荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制
荧光定量PCR标准曲线的建立
〈八〉试验十三、荧光定量PCR标准曲线的建立一、实验目的获得温度的的熔解曲线，绘制荧光定量PCR标准曲线。
二、实验材料1.451bp重组质粒2.仪器：BIO-RAD iCyeler iQ5型荧光定量PCR仪微量加样器德国Eppdorf公司三、实验步骤1.模板质粒DNA参考质粒抽提试剂盒提取451bp重组质粒，按10倍梯度稀释6个浓度备用。
2.运用特异性引物荧光定量检测样品特异性引物对CAPFW/ CAPRV1CAPFW: 5′-TTTAGTTGGGGGTCTTGTACC-3′(21bp)CAPRV1:5′-CCTCCACAACCAGCAACA-3′ (18bp)荧光定量PCR反应体系（50μL）：25μl SYBR premx Ex Taq(2×);1μl CAPFW (10uM)；1μl CAPRV1 (10uM)；4μl DNA模板；O。
19 ul ddH2PCR扩增条件：95℃预变性2min；95℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1 min和40个循环；72℃延伸5 min。
（在84°C检测目标扩增（熔融温度（Tm）= 86.5℃）的荧光。
）熔解曲线：65℃-95℃，在520 nm下每10 s升高0.5℃直至加热到95℃时连续测量荧光，获得温度的融解曲线。
绘制标准曲线:辣椒疫霉菌DNA按10倍梯度稀释6个浓度的对数为横坐标，以PCR反应的循环数（Ct）为纵坐标绘制标准曲线。
4.Bio-Rad iQ5软件绘制标准曲线，分析处理数据。
应用公式如下：待测样本浓度（ng/ul）=OD260×50×稀释倍数样本分子量=碱基数×324待测样本拷贝数= 待测样本浓度×6×104样本分子量付：Chelex-100法提取土壤中辣椒疫霉菌DNA 称取0.1g土样，放入EP管中液氮研磨;向收集土壤的1.5ml离心管中加入100ul 5% chelex-100悬浊液，混匀，65℃水浴2h;沸水浴10min;置于冰浴3min;12000r/min离心10分钟，取上清做PCR模板待用。
荧光定量pcr标准曲线分析
荧光定量pcr标准曲线分析荧光定量PCR（qPCR）是一种用于检测和定量DNA或RNA分子的技术，它利用荧光信号来监测PCR反应的进行。
在qPCR实验中，标准曲线分析是非常重要的一步，它可以帮助我们准确地定量目标分子的起始量。
本文将介绍荧光定量PCR标准曲线分析的步骤和注意事项。
首先，准备实验所需的材料和试剂，包括PCR试剂盒、引物、模板DNA或RNA、荧光定量PCR仪等。
接下来，按照试剂盒说明书中的操作步骤，将PCR反应体系配置好，包括PCR反应缓冲液、引物、模板DNA或RNA等。
注意在配置反应体系时，要严格控制每个试管中各组分的添加量，确保实验的准确性和可重复性。
然后，进行PCR反应，设置合适的PCR程序。
在PCR反应过程中，要注意监测荧光信号的变化，以确保PCR反应的进行。
完成PCR反应后，将反应体系中的产物进行电泳检测，验证PCR反应的特异性和产物大小。
接下来，进行标准曲线的构建。
首先，选取一系列已知浓度的标准样品，分别进行PCR反应，得到一系列标准曲线上的数据点。
然后，利用这些数据点，通过绘制标准曲线，可以得到PCR反应的效率和相关系数等参数。
在绘制标准曲线时，要注意选择合适的数据处理方法和拟合模型，确保标准曲线的准确性和可靠性。
最后，利用构建好的标准曲线，对待测样品进行荧光定量PCR分析。
根据待测样品的荧光信号，可以通过标准曲线，计算出目标分子的起始量。
在进行数据分析时，要注意排除干扰因素，确保数据的准确性和可靠性。
在进行荧光定量PCR标准曲线分析时，需要注意一些常见的问题和注意事项。
例如，在配置PCR反应体系时，要注意避免污染和交叉污染，确保实验的准确性；在构建标准曲线时，要选择合适的标准样品，并进行多次重复实验，以确保标准曲线的可靠性；在进行数据分析时，要注意排除异常数据，确保结果的可信度。
总之，荧光定量PCR标准曲线分析是一项非常重要的实验步骤，它可以帮助我们准确地定量目标分子的起始量。
荧光定量标准曲线制作
荧光定量标准曲线制作荧光定量标准曲线是一种用于测定未知样品中目标分子含量的方法，通过建立标准曲线，可以准确地确定未知样品中目标分子的浓度。
本文将介绍荧光定量标准曲线的制作步骤和注意事项。
1. 实验材料准备。
首先，准备实验所需的材料，包括标准品溶液、稀释液、荧光标记物等。
在选择标准品时，应该选择具有较高纯度和稳定性的化合物作为标准品。
同时，稀释液的选择也非常重要，应该选择与标准品相容的稀释液，以保证实验结果的准确性。
2. 样品制备。
将标准品按照一定的比例用稀释液稀释，制备出一系列不同浓度的标准溶液。
同时，也需要制备未知样品的溶液，确保样品的制备过程中要避免污染和损失。
