟将PE液倒出PE液的作用：络合、吸收、去除维持组织完整性的钙、镁离子，促进细胞分离，钙、镁离子有抑制胰酶的消化作用，因此用PE液去除，将残余未倒尽的血清除尽，因为血清也会抑制胰酶的消化作用；洗去未倒尽的死细胞。
动物细胞培养实验报告
动物细胞培养实验报告第一篇：一、实验目的1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。
2、学习并掌握细胞传代培养的方法。
3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。
二、实验原理细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。
动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。
动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。
传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。
被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。
三、细胞培养相关设施及材料1、细胞培养室无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。
孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。
制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。
储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。
清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。
2、细胞培养常用基本设施：荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。
动物细胞传代培养试验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除篇一：细胞传代培养实验报告细胞传代培养一.实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的应用打下基础。
二、原理从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。
细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。
细胞培养可分为原代培养和传代（继代）培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。
所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。
三、材料和试剂1、细胞:293细胞株2、试剂：0.25%胰酶、1640培养基（含10%小牛血清）3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml玻璃吸管、酒精灯等四、操作步骤1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。
2、加入1〜2m10.25%胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。
3、马上吸走胰酶液，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入培养箱中消化几分钟4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代5.根据确定的比例来取需要的量(剩余的细胞拿来做细胞计数)，加入4ml左右的培养液6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱7.收拾整理超净台附：消化液配制方法：称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100m110xpbs+纯水溶解到1L,滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。
传代细胞培养实验报告单
实验名称：传代细胞培养实验实验日期：2023年4月10日实验者：张三一、实验目的1. 掌握哺乳动物细胞原代培养与传代培养的基本操作过程。
2. 熟悉细胞传代过程中所需的无菌操作技术。
3. 了解细胞传代对细胞生物学研究的重要性。
二、实验原理细胞培养是一种在人工条件下模拟体内生理环境，使细胞生长、繁殖或传代的技术。
细胞培养技术可以让我们直接观察活细胞，避免体内实验的复杂因素，为生物学研究提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象。
