小鼠心脏离体灌注缺血-再灌注模型

小鼠心脏离体灌注缺血-再灌注模型
（2013/6/20 廖翔）
一．材料
1. 所需液体：K-H液（NaCl 118, NaHCO3 24, CaCl2
2.5, KCl 4.7, KH2PO4 1.2, MgSO4 1.2, Glucose 11, EDTA 0.5 （in mM））、低分子肝素溶液（500IU/ml）、戊巴比妥钠液、碳酸氢钠液、盐酸液。

2. 取鼠：标准C57小鼠（20-25g）。

3. 物品：
∙手术剪、血管钳 1套，用于开腹、开胸
∙眼科剪、眼科镊 1套，用于开胸后取心、剔除心缘纤维组织
∙小圆培养皿 2个，培养皿内加4°K-H液，先后装取出的心
∙1000ml烧杯 2个 +小转子，一个用于配制H-K液，一个装双蒸水，清洗灌注仪器
∙500ml烧杯 1个，用作废液缸。

∙50ml烧杯 1个（用于少量的药物灌注）
∙吸管 2个，分别滴加碳酸氢钠液、盐酸液
∙持针器1把，夹持带针7号线
∙尖镊2把，夹持主动脉
∙大镊子1把，持物
∙1mL注射器 2个，分别用于注射麻药、肝素
∙5mL注射器 1个，用于加CaCl2液
∙50mL注射器1个，用于加K-H液
∙5mL注射器针头自制灌注针 1个（用于挂小鼠心脏，尖端磨平，距针尖2mm出磨出刻痕以便打结固定）
∙6号线（用于固定心脏）、带针7号线（用于结扎LCD）
∙氧气罐（95% O2 +5% CO2）
∙20X20cm泡沫板1个+大头针4枚，用于固定麻醉后的小鼠
∙泡沫盒1个，装冰块
∙橡皮泥，用于固定挂心脏的自制注射器
4. 仪器：手术显微镜、langendorff离体灌注装置（灌注系统、恒温装置、灌注泵）
5. 另外准备手套、口罩、棉签等
注：现在差的物品有：尖镊2把（夹持主动脉）
二．操作方法：
1、打开离体灌注装置，设备自检。

注意灌注压调零；配制K-H液，调pH为7.4左右（7.35-7.43），加入灌注装置恒温至37°，运行灌注泵，排空灌注系统的气泡。

加适量K-H液于小圆培养皿中放于冰块上（4°），打开显微镜，将需要使用的工具摆放到位。

2、小鼠称重后，腹腔注射戊巴比妥钠(65mg/kg)进行麻醉，予以普通肝素(300IU/kg)肝素化，待小鼠麻醉完全后，固定小鼠于泡沫板上。

迅速开腹，迅速开胸，切断主动脉和上下腔静脉，取出心脏，立即放入4°K-H液中（此过程<15s），冲洗掉残留在主动脉内的血液，寻找升主动脉，镊子夹住升主动脉血管壁并固定于自制针头，插入灌注针至主动脉瓣上方，6号丝线结扎后，迅速移至灌注装置上，用K-H液灌注，整个灌注期间用医用氧气进行鼓泡式氧合。

必要时可切开右心耳，使冠
状动脉回流液得以充分引流。

灌注压维持在60-80mmHg左右，冠脉流速维持在1.8-2.5ml/min左右（具体使用恒压模式或是恒流模式可依据具体需要，小鼠灌注一般采用恒压模式）。

3、
3.1（局部缺血）待心脏跳动稳定30min后，用带针7号线于距左心耳下缘2-3mm处进针，平行进针于垂直于肺动脉段中点处出针，垫适量棉球或35/1 mm塑料管后结扎LCD[1]。

结扎时间30min，30min后剪开结扎线，观察心脏再灌状态30min-60min。

3.2（全心停灌）待心脏跳动稳定30min后，关闭灌注泵30min，停灌过程中注意心脏的保温、保湿[2]。

30min后打开灌注泵，观察心脏再灌状态30min-60min。

注：缺血-再灌注期间可根据实验具体需要在左心室放入测压球囊，或在心脏表面接电极测心电图。

三．讨论(注意事项)
1、K-H液的配方报到较多，具体配方应根据实际实验要求而定，特别是配方中的CaCl2的用量争论较大，1.5-2.5 mmol/L都有报道。

一般而言，如研究心律失常Ca离子的浓度可适当高些（2.0-2.5mmol/L），研究心功能有文献报道更提倡用改良K-H配方（CaCl2 1.5-2.0mmol/L）。

2、开胸、取心脏、挂心脏一系列操作应尽快迅速，开胸到心脏浸入4°K-H液中的时间应不超过15s，开胸到心脏挂上灌流装置的时间90s内为佳，不超过2min。

3、稳定的可用于实验的小鼠心脏的纳入标准，一般而言，稳定后小鼠心率应大于350次/分，心律齐，左室压力为80mmHg左右。

实际上，有时候即使取心脏速度稍慢但是稳定后的心脏扔可达到以上标准时我们认为该心脏仍可用于实验。

4、K-H液应现配现用，我们在实验中发现K-H液放置过久可致pH变化，配置过程中试剂应充分溶解以防沉淀形成，其中CaCl2尤其易产生沉淀，在实际工作中配置K-H液时我们一般边搅拌液体边依次加入各试剂，特别的最后加入CaCl2。

四．原方法全文：
1. Animals were anesthetized with intraperitoneal injection of pentobarbital (50 – 60 mg/ kg); and then they were tracheotomized, int ubated, and ventilated with a small animal ventilator (SAR-830/ P; CWE, Ardmore, PA, USA). The tidal volume and ventilation rate were 0.5 –0.6 ml and 100 – 120 strokes per min, respectively. Thoracotomy was performed through the third inter-coastal space of the left side, and the pericardium was opened as previously described (12 – 14). Then, 7-0 silk threads were passed around the left anterior descending coronary artery (LAD) using a tapered needle. Electrodes were placed to record the second limb electrocardiogram (ECG) through experiments. The artificial acute myo-cardial ischemia was induced by ligation of LAD. Myocardial ischemia was confirmed by regional cyano-sis and S-T segment elevation in the ECG. Reperfusion was induced by releasing the ligation and confirmed by a rapid color change in the surface of the myocardium. The arrhythmias were observed and the incidence of arrhythmias during ischemia and reperfusion was analyzed.[1]
注：本方法主要根据该文献修改
2All hearts were subjected to a 30 min stabilization period, 10 min global ischemia followed by 30 min reperfusion. Hearts which demonstrated contractile or other abnormalities during stabilization period were discarded. [2]
五．参考文献
1. Lai Z F, Shao Z, Chen Y Z, et al. Effects of sasanquasaponin on ischemia and reperfusion injury in
mouse hearts[J]. Journal of pharmacological sciences, 2004, 94(3): 313-324.
2. Yue Y, Qu Y, Boutjdir M. Protective role of protein kinase C epsilon activation in ischemia–reperfusion arrhythmia[J]. Biochemical and biophysical research communications, 2006, 349(1): 432-438.。