水质的细菌学检查
水环境卫生细菌学检测—细菌菌落总数的测定
2.2 平板涂布法
先制作平板；
取样品（无菌水）0பைடு நூலகம்1ml放入平板 上，涂抹棒均匀涂抹平板表面，直至 无残存样品（无菌水）；
翻转放置。
平板涂布
2. 3注意事项
保证无菌操作要求，同时注意不得影响样品中的微生物（培养基不得 太烫，取样时不要离火焰太近）；
制作平板时培养基不得沾附底面之外的侧面甚至盖上，未凝固前不得 翻转；
混匀器
四、接种培养
1.培养数量
不稀释样：样品、无菌水（无菌对照），共2 个培养，每个培养需培养3个平板（重复）；
需稀释样：最大稀释样及前两个稀释样、无 菌水，共4个培养，每个培养需培养3个平板 （重复）；
预先在培养皿底面标记清楚培养稀释度、操 作人、时间等信息。
培养皿标记
2. 接种平板
2.1 混合平板法
三、样品的稀释
主要针对样品中含较多微生物的水样（水源水、污水）；
自来水、饮用水一般不需稀释，可直接取样培养。
1. 分装无菌水 取数支无菌试管，标记10－1、10－2、……,每试管分装9ml无菌水 或无菌生理盐水。 （也可分装好后再灭菌）
稀释所需的数量级根据样品中微生物量的估计而定，一般轻度 污染水稀释到10－3，重度污染水可稀释到10－5、10－6。
对于不利于细菌生长的污染物，常需检测对应专门微生物及污染 物含量的直接检测。
二、稀释平板培养计数法
细菌的个体微小，直接观察、计数困难； 单个细菌经过培养可长成肉眼可见的菌落； 要设法避免多个细菌长成1个菌落，常需对 样品进行稀释处理。
稀释平板培养菌落
1.测定的程序：
样品稀释 接种平板 培养 菌落计数 报告
不同稀释度不得使用同一移液管，防止交叉影响及污染；
实验十 水的卫生细菌学检验(综合)
实验十水的卫生细菌学检验（综合）a)水中大肠菌群数的测定一、目的要求学习大肠菌群数的检测原理和方法。
二、实验材料样品: 水样2.培养基：乳糖胆盐发酵管(单料及双料), 伊红美兰琼脂(EMB)平板, 乳糖发酵管。
3.其他：显微镜，酒精灯，无菌吸管(10m1、1m1)，接种环，载玻片等三、基本原理水中的病原菌多数来源于病人和病畜的粪便。
由于病原菌的数量少, 检测过程复杂, 因此, 直接测它们的存在是非常困难的专业化工作。
由于大肠菌群在粪便中数量大, 在体外存活时间与肠道致病菌相近, 且检验方法比较简便, 因此一般采用测定大肠菌群或大肠杆菌的数量来作为水被粪便污染的标志。
如果水中大肠菌群的菌数超过一定的数量, 则说明此水已被粪便污染, 并有可能含有病原菌。
大肠菌群的定义是指一群好氧和兼性厌氧、革兰氏阴性、无芽孢的杆状细菌, 并能在乳糖培养基中, 经37℃24~48h培养能产酸产气。
我国规定每升自来水中大肠菌群不得超过3个。
检测大肠菌群的方法有稀释培养法和膜滤法两种, 其中稀释培养法是标准分析法, 为我国大多数卫生单位和水厂所使用。
它包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
四、方法与步骤1.采样: 取100ml磨口带塞玻璃瓶, 包扎后, 干热灭菌备用。
2.取自来水样时, 至少应先放水5min, 以冲去龙头口所带的微生物, 获得主流管中有代表性的水样。
取样时, 用右手握瓶, 左手启开瓶塞, 用覆盖瓶口的纸托住瓶塞, 收集样品后, 连同覆盖纸一起将瓶口塞好, 并用线绳在原处扎好。
注意手指不得触及瓶口内部。
在静水中取样时, 先用右手揭去塞子, 瓶口朝下浸入水下约30cm处, 然后将瓶子反转过来, 待水注满后, 取出塞好瓶口。
如果水在流动, 瓶口必须迎着水流, 以免手上的细菌被水冲进瓶子。
3.水样放置过程中, 内含的细菌数目和类型会发生变化, 所以要求水样品应于6~10℃贮存,并不超过6h。
4.初发酵试验：吸取待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内, 10ml接种量采用双料发酵管, 而lml及lml以下接种量采用单料管。
水中常规微生物检测
水中常规微生物检测指标：菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌。
一、水样的采集：池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。
如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。
二、菌落总数的测定菌落总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。
它反映的是检样中活菌的数量。
（1）实验器材1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。
2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
