DNA重组
DNA的重组
7.2 同源重组
同源重组的概念
同源重组的特点 同源重组的功能 同源重组的机制 细菌的基因转移和重组
7.2 同源重组
同源重组的概念
同 源 重 组是两 条 具 有 同源 序 列 的 DNA靠近时所发生的DNA交换。
真核生物的同源 重组发生在减数 分裂时，姐妹染 色单体间遗传物 质间的交换。
7.2 同源重组
溶菌和溶源状态通过位点特异性重组可 以相互转变且可逆，原先存在的DNA顺 序全部被保存下来，并无丢失。 噬菌体和细菌DNA之间有一段很短的同 源序列，重组交换必须通过其中一个特 定的核苷酸。
7.3 位点特异性重组
l噬菌体整合作用的相关元件
细菌DNA和l-DNA的特异附着位点
l噬菌体特异附着位 点为attP，由POP’ 三部分组成。 细菌特异附着位点 为attB，由BOB’三 部分组成。 重 组 后 位 点 为 attL 和 attR ， 分 别 由 BOP’ 和 POB’ 序 列 组成。 attP 和 attB 序 列 中 有 一段相同的核心序列 O，是重组发生的区 域。
7.2 同源重组
细菌的同源重组 发生在接合过程 中，交配的染色 体在两个紧密接 触的细胞中转移， 接合引起重组。
7.2 同源重组
Homologous Recombination
重组修复中也发生同源重组。
7.2 同源重组
同源重组的特点
要求较大的同源DNA片段（﹥75bp） 才能进行交换，同时需要重组酶RecA 参与。 同源片段相同或相近，在任何位点均可 发生重组，但存在重组热点。 整个基因组重组频率不恒定，受综合效 应和局部效应的影响。
7.2 同源重组
切断
Holliday重组模型
交叉
DNA重组技术
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② 工具酶
DNA重组技术中对DNA的“精雕细刻”主要用酶作 为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多 都用作工具，所以称在核酸及有关研究中像基本 工具一样不可缺少的酶类为工具酶。这类酶包括 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、末 端修饰酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。
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限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
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PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和 量要求低。因此，广泛应用于许多领域。 1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
限制性核酸内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶， 可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀； 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚 合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶； 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且 与电泳技术相结合还可以用于基因组酶切图谱的鉴定 以及法医鉴定等。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 13
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6 重组体的转化及鉴定
转化 转化过程是指将DNA重组体或质粒转到适宜的宿主细 胞中。通过这个过程，使目的基因片段得到大量扩 增、或产生需要的基因表达产物、或使宿主生物具 备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳 定遗传。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对 转化的大肠杆菌进行扩大培养使目的基因大量表达 和积累。通过对表达产物分离纯化便可获得想要的 产品。