细胞培养分为原代培养和传代培养。
原代培养是指从生物体中取出组织或细胞进行首次培养，而传代培养则是在原代培养基础上，将细胞从一个容器转移到另一个容器中扩大培养。
传代培养的累积次数即为细胞的代数。
三、实验材料1. 培养基：DMEM培养基（含10%胎牛血清、1%青链霉素双抗）2. 细胞：小鼠成纤维细胞3. 工具：超净台、移液器、吸管、培养皿、离心机、显微镜、无菌操作箱、消毒剂等四、实验步骤1. 培养基配制：按照说明书配制DMEM培养基，加入胎牛血清和青链霉素双抗。
2. 细胞复苏：将冻存细胞从-80℃冰箱取出，放入37℃水浴中解冻，轻轻摇匀后移入离心管，1000 rpm离心5分钟，弃上清，加入适量DMEM培养基重悬细胞。
3. 细胞接种：将重悬细胞接种于培养皿中，放入培养箱中培养，保持细胞密度在80%-90%。
4. 细胞传代：当细胞密度达到80%-90%时，进行细胞传代。
具体操作如下：a. 吸除旧培养基，用PBS缓冲液清洗细胞2-3次。
b. 加入适量胰蛋白酶，37℃水浴消化细胞，显微镜下观察细胞变圆、收缩，待大部分细胞脱离培养皿底面时，立即终止消化。
c. 加入适量DMEM培养基终止消化，用吸管轻轻吹打细胞，使其分散均匀。
d. 将细胞接种于新的培养皿中，放入培养箱中继续培养。
5. 细胞观察：在显微镜下观察细胞生长状态，记录细胞形态、生长速度等指标。
五、实验结果1. 细胞在培养皿中生长良好，细胞形态正常，呈梭形。
动物细胞传代培养分析
动物细胞传代培养分析动物细胞的传代培养是用来研究和繁育动物细胞的技术，对于生物科学和医学研究具有重要意义。
传代培养可以使动物细胞在无限期内继续增殖，为各种研究提供了充足的细胞资源。
本文将介绍动物细胞传代培养的原理、方法和应用。
一、传代培养的原理动物细胞的传代培养是通过将初始细胞（初代细胞）在一定培养条件下生长和分裂，定期收获一部分细胞进行继代，从而使细胞持续增殖。
动物细胞的传代培养基于以下原理：1.细胞增殖：传代培养的基本原理是细胞自身的生长和分裂能力。
在适当的生长条件下，细胞会进入细胞周期，经过细胞分裂产生新的细胞。
2.分离和分散：细胞传代过程中需要经常将细胞进行分离和分散，避免细胞过度密集或形成细胞聚集。
细胞分散是为了保证细胞的生长和增殖。
3.培养基的调配：细胞传代需要提供适宜的培养基满足细胞增殖的需求。
培养基的配方要包含必需的营养物质、生长因子和维生素等。
二、传代培养的方法传代培养主要有以下几个步骤：1.准备培养基：根据需要的传代次数，准备足够的培养基。
培养基的配方可以根据具体的细胞类型和研究需要进行调整。
2.细胞解离：将细胞从培养皿或瓶子中收集，用细胞解离液将细胞分散为单细胞悬浮状态。
细胞解离的方法主要有酶消化法和机械分散法。
3.计数和接种：用细胞计数仪进行细胞数目计数，然后计算出相应的接种细胞数目。
将细胞接种到新的培养皿或瓶子中，使其适当分散。
4.培养和观察：将接种好的细胞置于恒温培养箱中，提供适宜的培养条件（温度、湿度、CO2浓度等）。
定期观察细胞的生长状态和形态特征。
5.细胞收获：根据细胞传代的周期和细胞增殖速率，定期收获适量的细胞用于下一次传代或其他实验。
三、传代培养的应用1.基因表达研究：传代培养可以用来研究细胞的基因表达和细胞信号通路。
通过诱导细胞分化、抗体染色和PCR等方法，可以分析细胞的转录水平和蛋白质表达。
2.细胞毒性和药物筛选：传代培养可以用于药物毒性评价和新药筛选。
动物细胞培养及传代
一些特殊的促细胞附着的物质可能参加细胞的贴附过程。 （存在于细胞膜表面或培养液尤其血清中的蛋白质）
贴附过程：带阳电荷的促贴附因子先吸附于介质上，悬
浮的圆形细胞再与已吸附有促贴附因子的介质附着，以后 细胞将伸展成其原来的形态．
运动的接触抑制及生长的密度抑制 接触抑制:
当两个正常的细胞移动而互相靠近时，其中之一或两 个将停止移动并向另一个方向离开，使细胞不会重叠。 当一个细胞被其他细胞围绕致无处可去而发生接触时, 细胞不再移动,此即接触抑制。 正常细胞不互相重叠于其上面生长,但肿瘤细胞可重叠 生长。
5、还原剂 某些还原剂在细胞培养中有特殊作用。β－巯基乙醇 在杂交瘤细胞培养中能刺激抗体分泌，并促进胱氨酸 利用。
DMEM培养基配方(1L)
DMEM粉末 碳酸氢钠 谷氨酰胺 丙酮酸钠 青霉素 链霉素 HEPES
13.48g 3.7g 0.584g 0.11g 105U/L 105U/L 5.96g
核移植 细胞融合 细胞培养
胚胎移植
动物细胞培养技术之成就与贡献
生物制品
细胞生理\ 药理\病理 研究
有毒物质
检测
• 病毒疫苗 • 干扰素 •单克隆抗 体
•筛选抗癌 药物
动物细胞培养
动物细胞培养
教学目标
理解动物细胞的特点； 掌握动物细胞培养的定义； 理解动物细胞的体外培养生长特性； 掌握动物细胞培养过程、条件及 了解动物细胞的特点掌握动物细胞培养 的定义 基本技术。
（7）促生长因子等物质
通常情况下,血清可以提供这些生长因子.