3. 荧光测定。
将标准品溶液和未知样品溶液分别加入到测定皿中，使用荧光光度计进行测定。
在测定过程中，要注意避免气泡的产生，以免影响测定结果的准确性。
4. 建立标准曲线。
将测定得到的标准品溶液荧光强度值与其对应的浓度值进行绘图，得到标准曲线。
通常情况下，标准曲线应该是一条直线，如果出现曲线不理想的情况，可能需要重新制备标准品溶液或者调整荧光测定条件。
5. 浓度测定。
将未知样品的荧光强度值代入标准曲线中，根据标准曲线得到的拟合方程，计算出未知样品中目标分子的浓度。
注意事项：1. 在实验过程中，要严格控制实验条件，避免因为实验条件不同而导致测定结果的误差。
2. 实验中应该注意实验仪器的使用和维护，确保荧光光度计的准确性和稳定性。
3. 实验中的所有操作都应该按照标准操作程序进行，确保实验过程的可重复性和准确性。
4. 实验结束后，要对实验仪器和实验场地进行清洁和消毒，确保实验环境的整洁和安全。
总结：荧光定量标准曲线的制作是一项重要的实验技术，正确的制作标准曲线可以保证实验结果的准确性和可靠性。
在实验过程中，要严格控制实验条件，注意实验操作的规范性，确保实验结果的准确性和可重复性。
希望本文的介绍对于荧光定量标准曲线的制作有所帮助，让实验工作者能够更加准确地测定未知样品中目标分子的含量。
荧光pcr标准曲线制备excel
荧光pcr标准曲线制备excel
荧光PCR标准曲线制备Excel
荧光PCR标准曲线是定量PCR的重要步骤之一，用于测量PCR反应中特定的目标DNA序列的相对丰度。
在制备荧光PCR标准曲线时，需要按照以下步骤进行操作。
1.准备反应体系
反应体系中需要包括PCR Master Mix、模板DNA和引物探针。
这些试剂可以直接购买或自制，根据反应需要进行量的调整。
2.建立标准曲线
在制备标准曲线前，需要根据目标DNA序列设计引物探针。
选取一段相对保守的序列，并在引物探针中添加荧光分子。
根据目标DNA浓度依次添加不同浓度的模板DNA，进行PCR扩增。
将PCR产品进行电泳检测，并从最清晰的条带中取出适量的PCR产物，用来制备标准曲线。
3.样品扩增
根据实验需要选择样品DNA提取的方法，制备好待检DNA。
然后将待检DNA按需要的浓度稀释至制定的浓度范围内。
利用相同的PCR
反应体系，对每个浓度的样品DNA进行PCR扩增。
4.荧光检测
将扩增产物加入荧光探针，利用荧光实时PCR仪进行荧光检测。
根据
标准曲线，将样品PCR产物的荧光信号转化为目标DNA的相对浓度。
总结
荧光PCR标准曲线的制备是定量PCR实验中不可或缺的步骤，该方法
可以对PCR反应中的目标DNA进行定量测定。
在制备标准曲线时，
需要严格按照实验步骤进行操作，确保结果的可靠性。
荧光实时定量pcr标准曲线
荧光实时定量pcr标准曲线
荧光实时定量PCR标准曲线是指在荧光定量PCR反应中，以荧光信号强度为纵坐标，以循环数为横坐标所绘制的曲线。
该曲线通常包括扩增曲线和熔解曲线两部分。
扩增曲线描述了PCR动态进程，它以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光信号强度为纵坐标。
理论上，PCR过程中反应产物是以指数增长的，但随着PCR循环数的增加，PCR扩增效率会逐渐降低，产物生成的速度也会逐渐减缓，因此扩增曲线是一条“S形”曲线。
熔解曲线则是在PCR扩增阶段结束后，设置一段熔解反应程序，检测并记录DNA双链产物解链过程的荧光信号变化，得到一条熔解曲线。
这个曲线反映了不同PCR产物在熔解温度下的解链情况。
荧光实时定量PCR标准曲线的建立需要经过多步程序，包括设计引物和探针、设置PCR反应条件、运行PCR反应、收集荧光信号数据等步骤。
标准曲线可以用于未知样品的定量分析，通过比较未知样品与标准样品的荧光信号强度，可以计算出未知样品中的目标基因拷贝数或浓度。
总之，荧光实时定量PCR标准曲线是一种重要的实验工具，它可以帮助我们更好地理解PCR反应的动态变化过程，并对未知样品进行准确的定量分析。
荧光定量PCR之绝对定量分析
荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制1.绝对定量定义绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。
将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。
以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。