DNA的重组
有些细菌在自然条件下不发生转化或转化 效率很低，但在实验室中可以人工促使转化。 例如大肠杆菌，用高浓度Ca2+处理，可诱导细 胞成为感受态，重组质粒得以高效转化。
转化过程涉及细菌染色体上10多个基因编码的功能。 转化过程涉及细菌染色体上10多个基因编码的功能。如：感受态因、 10多个基因编码的功能 感受态因、 与膜结合的DNA结合蛋白、自溶素、多种核酸酶等 DNA结合蛋白 与膜结合的DNA结合蛋白、自溶素、多种核酸酶等。感受态因子诱导与 感受态有关的蛋白质表达，自溶素使与膜结合的DNA结合蛋白、 DNA结合蛋白 感受态有关的蛋白质表达，自溶素使与膜结合的DNA结合蛋白、核酸酶 裸露，当游离DNA与膜结合的DNA结合蛋白结合后， DNA与膜结合的DNA结合蛋白结合后 裸露，当游离DNA与膜结合的DNA结合蛋白结合后，核酸酶使其中一条 链降解，另一条链被吸收，与染色体DNA重组。 DNA重组 链降解，另一条链被吸收，与染色体DNA重组。
3.细菌的转导 转导(transduction)是通过噬菌体将细菌基因 从供体转移到受体细胞的过程。 转导有两种类型 普遍性转导(generalized transduction):是指宿 主基因组任意位置的DNA成为成熟噬菌体颗 DNA 粒DNA的一部分而被带入受体菌。 局限性转导(specialized transduction)：某些温 和噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主染色体整合 部位的DNA切割下来取代病毒DNA。
小鼠： J λ C λ3 小鼠：Vλ2 人： Vλ～ 300 J λ C λ6 λ 小鼠重链基因族（ 号染色体 号染色体） 小鼠重链基因族（12号染色体）
细菌的结合作用
traS和traT基因编码表面排斥蛋白，阻止F+细胞之间的转移，F+细胞的性菌毛与F-细胞 基因编码表面排斥蛋白，阻止F 细胞之间的转移， 细胞的性菌毛与F
DNA重组(DNA recombination)技术：DNA重组与鉴定-1
DNA重组（DNA recombination）技术：DNA重组与鉴定-1重组DNA是在体外用限制性内切酶，将不同来源的DNA分子进行特异地切割，获得的目的基因或DNA片段与载体重新连接，从而组成一个新的DNA杂合分子。
重组的DNA分子能够通过一定的方式进入相应的宿主细胞，在宿主细胞中进行无性增殖，获得大量的目的基因或DNA片段，此过程称基因克隆。
重组的DNA分子也能够在宿主细胞中进行表达，获得相应的蛋白质的表达。
一、DNA重组重组DNA分子的构建所需的目的基因或DNA片段可来自基因组DNA、cDNA以及人工合成的DNA片段；载体最常用的是质粒、噬菌体及逆转录病毒等；它们在限制性内切酶的作用下，可形成粘性末端或平齐末端，在DNA连接酶的作用下可连接成一个DNA 重组体。
（一）目的DNA片段与载体的连接主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体遗传性状的目的。
DNA克隆的一项关键技术就是DNA重组技术，所谓DNA重组，就是指把外源目的基因“装进”载体过程，即DNA的重新组合。
这种重新组合的DNA叫做重组体，因为是由两种不同来源的DNA组合而成，所以又称异源嵌合DNA。
载体在DNA克隆中是不可缺少的，目的基因片段与之共价连接形成重组体后，才能进入合适的宿主细胞内进行复制和扩增。
作为载体DNA分子，必须具有能够在某些宿主细胞中独立地自我复制和表达能力，这样，外源目的基因装入该载体后，才能在载体的带动下一起复制，达到无性繁殖的目的；载体分子不宜过大，以便于DNA体外操作，同时载体DNA与宿主核酸应容易分开，便于提纯；载体上应具有两个以上的容易检测的遗传标记，以区分阳性重组分子和阴性重组分子。
选择性标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷型及形成嗜菌斑的能力等；载体应该具有多个限制性内切酶的单一切点，以便从中选出一种酶，使它在目的基因上没有切点，保持目的基因的完整性。
dna重组技术名词解释
dna重组技术名词解释
DNA重组技术是指通过将不同来源的DNA分子进行拼接、融合或交换,创造出新的基因或基因组的过程。
以下是与该标题相关的一些名词解释:
1. 重组DNA:指从不同来源的DNA分子中获取的DNA片段,这些DNA片段可以来自于同一物种的不同细胞、不同组织或不同来源。
2. 基因重组:指在基因组中发生的基因组合或序列替换,导致新的基因产生或改变生物的性状。