血清 常用的血清是小牛血清CS、胎牛血清FBS、 马血清HS和人血清HS。最常用的是小牛血清, 胎牛血清次之。 血清是极其复杂的混合物
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法1. 引言嘿，大家好！今天咱们聊聊动物细胞的培养，听起来可能有点高大上，但其实就像种花一样，只是“花”是细胞，养护的方法也有讲究。
说白了，细胞也有自己的“家”，咱们得给它们创造个舒适的环境，让它们在里面嗨起来！接下来，我就带你走进这个充满神奇和乐趣的细胞世界。
2. 原代培养2.1 什么是原代培养？原代培养，简单来说，就是从活体动物身上直接提取细胞，然后把它们放在培养皿里，就像把新鲜的花插进水里一样。
你知道吗，这些细胞就像刚从大自然里来的小家伙，特别活泼，适应能力强。
不过，这可不是随便就能搞定的，得有点技术活。
2.2 原代培养的方法首先，咱得准备好一切工具，这可是基础中的基础，不能马虎。
咱们要用到无菌技术，确保培养环境干净得像新洗的碗，不然细胞们就会遭殃。
提取细胞时，通常会用胰酶把它们从组织中“松开”，就像剥开一个大榴莲，里边的果肉才好吃嘛。
然后，把这些细胞放到培养基里。
培养基就像细胞的“快餐”，里面有细胞需要的各种营养物质和生长因子。
要记得，细胞也要“吃好”，才能长得壮壮的，不然就不成气候了。
培养的环境也不能小看，温度、pH值、二氧化碳浓度都得保持稳定。
咱们得把细胞放在适合的温度下，就像给它们开个温暖的“家庭聚会”。
如果环境不合适，细胞就会抗议，甚至罢工！3. 传代培养3.1 什么是传代培养？说到传代培养，那就是把原代培养中的细胞继续繁殖，让它们“生儿育女”。
这就像一个大家庭，越来越壮大，热闹得不得了。
传代培养可以让我们获得更多细胞，方便后续的实验和研究。
3.2 传代培养的方法传代培养的关键在于及时分离细胞，咱不能让细胞们挤在一起，这样容易“打架”。
通常，当细胞长满培养皿后，就需要把它们分离开。
这个过程又得用到胰酶，跟原代培养一样，轻轻松松把它们从皿里“请”出来。
接下来，咱们需要把细胞分到新的培养皿里，再给它们加上新鲜的培养基，确保它们能继续健康成长。
注意，细胞们需要一点时间适应新环境，就像搬家后要习惯新居的味道一样。
动物细胞培养传代培养
实验三：动物细胞培养细胞传代培养【实验目的】熟练掌握细胞的传代培养法。
【实验原理】传代培养是组织培养常规保种方法之一。
也是几乎所有细胞生物学实验的基础。
当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。
这一过程就叫传代。
传代培养可获得大量细胞供实验所需。
传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。
【材料用品】材料：培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞。
药品：培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清或胎牛血清，0.25％胰蛋白酶，Hanks 液。
仪器：C02培养箱，倒置：显微镜，超净台。
【实验步骤】1．人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。
2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。
将培养用液置37℃下预热。
3．超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭溶液擦净。
4．打开超净台的紫外灯照射台面20 min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。
5．点燃酒精灯；取出无菌试管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮头；过酒精灯火焰略烧后插在无菌试管内。
6．将培养用液瓶口用75％酒精消毒，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。
7．倒掉培养细胞的旧培养基。
酌情可用2—3 mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。
18．每个大培养瓶加入1 mL胰酶，小瓶用量酌减，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。
注意勿使细胞提早脱落入消化液中。
9．加入少量的含血清的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(7～10 mL／大瓶，3～5 mL／小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。
盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。
