实验五 动物细胞的原代培养
细胞的原代培养实验报告
细胞的原代培养实验报告一、实验目的细胞原代培养是指从机体取出细胞、组织或器官后，通过机械或酶学方法分散成单个细胞，在体外进行培养的过程。
本次实验的目的是掌握细胞原代培养的基本技术和方法，观察细胞在体外的生长和形态变化，为进一步的细胞生物学研究奠定基础。
二、实验原理细胞原代培养的关键在于保持细胞的活性和完整性，同时提供适宜的生长环境。
通常采用酶消化法或组织块培养法来获取单细胞或细胞团。
在培养过程中，细胞需要充足的营养物质、适宜的温度、pH 值和气体环境，以促进细胞的生长和分裂。
三、实验材料1、实验动物：新生小鼠2、试剂和培养基：DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、EDTA、青霉素链霉素溶液、PBS 缓冲液等3、实验器材：超净工作台、CO₂培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器、培养瓶、培养皿、手术器械等四、实验步骤1、取材处死新生小鼠，用 75%酒精消毒其腹部皮肤。
用手术剪剪开腹部皮肤和肌肉，取出肝脏组织，置于预冷的 PBS缓冲液中。
2、组织处理将肝脏组织转移至培养皿中，用 PBS 缓冲液冲洗 2-3 次，去除血液和杂质。
用眼科剪将组织剪成 1-2mm³的小块。
3、酶消化将组织小块转移至离心管中，加入适量的胰蛋白酶EDTA 溶液，置于 37℃水浴中消化 15-20 分钟，期间每隔 5 分钟轻轻振荡一次。
消化结束后，加入等量的含血清的培养基终止消化，用移液器轻轻吹打制成细胞悬液。
4、细胞过滤将细胞悬液通过 200 目滤网过滤，去除未消化的组织块和细胞团。
5、细胞计数和接种吸取少量细胞悬液，加入台盼蓝染液，在显微镜下计数活细胞数。
根据细胞计数结果，将细胞以适当的密度接种于培养瓶或培养皿中，置于 CO₂培养箱中培养。
6、培养和观察培养 24 小时后，在倒置显微镜下观察细胞的贴壁情况。
每隔 2-3 天更换一次培养基，观察细胞的生长和形态变化。
五、实验结果1、细胞贴壁情况培养 24 小时后，大部分细胞已贴壁，呈圆形或多边形，贴壁细胞周围有光晕。
动物细胞的原代培养
动物细胞的原代培养细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。
其特点包括：大量实验材料；单一、纯粹细胞类型培养基的成分可控，即生长条件可控/全合成、无血清培养基；易于观察；易于操作。
细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术。
一、实验目的了解动物原代细胞培养的基本方法及操作过程；初步掌握无菌操作方法；观察体外培养细胞的生长特征。
二、实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。
直接从身故体内分离的细胞，在体外培养的过程中尚未发生细胞分裂、增殖的细胞即为原代培养细胞；原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖，在数量上大量扩增，此时的细胞为继代培养细胞。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
三、实验用品1.器材①解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、移液管、橡皮头、培养瓶、玻璃匀浆器、1.5ml离心管等。
上述器材均需彻底清洗、烤干、包装好，高压灭菌20min，备用。
②倒置显微镜、离心机、酒精灯、酒精棉球、试管架、记号笔、大头针、解剖板等2.试剂完全培养液不完全培养液90%小牛血清10％双抗（链霉素、青霉素）（1万单位/mL）加至约为100单位/mL7.4%NaHCO3调pH至7.0-7.2。
动物细胞原代培养
动物细胞原代培养一、【实验目的】1、学习并掌握动物细胞原代培养前各种器具的消毒方法2、学习并掌握动物细胞的机械切割和组织块原代培养方法二、【实验原理】1、原代培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。
原代培养的细胞具有很多特点，其最大的优点是组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传性状，最接近和反映供体体内生长特性，因此原代培养细胞是研究基因表达的理想系统，也很适合做药物测试、细胞分化、疫苗制备等实验研究。
2、原代培养是建立各种细胞系的第一步，因此细胞原代培养技术是从事组织培养工作者应熟悉和掌握的最基本的技术。
3、原代培养最基本的方法，依据切割方式不同，可分为蛋白酶消化法和组织块直接培养法两种。
4、组织块直接培养法是指在无菌条件下，从有机体取下组织，用平衡盐溶液漂洗数次后剪碎，加培养液进行培养的方法。
是常用的、简便易行和成功率较高的方法。