3. 基因编辑:指使用CRISPR等技术手段,对基因进行精确地剪切、删除、替换等操作,以调节或改变生物的性状。
4. 基因组重组:指不同物种之间的基因组重组,可能导致新物种的产生。
5. 非同源重组:指重组DNA中不同的DNA片段之间的非同源性结合,这种结合可能会导致新的基因产生或改变生物的性状。
6. 同源重组:指两个DNA分子中的相同序列之间的结合,这种结合通常不会导致新的基因产生或改变生物的性状。
7. 基因表达:指DNA信息被转化为蛋白质信息的过程,是生物学中非常重要的一个过程。
8. 基因敲除:指通过基因工程技术,去除目标基因的表达,以达到特定目的的过程。
9. 基因修饰:指对目标基因进行修饰,以改变其表达水平、稳定性或活性等特性。
10. 基因转移:指将从父或母物种中获得的DNA片段转移至另一个物种中的过程,通常用于改良植物、动物或微生物的遗传特性。
DNA重组技术在生物学、医学、工程学等领域都有广泛的应用,例如基因编辑、基因敲除、基因修饰、基因转移等。
这些技术的应用可以帮助人们更好地理解生命的基本原理,探究生命的奥秘,推动人类健康和社会进步。
DNA重组技术
第五章DNA重组技术DNA重组技术是指在体外将目的DNA片段与质粒（plasmid）等能够自主复制的载体（vector）连接形成重组DNA分子，再导入合适的受体细胞。
由于重组DNA可以在受体细胞中复制，目的DNA片段同时也可以扩增获得大量拷贝，因此这项技术也被称为分子克隆（molecluar cloning）。
与PCR技术相比，通过分子克隆得到的拷贝错误率更低，并且获得重组DNA的受体细胞可以无限传代，目的片段可以更长久的保存，并能进行筛选、突变、融合、序列分析等一系列基因操作。
此外，如果载体在插入目的基因的区域具有合适的启动子、核糖体结合位点、转录终止子等序列，目的DNA片段所含基因还有可能能在受体细胞中大量表达，获得目的蛋白或其它表达产物。
通过DNA重组技术表达的蛋白又称为重组蛋白。
目前，DNA重组技术在基础研究、基因诊断、生物制药、基因治疗等方面都得到广泛的应用。
第一节DNA重组技术的常用工具酶在DNA重组技术中，需要利用一些酶来对基因进行操作，我们可以把这些酶称为工具酶。
工具酶的用途涵盖DNA重组技术的各个方面，包括目的DNA的获得、DNA的切割、片段的连接等。
一、目的DNA获得相关工具酶在DNA重组技术中，目的DNA的获得有多种方法。
其中通过酶扩增来获得是重要的一类方法，其中需要多种工具酶。
（一）Klenow片段Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，是DNA聚合酶I通过木瓜蛋白酶部分水解得到的大片段，保留了DNA聚合酶I的5’-3’的聚合和3’-5’的核酸外切酶的活性，去除了5’-3’的核酸外切酶活性。
Klenow片段可用于在体外扩增DNA片段。
由于其具有3’-5’的核酸外切酶活性，因此可以校正聚合中可能出现的错误，具有一定的保真性。
但由于其不耐热，聚合活性弱，在体外合成DNA的效率较低，随着PCR技术的发展，Klenow片段的应用已日趋减少。
现主要用于DNA双链末端的补齐和标记操作。
分子生物学中的DNA重组及应用
分子生物学中的DNA重组及应用DNA重组是一种基础的遗传学技术，它使基因重组和基因组重组成为可能。
这一技术被广泛应用于生命科学、医学和农业领域等多个领域，已经成为现代分子生物学中不可或缺的工具。
本文将分析DNA重组的基本原理、操作方法以及应用情况。
1. DNA重组的基本原理DNA重组是指利用基因重组技术，通过改变基因的组合，创造新的DNA分子和有利的表型。
它主要包括两种方法：基因重组和基因组重组。
a. 基因重组基因重组是指将来自不同来源的基因组合成一个新的DNA分子，并通过转化进入宿主细胞。
这种技术可以用于基因克隆、表达和功能研究等领域。
其中最重要的是重组DNA技术，这种技术被广泛应用于延长DNA序列、插入外源DNA片段和生成新的DNA构建等方面。
b. 基因组重组基因组重组是指改变基因组的组合，产生新的基因型并形成新的物种。
这种技术包括杂交和选择育种等方法，可以用于遗传改良、生物多样性的保护和生态系统的修复等领域。
2. DNA重组的技术方法DNA重组的方法主要包含以下几种：a. PCR技术PCR技术是一种基本的DNA重组方法，它通过进行一系列的DNA扩增，从而获得足够数量的特定DNA片段。
这种技术被广泛用于DNA分子克隆、序列分析和基因组重组等研究领域。
b. 限制酶切割限制酶碎片可以切开DNA分子，产生一些长度不同的DNA片段。
这种技术也可以被用于DNA克隆、序列测定和高通量的DNA测序等研究领域。