______________ _____ _♦ Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系CT值，就可以计算出样品中所含的模板量♦由样品厂闻w I it 厂Of”他 *标准品的一些标准*必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同♦标准品必须是经过准确定量的（我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计）*标准品必须是标准化的（例如，同一化的细胞数）*在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定CT值 _____标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA,也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物，当然也可以是基因组DMA,甚至cDNA,但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。
3.标准品的制备RNA-cDNAPCR<一般一条标准曲线取四到五个点，浓度围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。
一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复 的次数。
倍比梯度稀释方法：1V 原液(标准品i) +9v 稀释缓冲液，得标准品ii lv 标准品ii+9v 稀释缓冲液，得标准品iii lv 标准品iii+9v 稀释缓冲液，得标准品iv lv 标准品iv+9v 稀释缓冲液，得标准品v 依次倍比稀释拷贝数的计算：详见核酸拷贝数的计算4. ________________________________________________________________________ 实例 ________________________________________________________________________________ 标准品的制作：将标准品依次进行10倍稀释，ASP-3700测得其拷贝数1.55X 108copy /ul 标准曲线的绘制(lcycle=lmin)设置对照：浓度为 1.55X107, 1.55X106、1.55X105, 1.55X104、1.55X103, 1.55X 102. 1.55X101的标准样品各一个，设空白对照PCR 反应：以不同浓度标准品作为模板标准品的扩增曲线半学半 g 购hi 上fola&kLdn 丄胡叶.型 _LLii?并吃 I 025SD0 4IK4 D.2Q51F oo )wo- MSI”?.8 门&&2 0592D1 WWb♦ ・bioask +cn+山5"叽6)， J-n-sspdocs)' —HFi —-HrH空白対腮训3叽cnB 1512 i<1« 2D 22 Z< 2623 JD 12 洌 3(- J8 -It 农仏僱伦 W %54 M 5B W<yii»标准品的溶解曲线n>o o o o*J.1 t 9 |L 广 制.T_ 1玉 75£s £s s £7.寰57養45.S 92M .S SM SJ a J 201.S Zo.nBRD ・i583s君a £22s£s須34.293.23 代5 M S I593650O b -・6 2・8s 5・2 6」7・6 ogunma- copyrulmbera^rw勢盖扩增效率(E)计算E二10-1/斜率=10-1/-3. 23-2. 04, E%= (2. 04-1) X100%= 104%若未知样本的CT值为19.11,将CT值代入线性方程: 即19. 11=34.29-3. 23X,所以X=(19. 11-34. 29)/(-3. 23)-4. 7 Quantityunknow-104. 7-50118 copies。
PepT1基因绝对荧光定量PCR标准曲线的建立
PepT1基因绝对荧光定量PCR标准曲线的建立李慧锋;李丽;张丽娟;徐玉良;李武峰【摘要】为研究 PepT1 mRNA 在鸡小肠的表达对于蛋白质消化吸收的影响,实验建立了 PepT1 基因绝对荧光定量PCR标准曲线.根据GenBank中 PepT1 的序列信息设计合成两对引物,引物一是克隆引物,用于从鸡小肠细胞中扩增出cDNA片段;引物二是荧光定量PCR引物,其长度包含于引物一中,用荧光定量PCR来检测基因的表达.通过克隆出 PepT1 基因282 bp部分片段并插入到PMD18载体中,从而构建出绝对荧光定量PCR标准曲线.从实验结果得出标准曲线的回归方程为Y=-3.205X+34.170,其回归系数R2=0.990,溶解曲线表现为单一的峰,通过对结果的具体分析,认为该方法可靠,特异性均较强,可成功构建目的基因的标准曲线.【期刊名称】《山西农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(030)004【总页数】4页(P332-335)【关键词】鸡小肠;PepT1;荧光定量PCR;标准曲线【作者】李慧锋;李丽;张丽娟;徐玉良;李武峰【作者单位】山西农业大学,生命科学学院,山西,太谷,030801;山西农业大学,生命科学学院,山西,太谷,030801;山西农业大学,生命科学学院,山西,太谷,030801;山西农业大学,生命科学学院,山西,太谷,030801;山西农业大学,生命科学学院,山西,太谷,030801【正文语种】中文【中图分类】Q75小肽跨膜转运是一种自然界普遍存在的现象,在人、动物、细菌、真菌以及高等植物发芽种子中都有发现[1]。