10．对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。
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实验四动物细胞的传代培养1. 实验目的（1）了解动物细胞培养的基本知识。
（2）了解体外培养细胞的的基本形态类型；学会通过镜检判定体外细胞生长的状态。
（3）掌握动物细胞的传代培养法。
2.实验背景与原理2.1 动物细胞培养的基本概念（1）组织培养：把来自机体内的细胞、组织或器官放在类似于体内的外环境中，使之成活、生长和繁殖。
严格又分为细胞培养、组织培养和器官培养。
值得注意的是和植物组织培养不同，目前动物组织培养在一般培养条件下难以维持组织的结构和功能，常最终转变成为细胞培养，所以动物细胞与组织培养并无严格区别。
（2）原代培养：直接从供体取来的细胞，组织或器官进行的初次培养。
通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
（3）传代培养：原代培养物长成单层细胞，达到一定密度时，营养消耗殆尽，需要补充营养，分开扩大培养，使之继续增殖。
注意的是传代的这个“代”与细胞分裂的一个世代不同，一代细胞约分裂3~5次，不要混淆。
（4）细胞系：原代培养后的细胞经传代即可成为细胞系。
若其形态均一，生长增殖稳定，生物性状明确，即可称之为已鉴定的细胞（Certified Cells）。
不同种类的细胞成系的难易程度也不同，一般胚胎、更新组织的细胞如造血、上皮等以及癌细胞较容易成系，而神经等细胞则较难成系。
按照其生存期可分为有限细胞系（生存期有限的正常二倍体细胞）和无限细胞系（生存期无限的癌细胞、转化细胞等，大多异倍体）2.2 动物细胞培养的基本条件体外培养细胞的条件总原则就是要尽可能模拟细胞在体内生长的环境，因此必要的营养、适宜的胞外环境以及严格的无菌条件是主要的三个方面。
（1）营养：早期培养主要采用天然的生物性液体，但其成分不确定，难以控制营养成分。
现广泛使用的是化学成分明确的各种商品化的合成培养基，其主要成分包括各种氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等必要的营养物质。
培养基中还含有酚红指示剂，使培养基的颜色可显示细胞生长状态。
随着细胞数目的增长，酸性代谢物增多，培养基变黄。
污染的培养物也会使培养基迅速变黄。
培养基在使用前还要加血清，它的主要作用有三点：一是提供生长因子、激素、酶等营养；二是中和有毒物质，对细胞起着保护作用，尤其可中和培养中使用的胰蛋白酶的毒性。
第三是提供黏附和伸展因子，是贴壁细胞附壁生长所必不可少的。
所以，血清的品质对细胞的生长有很大影响，通常换用新的批次的血清要预先进行血清的筛选实验。
一般进口的胎牛血清更有利于细胞的生长，但价格较昂贵，可根据培养细胞的要求选用。
另外，有些细胞培养中还需要添加谷氨酰胺（Gln）。
（2）胞外环境条件：主要是温度、气体和pH条件。
这些胞外环境条件应该符合细胞在体内的生长环境。
哺乳动物适宜的培养温度是37℃，鸟类是39℃，爬行类是22~25℃等；大多动物细胞适宜的pH条件都是7.2~7.4，以不超过pH6.8~7.6为宜。
在动物细胞培养过程中随着代谢产物的积累，酸性产物增多，培养基的pH会下降。
因此实验室通常使用CO2气体体积占5%的空气作为细胞培养的气体条件，以使CO2溶解在溶液中形成NaHCO3和H2CO3的缓冲体系，维持pH的稳定。
另外，培养基中加入HEPES（羟乙基哌嗪乙烷磺酸）可更有效的维持体系的pH。
（3）无菌：组织培养成功的关键因素之一就是要避免污染，要树立无菌操作观念，从实验用品、培养基和试剂、操作环境的灭菌消毒到超净台下的实验操作，每一步都应该严谨规范。
2.3培养细胞的形态(1) 倒臵显微镜：培养细胞用倒臵显微镜观察。
倒臵显微镜（inverted microscope）组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统在载物台之下。
倒臵显微镜优点为物镜与目镜之间工作距离较长，可直接将培养皿，培养瓶等臵显微镜操作台上进行观察或显微注射等工作，这样物镜可以很接近样品而不会受样品厚度的限制。
通常具有相差物镜。
(2) 培养细胞的形态特点：体外培养细胞绝大多数都是贴壁生长的。
在培养中大部分细胞都经历由最初脱离机体或瓶壁的立体球形到最终的具有突起的延展细胞所形成平面单层的形态变化过程。
细胞分裂增殖时同样也经历此变化过程，才能附壁继续生长。
培养细胞的形态变化示意图健康的体外培养细胞的标准是细胞折光性好，透明；胞质中颗粒少；细胞形态完整，饱满；伸展性好。
当细胞刚刚污染时，会发现细胞形态不饱满，细胞反差变大，胞质中颗粒变多，细胞延展性差。
随着污染的加重，贴壁细胞脱落，培养基中杂质多，培养液很快变黄，且混浊。
当细胞因未及时传代而缺乏营养时，细胞也会“变瘦”，变圆脱落增多，培养液变黄。