c. 贴端连接贴端连接是指在DNA分子的末端接上一些外源DNA片段，进而产生新的DNA结构。
这种技术常用于克隆和突变基因以及插入外源DNA片段等领域。
3. DNA重组在生命科学、医学和农业等领域中的应用DNA重组技术被广泛应用于生命科学、医学和农业等诸多领域。
a. 生命科学在生命科学研究中，DNA重组技术可以用于基因的功能分析、生物染色体结构和功能分析、DNA库构建和高通量测序等领域。
其中，高通量测序技术已经成为基因组学研究的一项基本技术，提供了基因组序列测序的高通量方法。
DNA的重组
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大肠杆菌重组的分子基础
• 在分子水平上，重组事件发生的先后顺序是相似
• 同源性重组最主要特征是相关的酶可以利用任 何一对同源序列为底物。
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• 真核生物减数分裂时的染色体之间的交换， 某些低等真核生物及细菌的转化、转导、 接合，噬菌体的整合等都属于同源性重组 这一类型。 • 在整个基因组中，同源重组的频率并不恒 定，并且跟染色体的结构有关。例如在异 染色体附近遗传物质的交换要受到抑制。
单链的断裂，从而引发重组。
• 两个断裂单链的游离端彼此交换，形成两个异源
双链，然后末端连接形成Holliday连接体
（Holliday Junction）。
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• 一旦Holliday连接体形成后，它能进行重排从 而改变链的彼此关系。这种重排称为异构化， 因为在此过程中没有键的割裂。 • 一旦形成Holliday连接体后，就能被拆分。是
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DNA重组能迅速增加群体的遗传多样 性，通过优化组合积累有利突变，推动生 物进化。此外，DNA重组还参与DNA损伤
修复，某些基因表达的调控等重要的生物
学过程。
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根据不同的机制，可将重组分成4类：
• 同源性重组（homologous recombination）
• 位点特异性重组（site-specific recombination） • 异常重组（illegitimate recombination) • 转座重组（transposition recombination）
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• D环在DNA聚合酶的作用下修补而扩展，直至D
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（a）切点位置相同 ） Bam HⅠ Ⅰ GGATCC CCTAGG G +GATCC CCTAG G
BstⅠ Ⅰ GGATCC CCTAGG GATCC G + G CCTAG
（b）切点位置不相同 ） XmaⅠ Ⅰ CCCGGG GGGCCC C +CCGGG GGGCC C
SmaⅠ Ⅰ CCCGGG GGGCCC CCC GGG
溶源周期 溶菌周期 • 提取λDNA的原理： 先将溶源菌培养至一定密度，通过热诱导，使 λDNA从宿主染色体DNA上释放出来，再经过溶菌周 期培养，获得大量λ噬菌体，从中提取线形的λDNA。 • 提取过程：
①溶源菌诱导培养 ②分离λ噬菌体 ③λDNA的提取
SDS法制备植物基因组 法制备植物基因组DNA 法制备植物基因组
3 、分离和抽提DNA 、分离和抽提DNA
• 提取总DNA：在裂解液中加适量酚／氯仿／异戊醇或氯仿／异
戊醇等有机溶液，使DNA与蛋白质分开，用乙醇或异丙醇沉淀 DNA，再离心。 • 提取叶绿体或线粒体等细胞器DNA以及病毒和噬菌体
的DNA：须先从裂解液中分离完整细胞器、病毒和噬菌体，抽
提前必须经DNase处理，水解附着于其表面的其它DNA。
（三）DNA的纯化 DNA的纯化
1、氯化铯－溴化乙锭连续梯度离心法 氯化铯－ 2、离子交换层析法 3、琼脂糖凝胶电泳洗脱法 基因纯” 4 、“基因纯”试剂纯化 5、从DNA样品中去掉EB DNA样品中去掉EB 样品中去掉 6、乙醇沉淀法
三、工具酶和DNA片段化
工具酶： 工具酶： 基因工程技术中能用于DNA 基因工程技术中能用于DNA 的合成、连接、 和RNA 的合成、连接、切割和修 饰的各种酶。 饰的各种酶。 包 括： 限制酶、核酸酶、聚合酶、 限制酶、核酸酶、聚合酶、连 接酶、激酶、 接酶、激酶、磷酸酶
