转基因油菜的外源Barstar基因向近缘种的转移研究
转基因甘蓝型油菜向其近缘种的基因漂移研究进展
转基因甘蓝型油菜向其近缘种的基因漂移研究进展
李俊;张春雷;李光明
【期刊名称】《江西农业学报》
【年(卷),期】2009(021)003
【摘要】从甘蓝型油菜的生活周期出发,概述了甘蓝型油菜及其近缘种的开花习性、甘蓝型油菜与其近缘种的杂交亲和性、杂种及其回交后代的育性和适应性,评价了
在中国环境条件下甘蓝型油菜中的外源基因向其近缘种漂移而导致生态风险的可能性.认为在中国环境条件下,转基因甘蓝型油菜向其野生杂草近缘种的基因漂移风险
较小,而如何防止转基因向白菜型油菜(Brassica rapa)和芥菜型油菜(B.juncea)转移应作为中国转基因甘蓝型油菜基因漂移风险控制的关键.
【总页数】7页(P32-37,40)
【作者】李俊;张春雷;李光明
【作者单位】中国农业科学院,油料作物研究所,湖北,武汉,430062;中国农业科学院,油料作物研究所,湖北,武汉,430062;中国农业科学院,油料作物研究所,湖北,武
汉,430062
【正文语种】中文
【中图分类】S565.402
【相关文献】
1.转基因甘蓝型油菜的小孢子培养及转基因的遗传分析 [J], 肖霞;殷家明;林呐;柴
友荣;李加纳
2.抗草甘膦转基因大豆基因漂移的研究Ⅰ大豆风媒介传粉的基因漂移研究 [J], 刘琦;李希臣;刘昭军;李铁;雷勃钧
3.转基因水稻外源基因向近缘种群漂流和渐渗的研究进展 [J], 汤日圣
4.转基因大豆向野生大豆基因漂移研究进展 [J], 刘标;薛堃;刘来盘;周延;韩娟
5.转基因甘蓝型油菜向其近缘种的基因漂移之研究进展 [J], 李俊;张春雷;李光明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
油菜转基因的方法[发明专利]
![油菜转基因的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/e0ccaa228bd63186bcebbcf4.png)
专利名称：油菜转基因的方法
专利类型：发明专利
发明人：刘胜毅,郭学兰,董彩华,刘越英申请号：CN200610018488.6
申请日：20060307
公开号：CN1821415A
公开日：
20060823
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种油菜转基因的方法。
本方法以原位生殖器官(包含花粉管，受精前后的配子和合子)为转基因受体。
在对油菜授粉后的花柱和子房进行细胞学观察的基础上，确定了该方法的转化时间。
在该时间内，削去柱头，滴加外源DNA溶液，使携带外源基因和草胺膦抗性标记基因的DNA转化生殖细胞，通过生长发育，获得转基因的T1代合子(种子)，在T1代幼苗早期用低浓度的除草剂草胺膦进行喷洒筛选，获得转基因阳性油菜植株。
本发明的转基因效率为2～10％，转化通量高，而且成本低廉，工作量小，不存在基因型依赖，不存在转基因植株种子繁殖中的春化和越夏问题，筛选简便，结实率高。
申请人：中国农业科学院油料作物研究所
地址：430062 湖北省武汉市徐东二路二号
国籍：CN
代理机构：武汉宇晨专利事务所
代理人：王敏锋
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转bar基因抗除草剂冬油菜及其基因流研究
转bar基因抗除草剂冬油菜及其基因流研究本研究主要内容是利用目前应用最广泛的农杆菌介导的植物转化方法,以bar基因为目标基因,获得适合我国种植的转基因抗除草剂冬油菜品系,同时对转基因油菜与中国不同类型白菜的人工可交配性、天然异交率与生存适合度进行研究,评价转基因油菜与白菜类亚种及变种的基因流。
以油菜子叶柄和下胚轴为外植体,以双低抗病冬油菜品种“中双7号”为转化受体,转化3批约500个子叶柄和600个下胚轴,获得了46株转基因油菜,其中转化阳性植株为35株,阳性率为76%,转化效率为3.2%。
对抗除草剂油菜后代的不同株系进行拷贝数、表达水平与外源基因整合位置等因素的分析,选取6个包含单拷贝、双拷贝和多拷贝的家系对叶片、茎杆、花、根和种子5个组织进行表达量测定,结果表明拷贝数对表达量没有明显影响,而在不同组织中,叶片和茎中表达较高,种子和根中表达很低；同时全面考察了转基因油菜品系的生长势与生育期、产量相关性状、抗逆性、种子品质性状、种子生活力等方面的特性。
经过对转基因家系T4代的考察,转基因品系在农艺性状、品质及生活力上没有明显改变,生育期和抗逆性方面也变化不大。
通过综合比较最终选取Z7B10、Z7B16和Z7B22三个家系作为环境释放阶段候选品系。