(3) 体外培养细胞的形态类型: 细胞在体外培养时由于培养条件比较单一稳定，缺乏体内的生理调节和动态平衡，细胞常失去原有组织细胞的形态特点，趋于单一性，出现“返祖”现象。
根据它们是否贴附于支持物生长的特征，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类。
而贴壁生长又主要分为成纤维样，上皮样，多形样等。
成纤维样细胞形态与体内成纤维细胞的形态相似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长。
除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞也呈本类形态生长。
上皮样细胞具有扁平不规则多角形特征，细胞紧密相连单层膜样生长。
起源于内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组织细胞培养时，皆呈上皮型形态生长。
悬浮样细胞主要是血液或淋巴液中的悬浮生长的细胞类型。
2.4 细胞传代培养的一般方法以单层细胞方式生长的细胞分泌细胞外基质和黏蛋白以附着于生长表面。
不但不同的细胞系附着于表面的黏附程度有差异，不同状态的细胞这种黏附也有差异。
比如衰老的二倍体细胞通常比年轻的二倍体细胞黏附得更牢固。
绝大多数的贴壁细胞需要用胰蛋白酶优先催化碱性氨基酸与邻近氨基酸羧基间的肽键水解，从而分解粘蛋白、糖蛋白，使细胞脱壁；有些细胞系贴壁不强，只要用吸管吹打即可使细胞脱落分散，而不需要使用胰蛋白酶；还有些细胞贴壁能力很强需要使用其他的蛋白酶，比如弹性蛋白酶、链霉素的酶等。
为保障胰蛋白酶的最佳活性，在进行胰蛋白酶处理前应去除血清、Ca2+及Mg2+离子。
值得注意的是过度的胰蛋白酶处理可导致细胞的裂解和活力的丧失。
悬浮生长细胞的传代一般只需简单的稀释操作即可。
若需完全更换培养液只需要离心收集细胞后传代即可。
3. 实验材料与试剂（1）材料：MCF-7细胞。
培养箱，超净工作台，高压灭菌锅，过滤（2）设备与用品：倒臵显微镜，CO2器及0.22μm的水相滤膜，细胞培养瓶，移液管，吸管，小试管，酒精灯，试管架等。
（3）药品与试剂：RPMI-1640培养基；小牛血清；0.25%胰蛋白酶（w/v, PBS 缓冲液或D-Hanks缓冲液配制，pH7.4）。
强酸洗液的配制：先用约200mL蒸馏水充分加热溶解重铬酸钾63克，再缓缓加入1L浓硫酸并不断搅拌，充分混合溶解。
洗液腐蚀性较强，操作时注意做好各方面的防护，并且动作要轻柔，注意安全。
当洗液的颜色由棕红色变为绿色时表明已经失效，需重新配制。
4. 实验方法与步骤实验内容：体外培养细胞的观察及细胞的传代培养。
（1）培养基等的配制及实验用品的清洗与消毒配制RPMI-1640培养基及0.25%胰蛋白酶（w/v, PBS缓冲液配制pH7.4）溶液，并过滤除菌后培养验菌。
清洗，包装并高压灭菌细胞培养的玻璃用品等。
细胞培养的玻璃器皿等进行初步清洗后要用强酸洗液浸泡过夜，然后用蒸馏水彻底冲洗干净；进行湿热灭菌时一般需至少灭菌40分钟；培养过污染细胞的培养瓶则最好加上用煤酚皂溶液浸泡过夜的步骤；移液管和吸管在包装前要在其管口用细丝或镊子塞上少许棉花，长约1~1.5cm，松紧要适宜。
（2）动物培养细胞的形态观察倒臵显微镜下观察培养细胞的长势及密度，根据细胞密度决定传代的稀释倍数。
同时可对比观察教师事先准备的污染细胞、死亡细胞，并对培养细胞的密度有一定感性的认识。
（3）消化：倒掉旧培养基，加几滴胰酶润洗一下，立即倒掉，再加适量胰酶消化1~2分钟左右，可镜下观察待细胞胞质回缩，细胞间空隙变大时立即停止消化。
（4）悬浮细胞：沿着培养瓶无细胞的一面倒掉胰酶，加适量培养基，用吸管充分吹打后，镜下观察是否还有贴壁细胞。
（5）分装：一般以1：2或1：3进行分装，即一瓶细胞可传为2~3瓶。
向分装好的各瓶细胞中再加入适量的含10%（v/v）血清的RMBI-1640培养液。
（6）拧上盖子（勿拧紧），做好标记，将培养瓶平放于培养箱中，于37℃，5%CO2下培养。
5. 实验注意事项（1）要保证实验中的无菌操作，就必须特别注意一些操作上的细节，比如：培养液等不要过早开瓶；加液时取液用的移液管、吸管勿碰用过的培养瓶瓶口；要勤过火焰，尤其是瓶口；手要握在移液器刻度之上的位臵；超净台中物品的摆放要合理，尽量避免双手交叉取物；若有动作失误，勿存侥幸心理，应及时更换移液管等。
（2）对于贴壁细胞的传代培养胰酶的消化步骤是关键，要注意胰酶消化的时间也不能过长，否则不但造成细胞数目的损失，也会对细胞造成损伤，使细胞不易贴壁生长。
（3）可根据细胞的密度，生长速度及实验周期的要求等适当调整细胞的接种密度。
但细胞若接种密度过低，也会造成细胞生长极为缓慢甚至停止生长。
6. 思考题（1）将传代整个操作过程连贯思考一遍，总结要想保证传代培养的成功，需要注意哪些环节和细节？（2）若细胞消化不足或过消化时应该如何操作才能尽可能保证细胞的数目？（3）若发现细胞有污染时，为了以后的培养实验，应该做哪些工作？预习问题细胞的原代培养都有哪些方法？。