(2) 菌落总数的测定方法：1)水样稀释及培养：①按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释：②根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等，一般选择1、1:10两种浓度；水源水如河水等，比较清洁的可选择1:10、1:100、1:1000三种稀释度；污染水—被选择1:100、1:1000、1:10000三种稀释度)，吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。
③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，并趁热转动平皿混合均匀。
④待琼脂凝固后，将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±1h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。
三、大肠菌群的测定大肠菌群是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。
微生物实验-水的细菌学检查
一、实验目的 1．学习水样细菌总数的测定方法。 2．了解大肠菌群的数量与生活饮用水的
重要性。
生活用水的水源常被生活污水或工业废水或人与动 物的粪便所污染，可能含有不同类型的微生物，有 腐生性的和病原性的。
腐生性微生物对人无害，而病原性微生物则能引起 传染病的发生。
必须对生活用水及其水源进行严格的细菌学检查。
（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30～ 300之间，则以最接近300或30的平均菌落数 乘以稀释倍数进行报告。
五、思考题
你所测的池塘水、河水或湖水的污秽程度 如何?通过实验你对保护水源水有何看法？
经检查，水样是否合乎饮用标准？
2.细菌总数的测定 (1)自来水 (2)池塘水、河水或湖水
①水样稀释 ②吸取稀释后水样1ml加入平板 ③向平皿内倾注培养基(15～20 mL) ④37℃温箱，倒置培养24h，进行菌落计数
3.菌落计数方法
（1）计算相同稀释度的平均菌落数 。
（2）选择平均菌落数在30～300之间稀释度 的平板。当只有一个稀释度的平均菌落数 符合此范围时，则以该平均菌落数乘以稀 释倍数，作为该水样的细菌总数进行报告。
我国规定1 ml自来水中的总菌数不得超过100个。
三．实验用品
培养基： 牛肉膏-蛋白胨培养基
四、实验操作
（一）细菌总数的测定 1. 水样采集
自来水 将自来水龙头用火焰烧灼3 min灭菌，再拧开水龙头 流水5 min，以排除管道内积存的死水，随后用已灭 菌的三角瓶接取水样，以供检测。
池水、河水或湖水 将无菌的带玻塞的小口瓶浸入距水面10～15 cm深的 水层中，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流入瓶中装满 后，盖好瓶塞，取出后立即进行检测，或临时存于 冰箱，但不能超过24 h。
医学：水的细菌学检查-细菌总数的测定
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培养基
普通肉汤培养基
用于一般细菌的培养，含有适合细菌 生长的营养成分。
选择性培养基
根据需要选择适合特定细菌的选择性 培养基，以筛选和鉴别特定细菌。
实验设备
灭菌锅
恒温培养箱
显微镜
移液器
用于培养基和实验器具 的灭菌，确保无菌状态。
用于细菌的培养，保持 恒定的温度和湿度。
观察细菌形态和染色情 况，进行细菌鉴定。
取适量水样，加入培养基中， 在恒温培养箱中培养24小时， 观察并记录菌落数。
实验日期
XXXX年XX月XX日
实验材料
水样、培养基、无菌吸管、培 养皿
实验结果
菌落数分别为XX、XX、XX、 XX、XX。
结果解读
根据实验结果，可以 得出水样中细菌总数 的数量。
分析细菌总数高的可 能原因，如环境污染、 水质处理不当等。
将细菌总数与国家标 准进行比较，判断水 样的卫生质量。
误差分析
误差来源
取样过程中可能存在的污 染、培养基的质量问题、 操作过程中的失误等。
误差控制
采用无菌操作技术，确保 培养基的质量，提高实验 人员的操作技能和责任心。
误差消除
重复实验，取多次测量的 平均值作为最终结果，以 提高实验的准确性和可靠 性。
根据细菌的生长速度和培养基的特性，确定培养时间，一般为18-48小时。
结果观察
观察内容
在培养期间，观察细菌的生长情况， 记录菌落的数量、形态等信息。
结果判定
根据菌落的数量和分布情况，判断水 样中细菌总数的多少，并评估水质的 安全性。
水质菌落总数检测方法
水质菌落总数检测方法引言水质菌落总数检测方法是评估水体中细菌总数的一种重要方法，可以用于判断水体的卫生状况和水质的安全性。
本文将介绍水质菌落总数检测的原理、方法和应用。