为了获得转基因环境释放阶段品系的特异性检测方法,采用基因组步移PCR方法研究了转基因抗除草剂油菜Z7B10、Z7B16和Z7B22的外源基因插入位点序列特征,并根据此特征建立了这三个品系的转化事件特异性检测方法。
从Z7B10、Z7B16和Z7B22的DNA分别分离到外源基因插入位点的左边界旁侧序列677bp、1100bp和964bp的左边界序列,同时从Z7B22基因组DNA中分离到右边界旁侧序列718bp。
序列检索分析显示以上序列均包含载体序列和基因组序列,表明为真实旁侧序列。
根据分离的三个品系的左右边界旁侧序列,建立了这三个转基因抗除草剂油菜品系的事件特异性定性检测方法,扩增片断大小分别为314bp、259bp和384bp。
油菜遗传转化体系研究进展
１． ４ 。 张 承 妹 ¨ 等 认 为 ，以 根 癌 农 杆 菌 ４４ ％ Ｌ Ａ ４ ４感 染 子 叶 柄 ， 液 浓 度 以 对 数 分 裂 中期 Ｂ ４０ 菌
的下 胚 轴 为 外植 体 有 利 于 芽 的 分化 ， ７ｄ苗 龄 的 甘
转化 受 体 。其再 生方 式 一般是 诱 导脱 分化 产 生愈伤
组织 再 分化成 芽 ， 主要 包 括 种 子 萌 发 ， 培 养 、 培 预 共 养之 后 ， 先诱 导 愈伤 组织 ， 进行 芽 的分化 和 生根 培 再
于下 胚 轴形成 愈 伤组 织 ， 而提 高 愈 伤 组织 的芽 苗 从 分化 频 率 。而 欧 阳 丽 莹 等 以 ４个 甘 蓝 型 黄 籽 油
基因工程 的一个重要 环节是如何将外源基 因导人 受体植物实现遗传转 化。综述油菜 子叶柄 和下胚 轴遗传 转化的 步骤和方法 ， 并分析影 响其转化 效率的因素 ， 同时对 近年发 展起来 的浸 花转化 方法做 简单介绍 ， 对油菜遗传 转 并
化上存在 的问题 进行初步分析与讨论 。
关键词 ： 油菜 ； 遗传 转化 ； 因工程 基
菜 品种 为材料 ， 发现在 萌发 培 养基 中添加 ６一Ｂ Ａ和 Ｎ Ａ对 下胚 轴 的再 生无 明 显 影 响 ，而来 源 于含 生 Ａ
养等 步 骤 。
（ ） 子 萌 发 。先 将 种 子 用 ７ ％ 酒 精 浸 泡 １种 ５ ３ ， 菌 水 冲 洗 ２遍 ， 用 ０ １ Ｈ ｃ 浸 泡 ｌ ０ｓ无 再 ． ％ ｇｌ ５
《湖南农业大学学报》(自然科学版)2006年(第32卷)总目次
烟草科 学
利用 自动化加热排湿设备 改造 传统烤房 …… …………………”……… ………… …… …－ 王亚辉 ，张树 堂，杨雪彪 ，等（） ５ １：２ 密集烘烤过程中烟叶水分和色素含量的动态变化…… ………………… …………………孟可 爱，聂 荣邦， 肖春 生，等（） １４ ２： ４ 自肋烟 不同品种 香气 前体 物降解产物及 品质 的研究………… …… …… ………………………… ………柴家 荣，黄成 江（ ：１９ ２ ４ ） 湖 南烟 区烟 蚜种群变动规 律及其测报技术 ………………………… …… …………………龙建忠 ，陈永年，周志成 ，等（） ５ ２：１４ 烤 烟成 熟进程 中主要化学成分的变化 ………………………… …… …… …………………黎 娟 ，周清明，杨虹琦 ，等（） ４ ３：２ １ 烟 叶面细菌分 离筛选 及其 对烟草赤星病 的拮抗作 用…………………… ………………… 罗 坤 ， 罗 宽， 朱小湘，等（ ：２５ ３ ４ ） 烟用包装材料 中挥 发性有机物 Ｖ Ｃ 的定性 分析………………… ………………………郭紫明，李艳春 ，蒋腊梅 ，等（ ：２ ８ Ｏ ｓ ３ ４ ） 烤 烟新 品种 云烟 ２ １ ０ 的选 育及 其特征特性 ……………………… ……… …………………… …………… 卢秀 萍，李永平（ ：３８ ４ ７ ） 洗刷烟 叶表 面对 烤烟致香物质的影响 ………………………… ……………………………郭 紫明，毛建华 ，李鹏 飞，等（） ８ ４：３ ２ 湖南浏阳烟区气候土壤因素和烟叶质量特点………………………………………………李良勇，谢鹏飞，刘 峰 ，等（） ９ ５：４７ 烟草漂浮育苗旧苗盘残留物 Ｔ ＭＶ带毒检测………………………………………………刘 勇，陈学军，李梅云，等（ ：５２ ５ ０ ） 高效液相色谱 法测定烤烟类胡萝 卜 …………………… …… ……………………………杨虹琦 ，岳 骞 ，黎 娟 ，等（） １ 索 ６：６６ 烤 烟雄性不 育系经济性状 与环境互作 的适 应性 及稳定性…… …………………………… ………………马文 广，李水平（） １ ６：６ ９
转基因油菜研究进展