小肽转运载体PepT1是质子依赖型转运载体,是动物组织内一个重要的生理过程,通常是通过动物小肠进行表达的[2]。
小肽对动物营养有着特殊的意义,一方面在吸收过程中,小肽与游离氨基酸的吸收是两个相互独立的转运系统,与游离氨基酸相比,小肽具有吸收速度快、耗能低、不易饱和,且各种肽之间转运无竞争性与抑制性等特点,有关资料表明在蛋白质消化过程中,以肽形式存在的氨基酸浓度远比游离氨基酸存在的浓度大,而且肽的吸收速度也快[3～4]。
荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制
荧光定量PC R之绝对定量分析——标准曲线的绘制1. 绝对定量定义绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。
将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。
以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。
* Log(起始浓度)与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系* 由样品CT值，就可以计算出样品中所含的模板量2. 绝对定量标准品标准品的一些标准* 必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同* 标准品必须是经过准确定量的（我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计）* 标准品必须是标准化的（例如，同一化的细胞数）* 在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定CT值标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA，也可以是比扩增片段长的纯化后的P CR产物，当然也可以是基因组DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。
3. 标准品的制备一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。
一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。
倍比梯度稀释方法：1v原液（标准品i）+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品i i+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品i ii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品i v+9v稀释缓冲液，得标准品v依次倍比稀释拷贝数的计算：详见核酸拷贝数的计算4. 实例标准品的制作：将标准品依次进行10倍稀释，ASP-3700 测得其拷贝数1.55×108copy /ul标准曲线的绘制（1cycle=1min）设置对照：浓度为1.55×107、1.55×106、1.55×105、1.55×104、1.55×103、1.55×102、1.55×101的标准样品各一个，设空白对照PCR反应：以不同浓度标准品作为模板标准品的扩增曲线标准品的溶解曲线标准品的标准曲线图扩增效率（E）计算：E=10-1/斜率=10-1/-3.23=2.04，E%=(2.04-1)×100%=104%若未知样本的CT值为19.11，将CT值代入线性方程：即19.11=34.29-3.23X，所以X=(19.11-34.29)/(-3.23)=4.7Quanti tyunk now=104.7=50118copies核酸拷贝数的计算一、分步推理如何计算核酸拷贝数1A260吸光度值=dsDNA50ug/ml=ssDNA33ug/ml=ssRNA40ug/ml核酸浓度＝(OD260)×(diluti on factor)×[33或40或50]=ng/ulMW代表克/摩尔，单位dolt on：1dolto n即表示1g/mol1摩尔=6.02x1023摩尔分子(拷贝数)平均分子量(MW)：dsDNA=(碱基数)×(660道尔顿/碱基)ssDNA= (碱基数)×(330道尔顿/碱基) ssRNA=(碱基数)×(340道尔顿/碱基)得到拷贝数计算公式：(6.02x1023拷贝数/摩尔)×(浓度)/(MW g/mol)= copies/ml.