一、原理水质菌落总数检测是基于细菌的生长原理进行的。
在菌落总数检测中，常用的方法是通过将水样溶液均匀地涂布在含有营养物质的琼脂平板上，然后在适宜的温度下进行培养，细菌就会在平板上形成可见的菌落。
通过计数菌落的数量，就可以得到水样中的细菌总数。
二、方法1. 准备工作(1) 准备琼脂平板：将琼脂混合溶液加热至完全溶解，冷却后倒入无菌培养皿中；(2) 准备培养基：根据需要添加不同的营养物质，如葡萄糖、肉葡萄糖、酵母粉等；(3) 灭菌：将琼脂平板和培养基一起进行高温高压灭菌。
2. 取样(1) 使用无菌容器采集水样；(2) 避免污染，尽量避免空气接触。
3. 稀释(1) 将水样稀释至一定浓度，以便于菌落的计数；(2) 根据水样的浑浊程度和预期菌落数量进行适当稀释。
4. 接种(1) 使用无菌吸管将稀释后的水样滴入琼脂平板上；(2) 均匀涂布水样，确保菌落的生长均匀。
5. 培养(1) 在适宜的温度下（通常为37℃），将琼脂平板倒置放置在培养箱中；(2) 培养时间通常为24-48小时，视菌落的生长速度而定。
6. 计数(1) 使用计数板或显微镜对菌落进行计数；(2) 确保计数的准确性，避免重复计数同一菌落。
三、应用水质菌落总数检测方法广泛应用于水质监测和卫生检验领域。
主要应用于以下方面：1. 自来水监测水质菌落总数检测可以评估自来水中细菌的数量，判断自来水的卫生状况，确保自来水的安全性。
2. 水源地评估通过对水源地进行水质菌落总数检测，可以判断水源地的卫生状况，及时采取措施保护水源地的水质。
3. 污水处理水质菌落总数检测可以评估污水处理系统的效果，判断处理后的水质是否符合排放标准，保护环境和人类健康。
4. 泳池水监测水质菌落总数检测可以判断泳池水的清洁程度，及时采取措施保证泳池水的卫生安全。
水质菌落总数检测方法
水质菌落总数检测方法一、引言水质菌落总数是评估水体卫生质量的重要指标之一，它能够反映水体中细菌的数量，进而判断水质是否合格。
因此，准确测定水质菌落总数对于保障水源安全、防止水传播疾病具有重要意义。
1. 培养法培养法是目前最常用的水质菌落总数检测方法之一。
其基本原理是将水样涂布在含有营养物质的琼脂平板上，然后在适宜的温度下培养一定时间，观察并计数菌落的数量。
这种方法简单易行，可以检测各种类型的细菌，但需要较长的时间，通常需要24-48小时才能得到结果。
2. 膜过滤法膜过滤法是一种快速测定水质菌落总数的方法。
其原理是将水样通过一块细孔膜滤膜，过滤掉水中的微生物，然后将滤膜放置在含有营养物质的琼脂平板上进行培养。
菌落在滤膜上生长并形成可见的斑点，通过计数斑点的数量来测定水质菌落总数。
相比于培养法，膜过滤法缩短了检测时间，通常只需要6-12小时即可得到结果。
3. 流式细胞仪法流式细胞仪法是一种高效准确的水质菌落总数检测方法。
它利用光散射和荧光染色技术，将水样中的微生物分为不同的群体并进行计数。
流式细胞仪能够快速检测大量样品，并提供详细的菌落分布数据，具有高灵敏度和准确性。
但是，流式细胞仪法的设备较为昂贵，需要专业操作人员进行操作。
4. PCR法PCR法是一种基于DNA扩增的水质菌落总数检测方法。
它利用特定的引物和酶，在聚合酶链反应的条件下，扩增水样中细菌的DNA片段。
通过测定扩增产物的数量，可以间接测定水质菌落总数。
PCR 法具有高灵敏度和高特异性，并且可以快速得到结果，但需要专业的实验室设备和技术支持。
三、不同方法的优缺点比较1. 培养法的优点是操作简单，可以检测不同种类的细菌。
缺点是需要较长时间，无法实时监测水质。
2. 膜过滤法的优点是快速，可以在较短时间内得到结果。
缺点是只能检测活菌，对于耐热菌等特殊菌种的检测效果较差。
3. 流式细胞仪法的优点是高效准确，可以实时监测水质。
缺点是设备昂贵，需要专业操作人员。
〖医学〗水的细菌学检查---细菌总数的测定
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水质的细菌学检查
一、目的要求
(一)学习水质的细菌学检查法
(二)了解水质状况同细菌数量的关系及大肠菌群的数量在饮水中的重要性。
二、基本原理
检测水中的细菌数量是评价水质状况的重要指标之一。
饮水是否合乎卫生标准，需要进行水中细菌数量及大肠菌群数量的测定。
大肠菌群是肠道最普遍存在和数量最多的一群细菌，由于大肠菌群是一群能发酵乳糖的革兰氏阴性、无芽孢杆菌，它们在乳糖培养基中经37℃培养24小时即能产酸、产气，所以常将其作为粪便污染的标志。
饮用水一般规定：1毫升自来水中总菌数不得超过100个；1000毫升自来水中大肠菌群数不得超过3个。
三、实验材料
培养基及器皿、牛肉膏蛋白胨培养基、乳糖蛋白胨发酵管（内倒置小管）、三倍乳糖蛋白胨发酵管（内倒置小管）、伊红美蓝琼脂培养基、无菌空瓶、无菌水、无菌培养皿、移液管、试管。
四、实验内客
(一)采取水样
1、自来水：从学校各生活区取样。
先将自来水龙头用火焰灭菌,再开放水龙头使水流1—2分钟后，用无菌空瓶接取水样。