5、依据组织块贴壁方式不同，又可分为薄层培养法和翻转干涸法两种。
本实验采用翻转干涸法。
6、酶消化法是指将组织剪成小块，然后用蛋白酶消化成单细胞悬液后，再接种培养的方法。
7、由于蛋白酶比较贵，以及组织块消化成单细胞的条件要求远较组织块法复杂，因此，采用组织块直接培养法的较多。
三、【实验仪器、试剂及材料】仪器：培养瓶（3个/人）、培养皿（1套/2人）、剪子和镊子（1套/人）、青霉素小瓶（1个/人）、滴管（1-2个/人）、移液管若干、冻存管(2个/人)等：试剂：PBS、MEM（含100IU/ml 青霉素和100ug/ml链霉素）等材料：泥鳅四、【实验步骤及内容】材料的预处理鱼类消毒1.将所需的一定量水（或海水）进行煮沸消毒处理。
2.冷却后，加入青霉素至终浓度1000单位/ml水（或海水），加入链霉素至终浓度1000单位/ml水（或海水）。
3.将实验用鱼放入经处理的消毒水（或海水）中浸泡24小时。
4.用纱布包裹将鱼取出，将其击昏。
实验五动物细胞的原代培养
实验五动物细胞的原代培养实验五动物细胞的原代培养一、实验目的1．了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。
2．学习细胞消化、营养液的配制及酸碱度的调节。
3．初步掌握无菌操作方法。
二、实验原理细胞培养（cell culture）是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、分化以及衰老等过程。
细胞培养的突出优点是：便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；便于人们对细胞内结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育等过程的观察。
因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，同时也不可忽略另一个困素，那就是它脱离了生物机体后的一些变化。
细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等。
为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的内基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞（primary culture cell）与传代细胞（subculture cell）有一个基本的了解。
原代细胞培养又称原代培养（primary culture），是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，在体外培养，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节；二是严格控制无菌条件。
三、实验仪器、材料和试剂1．器材：解剖剪、解剖镊、眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、纱布块（或不锈钢网）、玻璃斗、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶（小方瓶或中方瓶）等。
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法1. 引言嘿，大家好！今天咱们聊聊动物细胞的培养，听起来可能有点高大上，但其实就像种花一样，只是“花”是细胞，养护的方法也有讲究。
说白了，细胞也有自己的“家”，咱们得给它们创造个舒适的环境，让它们在里面嗨起来！接下来，我就带你走进这个充满神奇和乐趣的细胞世界。
2. 原代培养2.1 什么是原代培养？原代培养，简单来说，就是从活体动物身上直接提取细胞，然后把它们放在培养皿里，就像把新鲜的花插进水里一样。
你知道吗，这些细胞就像刚从大自然里来的小家伙，特别活泼，适应能力强。
不过，这可不是随便就能搞定的，得有点技术活。
2.2 原代培养的方法首先，咱得准备好一切工具，这可是基础中的基础，不能马虎。
咱们要用到无菌技术，确保培养环境干净得像新洗的碗，不然细胞们就会遭殃。
提取细胞时，通常会用胰酶把它们从组织中“松开”，就像剥开一个大榴莲，里边的果肉才好吃嘛。
然后，把这些细胞放到培养基里。
培养基就像细胞的“快餐”，里面有细胞需要的各种营养物质和生长因子。
要记得，细胞也要“吃好”，才能长得壮壮的，不然就不成气候了。
培养的环境也不能小看，温度、pH值、二氧化碳浓度都得保持稳定。
咱们得把细胞放在适合的温度下，就像给它们开个温暖的“家庭聚会”。
如果环境不合适，细胞就会抗议，甚至罢工！3. 传代培养3.1 什么是传代培养？说到传代培养，那就是把原代培养中的细胞继续繁殖，让它们“生儿育女”。
这就像一个大家庭，越来越壮大，热闹得不得了。
传代培养可以让我们获得更多细胞，方便后续的实验和研究。