转基因油菜研究进展摘要油菜的遗传转化研究已日趋成熟，用于转化的目的基因趋于多样化，如品质改良、抗病、抗逆、不育基因等;较常用的筛选标记基因是新霉素磷酸转移酶基因(NPT Ⅱ);目前用于油菜基因转化的方法有根癌农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、激光微束穿刺法、显微注射法和花粉介导法等。
主要从油菜筛选标记及转化方法方面进行综述，并对油菜转基因上存在的问题及前景进行了探讨和展望。
关键词油菜;转化基因;筛选标记;转化方法AbstractHeredity transform research of rape is more and more matcher.Transgenics are tending to persify，as follows:quality reformation，resistant to disease，pests and adverse etc.Selection marker used is NPTⅡ.At present，there are several methods of transformation in rape，including tumefaciens-medidated genetic etc，particle gun，PEG untake，vialaser microbeam puncture and microinjection.The foundation of rape selection marker and transformation methods were mainly summarizes in the paper. The present status of rapeseed genetic transformation were reviewed and the problems and envision for further study were discussed.Key wordsBrassica napus;transgene selection marker;transformation method油菜是世界四大油料作物之一，属十字花科(cruciferae)芸墓属(Brassica)，主要包括甘蓝型油菜(B.napus)、芥菜型油菜(B.Juncea)和白菜型油菜(B.rapa)3个栽培种。
转基因作物简介 bar基因 bt基因
bar基因的目的及作用是什么？我国的转基因农作物综述报告]转基因作物(Genetically Modified Organism Crops，以下简称GMO作物)是现代农业生物技术的产物，是指以分子生物学技术导入基因或基因嵌合体的作物。
它克服了传统育种技术的不确定性，突破不同物种之间的生殖隔离，根据人们的需要，赋予农作物新的特性。
1983年首例GMO作物在美国问世。
1994年，世界上第一种转基因食品——转基因晚熟西红柿正式投放美国市场，开创了GMO作物商业应用的先河。
如今，转基因作物已经成为世界上许多国家研究和争议的热点议题。
各国在加大研究力度的同时，又开展了广泛的争议。
赞同者认为转基因作物在解决目前人类所面临的粮食安全问题上正发挥着巨大作用，是农业生产的一次新革命；而畏惧它的人则认为转基因作物的出现会带来难以预想的食品安全性和生态危机。
但是，不可否认的是，转基因作物已成为普及应用速度最快的农作物改良手段。
笔者将从转基因作物产业化现状、研究进展及存在问题等方面进行简单综述。
1 转基因作物产业化现状自1983年第一例转基因植株问世以来，植物转基因研究迅速发展，各国政府及跨国公司均投入巨额资金从事基因克隆、植物转基因和转基因产品开发研究工作。
特别是近十多年来，国际上获得转基因植株的植物已有超过35个科120多个种，它们主要集中在七大类农作物上，即：大豆、玉米、棉花、油菜、马铃薯、南瓜、西葫芦和木瓜，2004年，转基因大豆种植面积量大，占总面积的60％。
从改良作物的目的性状来看，第一代的转基因作物，主要集中在培育抗除草剂或抗虫作物；第二代的转基因作物，主要集中在培育多抗转基因作物、抗性及品质优良的综合型转基因作物，也即将有相关转基因作物上市。
据美国农业生物技术国际服务组织（ISAAA)提供的最新数据表明，从1996年转基因作物实现商业化种植以来，转基因作物种植面积连续8年保持两位数的百分增长率，转基因作物全球种植面积在1996年(170万hm2)--2004年(8100万hm2)的8年期间增加了47倍。
油菜遗传转化方法的研究进展