碱裂解法*原理： 碱裂解法 原理： 原理
根据共价闭合环状质粒DNA与染色体 与染色体DNA在拓扑学上的差异来分 根据共价闭合环状质粒 与染色体 在拓扑学上的差异来分 离它们。 值介于12.0 ~12.5这个狭窄的范围内，线性的 这个狭窄的范围内， 离它们。在pH值介于 值介于 这个狭窄的范围内 线性的DNA双螺 双螺 旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢 旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒 的氢 键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。 键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。 当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复 至中性时，共价闭合环状的 的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时 当加入 的乙酸钾高盐缓冲液恢复 至中性时， 质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性 的两条互补链仍保持在一起， 质粒 的两条互补链仍保持在一起 因此复性迅速而准确， 的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而 的两条互补链彼此已完全分开， 的染色体 的两条互补链彼此已完全分开 准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大 准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体 与不稳定的大 分子RNA，蛋白质 复合物等一起沉淀下来而被除去。 分子 ，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 复合物等一起沉淀下来而被除去
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
BglⅡ BglⅡ AGATCT TCTAGA
G + GATCC CCTAG G
A +GATCT A TCTAG
同裂酶（ 同裂酶（isoschizomer） ）
有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列， 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这 类酶特称为同裂酶 同裂酶的切点位置可相同或不同。 同裂酶。 类酶特称为同裂酶。同裂酶的切点位置可相同或不同。
（一） 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
1.限制酶系统分类和命名 年后大量限制酶被发现， 1985年后大量限制酶被发现，已从350多种微 多种限制酶， 生物中发现2000多种限制酶，识别108种不同的特 定序列。 定序列。 限制性内切酶的分类: 特异识别、 Ⅰ型: 特异识别、随机切割 特异识别、 Ⅱ型: 特异识别、同点切割 特异识别、 Ⅲ型: 特异识别、异地切割 通常所指的限制酶即Ⅱ 通常所指的限制酶即Ⅱ类酶
5. 限制性核酸内切酶反应系统 反应系统包括： 底物、反应缓冲液、 反应系统包括：酶、底物、反应缓冲液、 合适的反应温度等 合适的反应温度等。
底物DNA 底物
限制酶的催化效率与DNA样品纯度、DNA分子 限制酶的催化效率与 样品纯度、 分子 样品纯度 构型、 构型、识别序列两侧序列长短以及序列碱基甲基化等 密切相关。 密切相关。
–酶活性高的用量少，反之则多。 酶活性高的用量少，反之则多。 酶活性高的用量少 –能被高效切割的 能被高效切割的DNA样品用酶量少，反之则多。 样品用酶量少， 能被高效切割的 样品用酶量少 反之则多。 –等量的两种 等量的两种DNA样品，限制酶识别序列密度大的用酶量多，反 样品， 等量的两种 样品 限制酶识别序列密度大的用酶量多， 之则少。 之则少。
3.两种特殊的限制酶：同尾酶和同裂酶
同尾酶（ 同尾酶（isocaudamer） ）
