重组DNA技术
DNA重组技术
MCS——多克隆位点（multiple cloining site， MCS） （1）MCS 是多个限制酶识别的一段DNA顺序， 以便克隆/插入外源基因/DNA片段，与之相关概 念有： （2）多聚接头（polyliker） 有些质粒载体单一 切点少，不能普遍使用。为了扩大使用范围，可 以加一段有许多限制酶识别的单一切点的多聚接 头。 （3）人工接头（linker） 是用若干个bp组成的 dsDNA片段，一般有一个或以上限制酶识别与切 割的顺序。
4、限制性内切酶的类型 限制性内切酶可分为三大类型： • 类型I和类型III ：由于识别位 点并非严格专一，很少被应用。 • 类型II ： 是DNA重组技术最为 常用的工具酶。
类型II 限制性内切酶的特点: • 识别位点严格专一 • 识别序列的碱基数一般为4、6、 8个bp • 识别位点经常是一种回文序列 的DNA
II、沸水浴法 a、菌体浮在含有EDTA的缓冲液中 b、加溶菌酶破细胞壁 c、放入沸水浴中煮40秒 d、离心，用无菌牙签挑去沉淀物 e、乙醇异丙醇沉淀
2、噬菌体载体 • 噬菌体的繁殖方式有两种： ①溶菌性方式（lytic ）： λ DNA先经多次复制合成 许多子代λ DNA，再装配成 许多子代的λ 噬菌体，最 后裂菌，释放出许多新的 λ 噬菌体。
• 稳定性：质粒在宿主细胞 中保持着一定的考贝数 • 寄生性：质粒只能在宿主 的细胞内复制 • 表现型：不同的质粒有不 同的表型，如对抗生素的 抗性等。
复制类型 • 严紧型质粒的复制受到宿主 细胞蛋白质合成的严格控制。
• 松弛型质粒的复制不受宿主 细胞蛋白质合成的严格控制。
（2）质粒DNA的构型 • SC构型:两条核苷酸链均保持着完 整的环形结构，DNA呈现超螺旋。 • oc构型:两条链中只有一条保持着 完整的环形结构，另一条链出现 缺口，称之为开环DNA。 • L构型:DNA的双链均发生断裂而形 成线性分子。
重组dna技术名词解释
重组dna技术名词解释重组DNA技术是一种基因工程技术，也称为基因重组技术或基因工程技术。
它是通过将不同来源的DNA片段进行拆解、重组和重新组装，从而实现对基因组的改造和修饰。
这项技术的出现和发展，为人类研究基因功能、疾病治疗、生物制药、作物改良等领域带来了巨大的变革和突破。
重组DNA技术包括以下几个重要步骤和相关名词：1. DNA提取：从生物体组织或细胞中获得DNA的过程。
可以利用化学方法或机械方法来提取DNA。
2. DNA片段：在重组DNA技术中，DNA通常被切割成较小的片段，以便进行进一步的操作。
这些片段通常由限制性内切酶所切割，生成具有特定序列的片段。
3. PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种在体外扩增DNA序列的方法。
通过选择性提取DNA片段并在合适的条件下进行一系列循环的核酸扩增过程，可以快速地扩增DNA片段。
4. 限制性内切酶：一类能够识别特定DNA序列并在酶切位点上切割DNA的酶。
它们广泛应用于重组DNA技术中，用于切割DNA分子，生成具有限制性内切酶切位点的片段。
5. DNA连接酶：是一类酶，能够通过酶的相关活性将两个DNA分子连接起来，形成一个新的DNA分子。
在重组DNA技术中，DNA连接酶通常与DNA片段一起使用，实现DNA 的重组和重新组装。
6. 基因库：基因库是指以DNA分子形式保留的大量基因信息的储存体系。
它可以是基于细菌或质粒的载体系统，也可以是基于大规模的DNA文库系统。
利用基因库，可以对基因进行检索、扩增和分析。
7. 遗传工程：利用重组DNA技术对生物体进行基因操作，使其获得新的特性或表达更多的有益蛋白质。
遗传工程可以用于农业、医学和工业等领域，以实现对生物体的有目的的改造和利用。
8. 基因敲除：一种通过重组DNA技术将目标基因删除或失活的方法。
通过敲除特定的基因，可以研究和验证其功能，进而深入理解这些基因在生物体中的作用。
重组DNA技术ppt课件
限制性核酸内切酶
切割DNA分子实 质是断开两个核 苷酸之间的磷酸 二酯键。
磷酸二酯键
DNA分子
限制酶的识别序列：
分类 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ （基因工程技术中常用Ⅱ型）
作用 与甲基化酶共同构成细菌的限制修
饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG
mRNA 反转录酶
cDNA 复制
双链cDNA 载体
重组DNA分子 受体菌cDNAAAAA逆转录酶AAAA TTTT
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
SI核酸酶
目录
（二）克隆载体的选择和构建 （三）外源基因与载体的连接
目的基因
限制性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
T4 DNA连接酶 15ºC
载体自连
目的基因 自连
多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
作为基因工程运载体的条件