3.2 传代培养的方法传代培养的关键在于及时分离细胞，咱不能让细胞们挤在一起，这样容易“打架”。
通常，当细胞长满培养皿后，就需要把它们分离开。
这个过程又得用到胰酶，跟原代培养一样，轻轻松松把它们从皿里“请”出来。
接下来，咱们需要把细胞分到新的培养皿里，再给它们加上新鲜的培养基，确保它们能继续健康成长。
注意，细胞们需要一点时间适应新环境，就像搬家后要习惯新居的味道一样。
动物细胞的原代及传代培养
动物细胞的原代及传代培养一、试验目的1、了解动物细胞原代培养的原理及基本方法，掌握组织块法及消化培养法的操作过程，掌握无菌操作的技术要领；2、了解传代培养方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长情况。
二、实验原理动物细胞的原代培养是指把直接从动物获得的细胞、组织或器官在体外培养直至第一次传代为止。
要求在严格无菌的条件下对动物进行切割成组织块或经消化液使组织细胞游离为单个细胞，然后在人工配制的营养液内使其不断地生长和繁殖。
传代培养是指将细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移、接种到另一培养瓶的培养过程。
三、实验材料和试剂鸡胚，HeLa细胞实验器材：无菌工作台，细胞培养箱，离心机，无菌解剖器材，培养皿，培养瓶，滴管等。
实验试剂：平衡盐液，细胞消化液，培养液四、实验步骤（一）动物细胞的原代培养1、取材①将鸡蛋用酒精消毒，用剪刀敲破鸡蛋的圆端，剥壳去膜，倒掉壳内的液体；②拉出鸡胚，剪去头后置于装有Hank液的培养皿内，用Hank液清洗；③然后用镊子小心拔掉鸡胚的毛，将拔完毛的鸡胚。
2、组织块培养法①剪取背部及大腿部的皮肤肌肉组织十余块于培养皿中，用剪刀剪成1mm3大小的组织块；②用弯头吸管吸取组织块送入培养瓶底部，均匀排列；③翻转培养瓶后吸取3管培养液，滴入到培养瓶内（注意：吸管不能碰到瓶口）；④标记在培养瓶写上“原代”，写上姓名和学号。
3、消化培养法①剪取十余块组织块放入干净的培养皿中，吸取3-5管消化液，放入37℃的培养箱中消化10-20min，到组织变成松散、粘稠状，然后加入1管营养液（停止消化）；②取一只干净的细管将组织块打散，放置一段时间，用吸管吸取上清液于离心管中，离心10min；③倒掉上清液，用营养液悬浮沉淀，转入干净的培养瓶中，加入适量的培养液，37℃的培养箱中培养；④标记在培养瓶写上“消化”，写上姓名和学号。
（二）动物细胞的传代培养①取已长成单层HeLa细胞的培养瓶，倒掉培养液，加入3管消化液，37℃条件下消化2-5min，在显微镜下观察细胞单层出现缝隙，倒去消化液，停止消化；②加入3-4管培养液，用弯头吸管反复吹打壁上的细胞层（尽量不形成气泡），添加2-4管培养液；③用吸管吸取一半左右细胞悬液，分装到另一个培养瓶中；④作标记，注明细胞代号、日期和操作者姓名；⑤37℃静置培养，24小时后即可观察。
动物细胞原代培养过程
动物细胞原代培养一、剪取组织颈椎脱臼法处死小鼠，放在100ml的烧杯中用70％乙醇消毒3min。
用剪刀剪开腹部，取出肾、肝、脾（任意一种脏器）。
1、将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1‰ 新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。
2、将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔二、清洗在盛有PBS 液平皿中洗涤数次，剔除包膜、结缔组织，将剔除后脏器放入另一盛有PBS 平皿中。
三、剪切将肾、肝、脾剪成1mm3 （剪成肉末状）大小的组织块，再次清洗，洗去残留的血细胞，以备消化。
四、消化1、在50ml离心筒中加入0. 25％胰蛋白酶溶液25ml，在温暖的环境中或置于37 °水浴摇床中轻轻摇动15min，转速约为180r/min。
2、让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶。
（小牛血清在共用无菌操作台上取用）3、在离心管中残留未消化组织块中再次加入胰蛋白酶进行消化，重复步骤1和2。
五、制备单细胞悬液1、将混合的细胞悬液离心，1200rpm，5min，弃上清。
2、将沉淀用新鲜的无菌PBS重悬，再1000-1200rpm，5min离心。
3、用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止,然后再按照（1）进行离心，离心后弃去上清液，将沉淀用少量细胞培养液反复吹打。
制的细胞悬液。
六、接种1、将细胞悬液接种到细胞培养瓶中。
2、用滤器过滤RPMI1640再悬沉淀，并使终体积为20ml。
（RPMI-1640RPMI是Roswell Park Memorial Institute的缩写，代指洛斯维.帕克纪念研究所。
RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。
其中含有10%胎牛血清。
）七、培养1、在培养瓶外做好标记（标明所培养细胞的名称和时间），2、置于CO2的孵箱中培养，3、72h后即可观察。
动物细胞原代培养实验项目指导
附件-4综合设计性实验项目指导一、实验项目名称：动物细胞原代培养及活力检测二、实验目的：掌握原代细胞培养的一般方法和步骤及培养过程中无菌操作技术，熟悉原代培养细胞的观察方法及细胞活力的测定方法，为细胞工程中的胚胎移植、细胞融合与单克隆抗体制备等技术奠定重要的技术基础。
三、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养。
这种培养过程是把组织或器官从动物体取出，分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断的生长和繁殖。
原代培养是建立各种细胞系的第一步。
利用原代培养技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究。
原代培养科分为组织培养法和消化法两种。
台盼蓝染色法检测细胞活力的原理:台盼蓝是检测死、活细胞最常用的生物染色试剂之一。
健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，由于膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。
四、实验材料：1.新生兔2.大剪子、弯头眼科剪、小镊子、平皿、细胞培养瓶、烧杯、酒精灯、移液枪、超净工作台、细胞计数板、0.22μm细菌过滤器、移液枪、枪尖、PE手套、一次性无菌橡胶手套、脱脂棉、无水乙醇、台盼蓝、15ml离心管3. DMEM培养基、血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶五、实验仪器：二氧化碳培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、离心机、显微镜六、实验步骤（方案）：（如需要学生设计，也要提交一参考方案供论证评审）（一）DMEM培养基的配制1. 将DMEM培养基干粉用800ml超纯水溶解，加入3.7gNaHCO3，搅拌溶解，加入双抗（100IU/ml），调整pH为7.0，定容至1L，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，分装，并用封口膜封口，4℃保存备用。
2. 取一定量的配制好的DMEM培养基，按10%-20%的比例添加新生牛血清。
（二）新生兔细胞原代培养1. 准备（1）取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
（2）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
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实验五动物细胞的原代培养一、实验目的1．了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。
2．学习细胞消化、营养液的配制及酸碱度的调节。
3．初步掌握无菌操作方法。
二、实验原理细胞培养（cell culture）是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、分化以及衰老等过程。
细胞培养的突出优点是：便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；便于人们对细胞内结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育等过程的观察。
因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，同时也不可忽略另一个困素，那就是它脱离了生物机体后的一些变化。
细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等。
为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的内基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞（primary culture cell）与传代细胞（subculture cell）有一个基本的了解。
原代细胞培养又称原代培养（primary culture），是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，在体外培养，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节；二是严格控制无菌条件。