有些限制性内切酶虽然来源各异，识别的靶子序列也各不相同， 有些限制性内切酶虽然来源各异 ， 识别的靶子序列也各不相同 ， 同尾酶。 但切割DNA后，产生相同的粘性末端，这一类限制酶特称为同尾酶。 但切割 后 产生相同的粘性末端，这一类限制酶特称为同尾酶 这两个相同的粘性末端称为配伍未端 配伍未端。 这两个相同的粘性末端称为配伍未端。
+
GGG CCC
4.星号反应 星号反应(Star Activity) 星号反应
某些限制性内切酶在特定条件下， 某些限制性内切酶在特定条件下，可以在不是原来 的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。 ，这种现象称为 活性。 的识别序列处切割 活性 识别专一性下降
eg: EcoRI GAATTC EcoRI* AATT
氯仿 SolI SolII 收集细胞
100µl 200µl 150µl
SolIII 离心,取上清 离心 取上清
70% 醇 dd H2O
离心 上清
2 醇
氯仿:异戊醇 酚:氯仿 异戊醇 氯仿 ( 25 : 24 取 : 1 ) 离 上 心 清 离心 氯仿 取上清
λ噬菌体 噬菌体DNA的提取 噬菌体 的提取
限制性核酸内切酶反应缓冲液
Nacl Tris-HCl Mgcl2 DTT 0, 50, 100mmol/L离子强度 离子强度 pH7.5-8.0 激活因子 保护还原性基因
限制性核酸内切酶反应温度
大多数的最适反应温度是37℃ 大多数的最适反应温度是 ℃，而少数酶的最 适反应温度高于或低于37℃ 适反应温度高于或低于 ℃。
限制酶特性比较
I型 II型 III型 限制与修饰由 同一酶承担 是 否 是 mg++ ATP.mg++.SAM 酶反应辅助因子 ATP.mg++. SAM / 4-6bp回文对称 / 识别位点特性 回文对称 距离>1kb 识别位点中 距3′端24-26bp 切割位点 距离 ′ 克隆工作中用途 无反应的影响因素
温度：一般37 37° 有例外, 25°C,BclI 50° ① 温度：一般37°C，有例外,如：SmaI 25°C,BclI 50°C， 65° TaqI 65°C ②缓冲液：高、中、低盐之分 (NaCl) 缓冲液： ③时间 ④反应体积和甘油浓度：酶<1/10体积 反应体积和甘油浓度： <1/10体积 ⑤DNA纯度与构型： DNA纯度与构型： 纯度与构型
位点偏爱性（ 位点偏爱性（site preferences） ）
近末端的切割： 近末端的切割：
GTTTAAAC 20小时不能切 小时不能切 GGTTTAAACC 20小时，25%切开 小时， 小时 切开 GGGTTTAAACCC 20小时，50%切开 小时， 小时 切开 AGCTTTGTTTAAACGGCGGCCGG 20小时 小时,90%切 小时 切 开 eg: PmeI
• 除RNA：用RNase水解除RNA • 分离抽提 分离抽提DNA最有效的方法：氯化铯梯度离心（氯化铯溶 最有效的方法： 最有效的方法
液中加适量溴化乙锭，紫外灯下DNA带和RNA带都发荧光，但沉 降系数明显不同而聚集于不同的氯化铯密度区）
大肠杆菌源质粒DNA的提取 大肠杆菌源质粒DNA的提取 DNA
有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内。 有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内。
如：Sau3A识别 ： 识别 BamHⅠ识别 ： Ⅰ GATC GGATCC
有的限制酶识别多种核苷酸序列。 有的限制酶识别多种核苷酸序列。
种核苷酸序列： 如：HindⅡ识别 4种核苷酸序列： 5’-CTPyPuAC-3’ Ⅱ 种核苷酸序列 嘧啶碱基C或 ； 嘌呤碱基A或 （Py→嘧啶碱基 或T；Pu →嘌呤碱基 或G ） 嘧啶碱基 嘌呤碱基
2.Ⅱ型限制酶的特性 不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列；
）：如 ＝6个（大多数）：如EcoRⅠ 5’-GAATTC-3’ 个 大多数）： Ⅰ <6个：如AsuⅠ 5’-GGNCC-3’（5个） 个 Ⅰ （ 个
识别序列
MboⅠ 5’-GATC-3’ （4个） Ⅰ 个 >6个：如NotⅠ 5’-GCGGCCGC-3’（8个） 个 Ⅰ （ 个
限制性核酸内切酶用量： 限制性核酸内切酶用量：
• 主要取决于酶本身的催化活性和底物DNA样品 主要取决于酶本身的催化活性和底物 样品 • 酶活性单位（U）：某种限制性核酸内切酶在最适反 应条件下， 所需的酶活性。 应条件下，60 min内完全切割 1µg λDNA所需的酶活性。 内完全切割 所需的酶活性