①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 ②具多种限制酶切点，以便与外源基因连接。 ③具有某些标记基因，便于进行筛选。 ④载体是安全的，不能对受体细胞有害。 ⑤载体DNA分子大小应合适，以便提取和在体外进行 操作。。
常用的载体：质粒
有标记基因的 存在，可用含 氨苄青霉素的 培养基鉴别
4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)
组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶
基因片断 克隆载体
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌
* 从基因组DN带的所 有基因组DNA核苷酸序列不久即将完成。 但要揭示人类4万个基因功能的任务将更为艰巨。
人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因 的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人 类疾病相关基因提供了参照模板。
DNA重组技术
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② 工具酶
DNA重组技术中对DNA的“精雕细刻”主要用酶作 为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多 都用作工具，所以称在核酸及有关研究中像基本 工具一样不可缺少的酶类为工具酶。这类酶包括 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、末 端修饰酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。
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限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
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PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和 量要求低。因此，广泛应用于许多领域。 1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
限制性核酸内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶， 可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀； 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚 合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶； 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且 与电泳技术相结合还可以用于基因组酶切图谱的鉴定 以及法医鉴定等。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 13
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6 重组体的转化及鉴定
转化 转化过程是指将DNA重组体或质粒转到适宜的宿主细 胞中。通过这个过程，使目的基因片段得到大量扩 增、或产生需要的基因表达产物、或使宿主生物具 备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳 定遗传。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对 转化的大肠杆菌进行扩大培养使目的基因大量表达 和积累。通过对表达产物分离纯化便可获得想要的 产品。
重组DNA技术
一、定义
是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一类DNA分子。
克隆载体：用于在宿主细胞中克隆和扩增外源DNA片段。
表达载体：用于在宿主细胞中获得外源基因表达产物。
二、特点
1、具备复制能力。 2、具备一个或多个筛选标志。 3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。 4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多克隆位
• 4.诊断疾病 基因诊断是一种使用DNA分析技术来检测和鉴定出疾病的方法。利用重组DNA技术，可以制造出一 些特定的探针或引物，用于检测和分析DNA序列的异常和变异。例如，肿瘤细胞或乳腺癌细胞中常常伴随着某些基 因的改变，可以利用重组DNA技术制备出一些与变异基因相对应的探针或引物，用于检测和诊断疾病。
ACG-OH TACTTAA-P
P-AATTCGT OH-GCA
-ACGAATTCGT-TGCTTAAGCA
3、DNA聚合酶
具有5`→3`聚合活性、5`→3`外切酶活性、3`→5`外切酶活性。 可用于合成双链cDNA分子或片断连接，探针制备，序列分析等。