三、实验仪器、材料和试剂1．器材：解剖剪、解剖镊、眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、纱布块（或不锈钢网）、玻璃斗、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶（小方瓶或中方瓶）等。
上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9.9×l04 Pa（15磅）灭菌30 min，备用。
此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板以及包装灭菌的工作服、口罩和帽子等。
2．试剂（详见附录）：①平衡盐液：Hank’s液；②细胞消化液：常用的有0.25 %的胰蛋白酶（活性1∶250）；③ 0.5 %水解乳白蛋白－Hank’s液（简称Hanks 液）；④小牛血清；⑤ 7.4 % NaHCO3；⑥1 000 u/ml青霉素、链霉素液。
以上溶液均经适当包装，灭菌后备用。
3．材料：出生后2～3 d的乳鼠。
四、方法与步骤（一）乳鼠肝细胞原代培养的基本过程1．消化法（以胰蛋白酶液消化为例）（1）手的清洗与消毒操作者首先进行手的清洗与消毒，再将实验用品放在适合的位置，然后配制营养液及调节平衡盐液的pH值。
1）乳鼠肝细胞营养液的配制0.5 % LH液90 %小牛血清10 %1万u/ml青霉素、链霉素加至约100 u/ml7.4 % NaHCO3调pH至6.8～7.02）平衡盐液-Hank’s液的调节用7.4 % NaHCO3调Hank’s的pH至6.8～7.0（2）处死动物取乳鼠，拉颈椎处死，然后用75 %酒精浸泡2～3 s（注意小鼠在酒精中不宜过长，以免酒精从口和肛门中侵入，影响组织生长）。
（3）取肝用碘酒和酒精消毒腹部，用眼科小剪子剪开腹部皮肤后，暴露皮下组织，再次用碘酒和酒精消毒皮下组织，更换剪子和镊子，打开腹腔，即可见到肝脏。
剪1 cm2肝组织，放在无菌的培养皿中。
（4）剪肝用Hank’s液洗涤3次，并剔除脂肪结缔组织、血液等杂物。
将干净的肝组织块移到装有青霉素的小瓶中，用弯头剪把肝组织剪成1 mm3大小的碎块，组织块的大小应尽量均匀一致，再用Hank’s液洗2～3次，直到液体澄清为止。
图18-1 消化法原代培养基本步骤（5）消化及分散组织块将上步清洗过的Hank’s液吸掉，按组织块体积的5～6倍量加入0.25 %的胰蛋白酶液（pH为7.6～7.8）。
置于37℃水浴中进行消化。
消化时间在20～40 min 左右（消化时间的长短与多种因素有关，如胰蛋白酶的活性及浓度，不同动物及年龄、组织块的大小等等）。
每隔10 min摇动一次青霉素瓶，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、粘稠状，并且颜色略变白色为止。
这时可从水浴中取出青毒素瓶，吸去胰蛋白酶液。
此时再用Hank’s液洗涤2～3次。
然后，加入少量Hank’s液，用吸管反复吹打织织块，直到大部分组织块均分散成混淆的细胞悬液为止。
此时，可将分散的细胞悬液经过灭菌的纱布（或不锈钢网）进行过滤，以去除部分较大的组织碎片。
（6）计数与稀释从上步滤过的细胞悬液中吸取1 ml细胞液，进行计数。
将细胞液滴于血细胞计数板上，按自细胞计数法进行计数，计数后用营养液进行稀释，稀释后的浓度一般以每ml含细胞30～50万为宜。
（7）分装与培养将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中（一般5 ml/小方瓶），盖紧瓶塞。
在培养瓶的上面做好标志，注明细胞、组别及日期。
然后轻轻摇动，避免细胞堆积，以便细胞能均匀分布。
最后将培养瓶置于CO2培养箱，37 ℃条件下进行培养。
2．组织块法（1）其他步骤同以上1～3，然后将肝组织移人一新的培养皿中，用吸管吸取0.5 ml培养基置于肝组织上，用另一眼科剪将其剪成1 mm3左右的小块。
（2）用一弯头吸管小心地将剪碎的肝组织块吸人，放置于培养瓶底部。
（3）并用弯头吸管头移动肝组织块，使其在培养瓶底部均匀分布，控制每小块间距在0.5 cm左右，25 ml培养瓶放置15～20块。
（4）吸取少量培养基，沿培养瓶颈缓缓滴入，培养基的量以恰好能浸润组织块底部、但不会使组织块漂浮为佳。
（5）轻轻将培养瓶置于培养箱中培养。
（6）24 h后取出观察，即有少量细胞从组织块周围游离而出，视需要补以少量培养基。
（二）原代培养细胞的观察置于37 ℃培养的细胞，需逐日进行观察。
1．组织块法培养细胞的观察培养24 h后，倒置显微镜下可观察到少量的细胞从组织块边沿游离出来；48 h后，可见大量的细胞放射状排列于组织块周围，这些细胞胞核较大，胞质内含物少、透明度高，彼此间排列紧密。
靠近组织块的细胞胞体较小、较圆，离组织块较远的区域可见有多角形的细胞，体积较大，有些细胞的形态间于圆形与多角形之间。