油菜遗传转化方法的研究进展涂世伟;郭万里;蒋立希;潘建伟【摘要】It was reviewed the rapeseed explant types, selection markers, transformation methods, the influence factors of regeneration systems and its applications in rapeseed breeding were discussed. It was also mentioned the problems and development in the future of rapeseed transformation. It was found that there were still limitations in the transformation of rapeseeds through the published papers and establishment of transformation system of rapeseeds. Firstly, the process of receptor regeneration was a long period and the frequency of gene transformation was low. Secondly, the introduced gene might be silent and the expression of transferred gene would unstable in the progeny. Thirdly, the scientific evaluation should be made about the bad influence of transgenic rapeseed to human heath and the natural environment. Moreover, more complete law and rule should be made to supervise the environment release of transgenic plants. At the same time, it should meet the needs of people by modifying the trait of rapeseeds. Furthermore, there would be a wide foreground to produce the substitute of energy source by introducing special gene into rapeseed plants.%主要对油菜外植体类型、筛选标记、转化方法、作物改良及其成果进行了综述,并对转基因油菜存在的问题和前景进行了探讨.研究发现,现阶段油菜转基因仍存在局限性,主要表现在:1)转化受体再生周期长,转化过程繁琐,转化效率低;2)外源基因表达不确定,遗传不稳定,基因沉默现象有待解决;3)转基因油菜对人类健康和生态环境可能存在不利影响及不确定性的风险,应进行科学评估,且需建立更完善的相关法律法规.同时,应继续发展及利用油菜转基因以满足人们的需求,特别是利用油菜生产能源替代品——生物柴油,前景广阔.【期刊名称】《浙江师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(035)003【总页数】8页(P338-345)【关键词】油菜;遗传转化;外植体;筛选标记;转化方法【作者】涂世伟;郭万里;蒋立希;潘建伟【作者单位】浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004;浙江大学农业与生物技术学院作物科学研究所,浙江杭州310012;浙江大学农业与生物技术学院作物科学研究所,浙江杭州310012;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004【正文语种】中文【中图分类】Q78;S565.4外植体是用来进行遗传转化的离体受体组织.外植体的选取是实现遗传转化的首要条件之一，适宜的外植体应具备取材方便、再生能力强、遗传稳定等特点.不同的外植体对于油菜遗传转化体系的建立具有很大的差异.1989年，Moloney等［2］首次以子叶柄为外植体成功地将NPTⅡ导入油菜中，发现甘蓝型油菜子叶柄末端切口处的薄壁细胞不但再生能力强(80%)，且易被农杆菌感染和转化，其转化率为55%.近些年，国内外以油菜子叶柄为外植体进行遗传转化已有大量的报道.Maheshwari等［3］优化了子叶柄的转化体系，使其适用于多个油菜品种，得到了较高的转化率.下胚轴也是常用的外植体.文献［4］以油菜下胚轴为外植体，在愈伤诱导期增加7 d的预培养，使再生芽出芽期提前7 d，且芽的再生率高达96.67%.Fry等［5］建立了茎段遗传转化体系.Burbulis等［6］分别以茎段和下胚轴为外植体，研究了不同油菜品种的再生，发现一些品种茎段再生率较下胚轴高25.78% ～85.11%.Dutta 等［7］以油菜叶片为外植体，成功建立了5个油菜栽培品种的基因转化体系.