2、池水、湖水或河水：用无菌空瓶取距水面10—15厘米深层水样。
水样采取后应立即检验，不得超过4小时。
(二）水中细菌总数测定
l、自来水：
稀释水样：原水样和10-1 水样，用无菌移液管分别吸取l毫升原水样和10-1水样，分别注入二个无菌培养皿中。
每皿各加13--15毫升已融化并冷却到4 5-- 50℃的牛肉膏蛋白胨培养基，轻轻旋转，使培养基与水样充分混匀，待凝固后，将平板倒置于37℃恒温箱内，培养24小时进行菌落计数。
制作培养基方法、消毒灭菌、接种、计数皆参照参微生物学实验指导，具体如下：培养基制作：实验五、培养基的制备
培养基配方：附录二、常用培养基之一
培养基灭菌：实验六、灭菌与消毒
水样接种：实验七、土壤微生物的分离与测数
细菌总数测定：实验七、土壤微生物的分离与测数
2、池水、湖水或河水等。
稀释水样：稀释倍数视水样污浊程度而定，使水样培养后每个平板中的菌落数在30--300之间的的稀释度最为合适。
例如：取湖水稀释成10-1、10-2、10-3。
每个稀释度作两个培养皿，并依上法倾入培养基制成平板，培养，计数。
菌落计数方法：
（1）先计算同一稀释度的平均菌落数。
若其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不应采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。
若片状菌落的大小不到培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一
半的菌落数乘2代表全平板的菌数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。
（2）首先选择平均菌落在30—300之间的平板，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数（见表1中例1）。
（3）若有两个稀释度的平均菌落数都在30--300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。
若其比值小于2则应取两者的平均数；若大于2则取其中较小的菌落总数（表1中例2及3）。
（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数（表1中例4）。
（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数（表1中例5）
（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30--300之间。
则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数（表一中例6）
(三）用发酵法检查大肠菌群
1、自来水：分三个步骤进行检查
（1）初发酵试验：在2个装有50毫升三倍乳糖蛋白胨发酵管中，各加入100毫升水样，在10支装有5毫升三倍乳糖蛋白胨发酵管中，各加入10毫升水样。
混匀后37℃培养24小时。
（2）平板分离：经24小时培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管，分别划线接种于伊红美蓝平板上，于37℃培养18--24小时，将符合下例特征的菌落的一部分，进行涂片、革兰氏染色、镜检。
a．深紫黑色，具有金属光泽的菌落；
b．紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落；
c．淡紫红色，中心色较深的菌落。
（3）复发酵试验：经涂片、染色、镜检为革兰氏阴性无芽抱杆菌时，则挑取该菌落的另一部分，再接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一发酵管的同类型菌落1---3个。
37℃培养24小时，结果若产酸产气，即证实有大肠菌群存在。
证实有大肠菌群存在后，再根据发酵试验的阳性管数查表二,即得大肠菌群数。
2．池水，湖水或河水等
分别取湖水10-2、10-1的稀释液及原水样各1毫升，加到装有10毫升普通乳糖蛋白胨发酵液试管中。
另取10毫升和100毫升原水样，分别加到装有5毫升和50毫升三倍乳糖蛋白胨发酵液的试管中。
以下步骤同上述自来水的平板分离和复发酵试验。
若证实有大肠菌群存在，则根据大肠菌群阳性管数查表三或表四即得每升水样中的大肠菌群数。
表二大肠菌群检数表
表三大肠菌群检数表
表四大肠菌群检数表
五、实验报告内容
（一）我校各生活区水样中，细菌总数每毫升多少？经大肠菌群检查每升水中含多少？水源被污染，出现什么情况？
（二）在湖水（或河水）水样中细菌总数及大肠菌群数是多少？不同区域取样有无区别，为什么？
六、思考题
（一）大肠菌群中的细菌种类一般并非是病原菌，为什么要选大肠菌群作为水源被污染的指标？
（二）伊红美兰培养基中的哪些成分有助于我们鉴别大肠杆菌?