2．胰蛋白酶消化法培养细胞的观察在倒置显微镜下，可见刚接种于培养瓶中的细胞胞体均成圆形，悬浮于培养液中。
24 h后，大多数细胞已贴附于培养瓶底部，胞体伸展，重新呈现出其肝细胞原有的、不规则多有形上皮性细胞特征。
48 h以后，细胞开始增殖，细胞的数量明显增多，在接种的细胞或细胞团的周围可见有新生的细胞，这些细胞胞体轮廓通常较浅，因内含物少而较为透明。
96 h以后，新生的细胞将逐渐连接成片，胞体轮廓增强，核仁明显可见，透明度减弱。
观察时注意：（1）培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示该瓶被污染。
（2）细胞生长状况与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好，可能是瓶塞未盖紧或营养液pH值过高。
（3）培养液若变为桔红色，一般显示细胞生长良好。
经过1～2 d培养后，若细胞生长情况较差或培养液变红了，则可换一次营养液。
换液时也要注意无菌操作在酒精灯旁倒去原培养瓶中的营养液，再加入等体积新配营养液，pH 7.0。
若经2～3 d后，细胞营养液变黄，此时表示细胞已生长。
如果希望细胞长得更好些，此时也可换液。
换液时，所用的溶液称为维持液，它与营养液的组成完全相同，仅所用血清量为5 %。
以后，每隔3～4 d（视细胞液pH值而定）更换一次维持液。
待细胞已基本长成致密单层时，此时即可进行传代培养。
（三）培养细胞生长期的划分大多数二倍体细胞在培养过程中维持有限的生存期，最多生存一年左右，传30～50代，相当于150～300个细胞周期。
在全生存过程中，大致经历以下三个阶段：1．原代培养期从体内取出组织接种培养到第一次传代的阶段，一般持续1～4 w。
此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。
原代培养细胞与体内原组织相似性大，细胞是异质的（heterogeneous），相互依存性强，细胞克隆形成率很低，与体内细胞性状相似，是药物测试很好的对象。
2．传代期在全生命期中持续时间最长，在培养条件好的情况下，细胞增殖旺盛，并维持二倍体核型。
为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养或传代后早期冻存。
目前世界上常用细胞系均在不出10代内冻存。
如不冻存，则需反复传代，这样有可能失掉二倍体性质。
当传30～50代后，细胞增殖缓慢以至完全停止。
3．衰退期细胞仍生存，但不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡。
在细胞生命期中，少数情况下在以上三期任何一期均可发生细胞自发转化。
转化的标志之一是细胞获得永久性增殖能力，成为连续细胞系（株）。
连续细胞系的形成主要发生在传代期。
转化后的细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（immortality）而无恶性。
所有体外培养细胞包括原代培养和各种细胞系（株），生长达到一定的密度后都需做传代处理。
传代的频率和间隔与接种细胞数量、细胞生物学性质以及营养液性质等有关。
接种细胞多则细胞数饱和速度快；连续细胞系和肿瘤细胞系比原代培养细胞增殖快；培养液中血清含量多时，细胞增殖快。
一般是在细胞长满瓶壁，培养液pH稍降低时做分离培养。
依据细胞特性，将一瓶细胞1∶4或1∶3（即1瓶传4瓶或3瓶）传代。
如NIH3T3成纤维细胞，每3 d传代，接种3×105个/ml。
在细胞长满瓶壁后应尽早传代。
否则细胞会中毒，形态发生改变，重则从壁上脱落死亡。
传代过晚（若已有中毒迹象）能影响下代细胞的机能状态，细胞需要再传一两代把不健康的细胞除去，才能恢复使用。
注意事项：在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。
为此，在操作前要认真地洗手并用75 %乙醇消毒。
操作前20～30 min即将超净台打开吹风。
操作时，严禁说话，严禁用手去拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳，镊子等去拿。
要在超净台内才能打开培养瓶瓶塞，打开之前要用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。
操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。
使用的吸管在从消毒筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再吸取液体。
总之，在整个无菌操作过程中，都应该在酒精灯的周围进行。
五、作业与思考题1．简述细胞原代培养的操作程序及注意事项。
2．细胞培养获得成功的关键要素是什么？。