4、碱性磷酸酶
去除DNA、RNA、dNTP和NTP 5ˊ端的磷酸根。 （1）5’端标记 （2）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身 连接， 提高重组效率。
2.来源：原核生物
3.分类：根据结构、作用特点不同，分为三类。 Ⅰ型酶、Ⅲ型酶：具有限制切割与甲基化修饰活性，都没有多大的实用价值。 Ⅱ型酶：应用广泛，能在DNA分子内部的特异位点，识别和切割双链DNA，其切割位点 的序列可知、固定。
通常所说的限制性内切酶就是指Ⅱ型酶。
2、DNA连接酶
催化DNA中相邻的5ˊ端磷酸基和3ˊ-OH末端之间形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键。 大肠杆菌连接酶，只能连接粘性末端，T4噬菌体连接酶不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。
重组DNA-分子克隆技术
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
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主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
08
上幸存并形成菌落。
09
标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
02
互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；
dna重组技术名词解释
dna重组技术名词解释
DNA重组技术是指通过将不同来源的DNA分子进行拼接、融合或交换,创造出新的基因或基因组的过程。
以下是与该标题相关的一些名词解释:
1. 重组DNA:指从不同来源的DNA分子中获取的DNA片段,这些DNA片段可以来自于同一物种的不同细胞、不同组织或不同来源。
2. 基因重组:指在基因组中发生的基因组合或序列替换,导致新的基因产生或改变生物的性状。
3. 基因编辑:指使用CRISPR等技术手段,对基因进行精确地剪切、删除、替换等操作,以调节或改变生物的性状。
4. 基因组重组:指不同物种之间的基因组重组,可能导致新物种的产生。
5. 非同源重组:指重组DNA中不同的DNA片段之间的非同源性结合,这种结合可能会导致新的基因产生或改变生物的性状。
6. 同源重组:指两个DNA分子中的相同序列之间的结合,这种结合通常不会导致新的基因产生或改变生物的性状。
7. 基因表达:指DNA信息被转化为蛋白质信息的过程,是生物学中非常重要的一个过程。
8. 基因敲除:指通过基因工程技术,去除目标基因的表达,以达到特定目的的过程。
9. 基因修饰:指对目标基因进行修饰,以改变其表达水平、稳定性或活性等特性。
10. 基因转移:指将从父或母物种中获得的DNA片段转移至另一个物种中的过程,通常用于改良植物、动物或微生物的遗传特性。
DNA重组技术在生物学、医学、工程学等领域都有广泛的应用,例如基因编辑、基因敲除、基因修饰、基因转移等。
这些技术的应用可以帮助人们更好地理解生命的基本原理,探究生命的奥秘,推动人类健康和社会进步。
DNA重组技术
第五章DNA重组技术DNA重组技术是指在体外将目的DNA片段与质粒（plasmid）等能够自主复制的载体（vector）连接形成重组DNA分子，再导入合适的受体细胞。
由于重组DNA可以在受体细胞中复制，目的DNA片段同时也可以扩增获得大量拷贝，因此这项技术也被称为分子克隆（molecluar cloning）。
与PCR技术相比，通过分子克隆得到的拷贝错误率更低，并且获得重组DNA的受体细胞可以无限传代，目的片段可以更长久的保存，并能进行筛选、突变、融合、序列分析等一系列基因操作。
此外，如果载体在插入目的基因的区域具有合适的启动子、核糖体结合位点、转录终止子等序列，目的DNA片段所含基因还有可能能在受体细胞中大量表达，获得目的蛋白或其它表达产物。
通过DNA重组技术表达的蛋白又称为重组蛋白。
目前，DNA重组技术在基础研究、基因诊断、生物制药、基因治疗等方面都得到广泛的应用。
第一节DNA重组技术的常用工具酶在DNA重组技术中，需要利用一些酶来对基因进行操作，我们可以把这些酶称为工具酶。
工具酶的用途涵盖DNA重组技术的各个方面，包括目的DNA的获得、DNA的切割、片段的连接等。
一、目的DNA获得相关工具酶在DNA重组技术中，目的DNA的获得有多种方法。
其中通过酶扩增来获得是重要的一类方法，其中需要多种工具酶。
（一）Klenow片段Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，是DNA聚合酶I通过木瓜蛋白酶部分水解得到的大片段，保留了DNA聚合酶I的5’-3’的聚合和3’-5’的核酸外切酶的活性，去除了5’-3’的核酸外切酶活性。
Klenow片段可用于在体外扩增DNA片段。
由于其具有3’-5’的核酸外切酶活性，因此可以校正聚合中可能出现的错误，具有一定的保真性。
但由于其不耐热，聚合活性弱，在体外合成DNA的效率较低，随着PCR技术的发展，Klenow片段的应用已日趋减少。