段英姿等［8］认为：以子叶柄、下胚轴为受体，具有操作简单、快速且转化率高(1.5%～55%)等优点，但再生植株易为嵌合体，基因型也可能是杂合的;以原生质体为受体则能得到高度纯合体，但存在原生质体制备复杂、分化难、再生和转化率低等缺点.本实验室选用子叶柄和下胚轴为外植体建立了油菜的遗传转化体系，发现3～5 d苗龄子叶柄和4～6 d下胚轴再生能力最强，取材方便，易分化，下胚轴再生芽的数量比子叶柄多，但下胚轴外植体易褐化且再生苗假阳性高，而子叶柄转化率高，再生时间更短.自Licther［9］首次报道在甘蓝型油菜中进行游离小孢子培养获得再生植株后，小孢子培养技术被广泛应用于油菜转基因.Abdollahi等［10］利用基因枪技术及小孢子培养技术进行油菜基因转化，获得大量的转化苗.由于小孢子本身具有单细胞性和单倍性的双重特点，用它作为转化受体进行外源基因导入，不仅有利于基因表达，还可以加速转基因材料的纯合，从而大大缩短育种年限.至今，通过小孢子培养获得转基因油菜的技术日益成熟，该技术在法国、加拿大等油菜主产国已成为一种常规育种技术.筛选标记的选择在油菜遗传转化中非常重要，使用频率最高的是新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)、潮霉素磷酸转移酶基因(HPTⅡ)、二氢叶酸还原酶基因(DHFR)、乙酰基转移酶基因(Bar)和链霉素磷酸转移酶基因(Spt).Schroder等［11］研究了 4种选择标记基因(NPTⅡ，aadA，Bar和Spt)在甘蓝型油菜转化过程中的筛选效果，发现用aadA(介导对链霉素和壮观霉素的抗性)作为筛选标记的效果最好.文献［12］以aroA-M1突变基因为筛选标记，在含草甘膦的培养基中筛选到转基因苗.Wallbraun等［13］以磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)为筛选标记，证明甘露糖能有效筛选转基因植株.本实验室使用潮霉素与卡那霉素作为筛选标记，发现潮霉素筛选对外植体再生影响不大，筛选效果很好，而卡那霉素则容易使再生苗发白，很难得到抗性苗.随着转基因技术的发展，用于外源基因的遗传转化方法越来越多，大体可分成2类：一是农杆菌介导遗传转化法;另一是外源基因直接导入法，如基因枪法、PEG介导法、电击法、激光微束穿刺法、显微注射法和花粉管通道法.农杆菌(Agrobacterium)是一种革兰氏阴性土壤杆菌，有根癌农杆菌(A.tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizobium)，能够在植物的受伤部位侵染植物细胞，将T-DNA转入植物细胞并整合进植物的基因组，并在植物体内表达外源基因.目前，农杆菌介导法在转基因技术中使用频率最高，是最普遍的油菜转化方法.因为农杆菌介导的转基因方法具备以下优点：不需要专门仪器;宿主范围广，包括大多数双子叶植物和单子叶植物;插入外源基因的片段较大，可达50 kb以上;转化率明显高于其他直接转化方法;外源基因整合到植物基因组上的拷贝数较少，多为单拷贝;整合的外源基因变异小，后代的分离也遵循孟德尔遗传定律.缺点是受宿主范围和菌株特异性等因素的限制［14］.根癌农杆菌和发根农杆菌均已成功用于转化油菜.Metz等［15］和Henzi等［16］用发根农杆菌介导白菜型油菜的转化，发现得到的转化苗出现不正常的表型，如顶端优势下降、叶片起皱、花畸形和可育性下降.根癌农杆菌是现在最理想的遗传转化媒介，但仍有以发根农杆菌介导油菜品质改良的报道.Higgins等［17］利用发根农根菌成功地将1-氨基环丙烷基-1-羧酸(ACC)合成酶基因及氧化酶基因导入油菜，转基因植株表型正常.农杆菌介导的花序浸泡(Floral-dip)转化方法是近年发展起来的一种简便、快速、高效、重复性好、稳定性高的非组织培养转基因体系，它是由真空渗透(Vacuum Infiltration in Planta)转化法简化而来，只需将植株的花序浸泡在农杆菌转化液中几min，然后等种子成熟后即可通过筛选得到转基因的种子.付绍红等［18］用花序浸泡法处理甘蓝型油菜得到了103株卡那霉素抗性植株.文献［19］将此方法进行了改良，在转基因植株收到种子后，用100 mg/L潮霉素浸泡种子24～36 h，再种于蛭石中，一周后即可筛选出转基因植株.文献［20］报道通过花絮浸泡法将拟南芥中克隆的赤霉素2-氧化酶基因(AtGA2ox8)导入甘蓝型油菜，转基因植株表型矮小、主枝增多、荚果变多，且转化株的逆境耐性增强.