即(6.02x1023)×(g/ml)/(DNA length×660)=copies/ml.或(6.02×1023)×(ng/ul×10-9)/(DNA length×660)=copies/ul.例：3000碱基质粒，浓度100ng/ulMW=3000bp×660dal ton/bp=1.98×106dal tons，即1mol=1.98×106g(100ng×10-9)g/1.98×106＝摩尔数copy数＝摩尔数×6.02×1023＝3×1010co pies/ul.二、这是一个小小的计算器，使你计算更加方便快捷，免去算数之苦……http://www.bioask.me/html/541.html什么是拷贝数？www.bioas/html/540.html如何计算拷贝数？计算方法：(6.02×1023拷贝数/摩尔) ×(浓度g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml [平均分子量(MW g/mol)：dsDNA=(碱基数)×(660道尔顿/碱基)；ssDNA=(碱基数)×(330道尔顿/碱基)；ssRNA=(碱基数)×(340道尔顿/碱基)]。
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荧光定量PCR之绝对定量分析——标准曲线的绘制
1. 绝对定量定义
绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。
将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。
以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。
* Log(起始浓度)与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，即得到该扩增反应存在的线性关系
* 由样品CT值，就可以计算出样品中所含的模板量
2. 绝对定量标准品
标准品的一些标准
* 必须用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同
* 标准品必须是经过准确定量的（我们通常用的是ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计）
* 标准品必须是标准化的（例如，同一化的细胞数）
* 在每组实验时，必须用相同的阈值设定来确定CT值
标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA，也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物，当然也可以是基因组DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作为标准品的核酸都必须保证稳定。
3. 标准品的制备
一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。
一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。
倍比梯度稀释方法：
1v原液（标准品i）+9v稀释缓冲液，得标准品ii
1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii
1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv
1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v
依次倍比稀释
拷贝数的计算：详见核酸拷贝数的计算
4. 实例
标准品的制作：将标准品依次进行10倍稀释，ASP-3700 测得其拷贝数1.55×108copy /ul 标准曲线的绘制（1cycle=1min）
设置对照：浓度为1.55×107、1.55×106、1.55×105、1.55×104、1.55×103、1.55×102、1.55×101的标准样品各一个，设空白对照
PCR反应：以不同浓度标准品作为模板
标准品的扩增曲线
标准品的溶解曲线
标准品的标准曲线图
X
Log 7
6
5
4
3
2
1
Y
CT值 12.01
14.89
17.92
21.18
24.56
27.89
31.25
扩增效率（E）计算
E=10-1/斜率=10-1/-3.23=2.04，E%=(2.04-1)×100%=104%若未知样本的CT值为19.11，将CT值代入线性方程：即19.11=34.29-3.23X，所以X=(19.11-34.29)/(-3.23)=4.7 Quantityunknow=104.7=50118 copies。