现主要用于DNA双链末端的补齐和标记操作。
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Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用特点—— 回文结构(palindrome)
大部分Ⅱ型限制酶能够识别由4个～8个核苷酸组成的特定序列。 Ⅱ型酶识别具有回文结构的核苷酸序列（图2-2）。“回文”意 为顺读和倒读都一样的词语
GGATCC CCTAGG 切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端， 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
G + GATCC CCTAG G
A +GATCT A TCTAG
(三)载体
一.表达载体(expression vector): 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多 肽链而特意设计的载体称为表达载体。 二.克隆载体(Cloning vector): 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设 计的载体称为克隆载体。
第二节 基本原理
重组DNA技术操作的基本过程
（β-Gal）N端的α-肽链，该α-肽与宿主细胞(如E.coli JM109）中F´
因子上的LacZ´△M15基因（α-肽缺陷型）的产物互补，产生完整的、 有活性的β-半乳糖苷酶，分解生色底物（X-gal）形成蓝色菌落。当 外源基因插入MCS后，LacZ´α-肽基因的读码框被破坏，不能合成完 整的β-半乳糖苷酶分解底物X-gal，菌落呈白色。称为“蓝白斑”筛 选。
二、DNA连接酶(基因工程的“缝纫针”) ：
1. T4噬菌体DNA连接酶：两个不同片段双链DNA存在 互补粘性末端（Km=0.6µmol/L)或平末端(Km=50µmol/L)。 DNA连接反应都是由T4DNA连接酶介导 2. 大肠杆菌DNA连接酶:不能催化平末端DNA分子的 连接
三、DNA聚合酶
抑制和调节多 种激素的作用
人体生长激素释放激素(SS) 9升大肠杆菌 培养液 基因工程
从动物脑中提取: 5mg---50万只羊脑
主要内容：
相关概念
– DNA克隆 – 工具酶 – 目的基因 – 基因载体
基本原理
重组DNA技术与医学的关系
第一节、重组DNA技术相关概念 Concept Associated to Recombinant DNA Technology
DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段
反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
一.限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 定义： 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其 周围切割双链DNA的一类内切酶。
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
G + GATCC CCTAG G
分类： Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）
命名：
Hin dⅢ
属 系 株
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶 工程、细胞工程等 基因工程(genetic engineering) —— 实现基因克
隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学 或重组DNA技术(recombination DNA technique)，基因操作 (gene manipulation)、遗传工程(genedc engineering)。
重组DNA技术操作过程可形象归纳为：
分
切 接
分离目的基因 限制酶切目的基因与载体 拼接重组体 转入受体细胞 筛选重组体
转 筛
分
目的基因 基因载体
切 接
重组体
总 体 技 术 路 线
转 筛 表
以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
第二节
重要的工具酶
限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ
第四节
定义
常用载体
载体是携带目的基因进入宿主细胞扩增和表达的工具。具备的条件: ①具有自主复制能力 ②有多个单一限制性内切酶的酶切位点（MCS） ③具有选择性遗传标记 ④分子量小 ⑤拷贝数高（10个～200个/细胞） ⑥具有较高的遗传稳定性。
常用载体:
质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
1.质粒 (plasmid):是细菌内携带的染色体外的小型双链环状DNA，