附录:所需培养基配方
一、牛肉膏蛋白胨培养基：（300ml/桌，用500ml三角瓶做）
牛肉膏3克
蛋白胨10克
NaCl 5克
琼脂20克
自来水1000毫升
PH 7.2---7.4
灭菌121℃，30分钟
二、乳糖蛋白胨培养液（单倍）（200ml/桌，用500ml瓷缸子做）
蛋白胨10克
牛肉膏3克
乳糖5克
NaCl 5克
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1毫升
将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及NaCl加热溶解于1000毫升蒸馏水中，调pH至7.2---7.4。
加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1毫升，混匀，分装于有倒置杜氏小管的试管中。
115℃灭菌20分钟。
三、三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：（600ml/桌，用1000ml瓷缸子做）
上述培养液中成分各按三倍量配制，蒸馏水仍为1000毫升。
四、伊红美兰培养基（200ml/桌，用300ml三角瓶做）
蛋白胨10克
乳糖10克
磷酸二氢钾2克
琼脂20克
蒸馏水1000毫升
*2%伊红水溶液20毫升
*0.5%美兰水溶液13毫升
pH 7.2---7.4
灭菌115℃,20分钟
*为灭完菌再加
水质细菌学检查实验时间安排
第一次：讲实验
第二次：准备器皿、洗器皿、准备无菌水管、灭菌第三次：做培养基、采样、接种、初发酵实验
（第三次应在下午1时准时开始）
第四次：平板计数、接种于伊红培养基中
第五次：革兰氏染色、复发酵实验
第六次：分析结果
水质细菌学检查需要器皿（共分六个组）
培养皿：18副/组，配铁桶2个/组
试管架：1个/组（能插入大试管的）
大试管：22支/组，配塞子
小试管：5支/组，配塞子
500毫升矿泉水瓶：2个/组
150毫升三角瓶：4个/组，配塞子
300毫升三角瓶：1个/桌，配塞子（做伊红美兰培养基用）500毫升三角瓶：1个/桌，配塞子（做细菌培养基用）100毫升容量瓶：2个/组（灭菌）（接种水样用）
5毫升枪头：5支/组（其中需灭菌3支）
1毫升枪头：6支/组（全部灭菌）
50毫升量筒：1个/组酒精灯：1个/组
指形试管：4支/组玻璃纸：3张/桌
杜氏小管：22支/组铁丝筐：1个/组
瓷缸：1000毫升1个/桌
500毫升2个/桌
玻璃棒：2支/桌
pH广泛试纸：1个/桌
凉开水：1锅
洗衣粉
革兰氏染色盘：1套/桌
所需试剂：（实验室准备一份）
1NHCl：（贮于棕色小试剂瓶中）
HCl(含量为38%) 83.3毫升
蒸馏水916.7毫升
1NNaOH：（贮于棕色小试剂瓶中）
NaOH 40克
蒸馏水100毫升
2%伊红水溶液：
伊红2克
蒸馏水100毫升
0.5%美兰水溶液
美兰0.5克
蒸馏水100毫升
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液
溴甲酚紫1.6克溶于100毫升95%乙醇中
pH广泛试纸：一板。