Hae Ⅱ 5’…PuGCGC▼Py...3’ Kpn Ⅰ 5’…GGTAC▼C...3’ Pst Ⅰ 5’…CTGCA▼G...3’ Sph Ⅰ 5’…GCATG▼C...3’ 切割后产生平末端: Alu Ⅰ 5’…AG▼CT...3’ EcoR Ⅴ 5’…GAT▼ATC...3’ Hae Ⅲ 5’…GG▼CC...3’ Pvu Ⅱ 5’…CAG▼CTG...3’ Sma Ⅰ 5’…CCC▼GGG...3’
能独立进行复制。
特点: 1.分子量相对较小能在细菌内稳定存在，能在宿主细胞内独立自
主复制；有较高的拷贝数。 2.具有一个以上的遗传标志，便于在宿主细胞进行选择。 3.具有多个限制性酶的单一切口，称为多克隆位点。便于外源基因的插入。
常用质粒载体
（一） pBR322质粒：由一系列大肠杆菌质粒DNA
通过重组技术构建成，长度为4.36kb，特点：
重组DNA技术的发展史
1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。 O. T. Avery（1944年）证明，遗传信息的携带者是DNA； J. D. Watson和F. H. C. Crick提出了DNA分子的双螺旋结构模型 （1953年） M. Meselson和F. W. Stahl证实了DNA的半保留复制（1958年） F. H. C. Crick提出遗传信息传递的“中心法则”（1958年） F. Jacob和J. Monod提出了调节基因表达的操纵子模型（1961年） M. W. Nirenberg等人破译了氨基酸的64个遗传密码（1966年） 1972年，P. Berg等率先完成了DNA体外重组(1980年诺贝尔化学奖) 1973年，S. Cohen等进一步实现了重组DNA的转化 1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程 公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。 1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。 1982年，美国食品与药物管理局批准首例基因工程产品--人胰岛素 1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。
第五章
重组DNA技术
重组DNA技术 又称DNA克隆或分子克隆
DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone
1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验:
从S型细菌中分别抽提出DNA、蛋白质和荚膜物质，并把每一种成分同活的R型细菌混 合，悬浮在合成培养液中。结果发现只有DNA组分能够把R型细菌转变成S型细菌
1.大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段): 大 肠杆菌DNA聚合酶I具有三种酶活性。 Klenow片段具有二 种酶活性（去除5’ 3’外切酶活性）。 2. Taq DNA聚合酶: 耐热（75-80℃），分子量65kD, 也具5’ 3’外切酶活性。 反转录酶(RDDP):多功能酶，无3’ 5’DNA外切酶活 性，具有3’ 5’RNA外切酶活性。
（1）含有复制起始点和复制调节信号；
（2）有单个EcoRI酶切位点，可切开插入目的基因；
（3）有抗四环素基因Ter+和抗氨苄青霉素基因 Amp+，便 于重组体细胞的筛选。
（二） pUC系列载体:
由pBR质粒与M13噬菌体构建而成，长度为2.674kb，特点：
①具有更小的分子量和更高的拷贝数。 ② “蓝白斑”筛选: pUC载体中的LacZ´基因可编码β-半乳糖苷酶
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ逆转录酶
T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶
重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶 功 能
限制性核酸内切酶
DNA连接酶
识别特异序列，切割DNA
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 ①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等 ①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基
目的基因的获取
克隆载体的选择和构建 DNA导入受体细胞
外源基因与载体的连接 重组体的筛选
克隆基因的表达
重组DNA技术操作的主要步骤 载体
质粒 噬菌体 病毒
目的基因（外源基因）
基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物
开环载体DNA
限制酶消化
目的基因
转化 体外包装，转染
重组体
连接酶
带重组体的宿主
筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交
Ampr
LacZ´ pUC19 (2 686bp)
Ori
ori
EcoRⅠ SacⅠ KpnⅠ SmaⅠ BamHⅠ XbaⅠ SalⅠ PstⅠ SphⅠ Hind Ⅲ
pUC19质粒载体图