农杆菌介导的花序浸泡转基因法比农杆菌介导的组培法具有新的优势：1)不需建立烦琐费时的组织培养再生体系，大大简化实验操作，并且可使没有建立再生体系的植物实现外源基因的导入;2)不需要依赖精密仪器和昂贵药品，在人力、物力、财力上投入更小;3)在短期内可以得到大量的转基因植株，且减少变异株的发生机率［21］.然而，该方法的作用机理目前还不是很清楚，并且还只局限于少数植物，其应用的有效性有待于进一步深入研究.文献［22］利用超声波辅助含目的基因的农杆菌转化油菜萌发种子，通过β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色实验和巢式PCR验证，获得转基因植株.对该方法的报道较少，有待进一步重复实验.3.2.1 基因枪法基因枪法是继农杆菌介导转化法之后又一应用十分广泛的遗传转化技术，它是通过高压将包被外源DNA的微小金粒或钨粒高速射入受体细胞或组织，使外源DNA进入植物细胞并整合到植物染色体组中，从而达到稳定遗传和表达的目的.基因枪法最早是由Sanford等［23］提出的，目前在水稻、小麦、玉米、油菜等十几种植物中均有应用.在国内，侯丙凯等［24］通过基因枪法将苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因(Bt)转入油菜，在国际上首次实现了抗虫基因对油菜叶绿体基因组的定点整合.文献［25］利用基因枪法转化油菜子叶柄叶绿体基因组，对T1代转基因植株分析发现，整合的叶绿体基因组其遗传率约为8%，表明油菜可能是一种适合叶绿体遗传转化的作物.文献［10］也有关于基因枪技术用于油菜遗传转化的报道. 3.2.2 PEG 介导法聚乙二醇(PEG)介导法由 Krens等［26］首先建立，其主要原理是借助细胞融合剂诱导原生质体摄取外源DNA.PEG介导法操作简单、处理量大、融合频率高，且不影响再生，基本上已克服了再生植株嵌合体的发生，也不需要昂贵的仪器设备.但是，这种方法需要进行长时间的原生质体培养和处理，无法把握其处理效果，常常形成多元原生质体融合体.Rasmussen等［27］通过PEG介导法将GUS基因导入油菜的原生质体，认为PEG的浓度是影响转化效率的关键因素.Parihar等［28］研究了热击和紫外线对PEG介导的新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)导入甘蓝型油菜的影响，认为低剂量的紫外线可以提高DNA的摄入和外源基因的表达.近年来也有运用这种方法转化油菜原生质体的报道.Nugent等［29］报道用 PEG介导油菜原生质体和细胞核的转化，并对其转化进行了比较.3.2.3 电激法电激法是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电击穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄入.此法最早用于动物细胞的转化，现在植物遗传转化中也广泛使用.电激法是植物遗传转化的一种有效方法，已在悬浮培养细胞、原生质体、组织、花粉、植物胚胎等材料中导入外源基因获得瞬间或稳定表达［30］.Fromm 等［31］首次报道了将电激法应用于植物的转基因.电激法具备操作简单、转化效率高等优点，但需依赖昂贵的仪器，较易造成原生质体的损伤，原生质体的分离和再生较困难，近年来对此方法的报道较少.3.2.4 显微注射法显微注射法是利用显微注射仪将外源基因直接注入到生物的生殖细胞中，从而获得转基因再生植株的一种方法.显微注射法最初主要用于动物细胞外源DNA的导入.Neuhaus等［32］首次报道了利用显微注射法将NPTⅡ基因注入甘蓝型油菜的花粉胚细胞中.但是该方法必须以精细的显微操作技术和细胞低密度培养为基础，并且必须建立固定植物细胞或原生质体的技术，从而导致整个实验过程非常复杂、技术难度大，因此使用率不高.3.2.5 激光微束穿刺法激光微束穿刺法是利用聚焦到微米级的激光微束对组织进行穿刺，引起细胞膜的可逆性穿孔，进而导入外源 DNA的方法.Weber等［33］首先用激光微束穿刺法将荧光酶素基因导入离体油菜的叶绿体中，此后又进一步证实了激光微束可定向地穿透细胞壁和质膜，将外源基因导入细胞和细胞器中.王兰岚等［34］经过多年的探索建立了一套用激光微束向植物细胞导入外源DNA的体系，并在世界上率先得到有分子证据的稳定转化植株.激光微束穿刺法操作简单、受体材料广泛、重复性好、靶向性极强、对细胞损伤小，但转化效率不高、设备复杂、费用较高.3.2.6 花粉管通道法花粉管通道法是利用生殖细胞(花粉)作为载体，结合超声波处理介导外源基因转化的方法.该方法由文献［35］建立并发展起来，成功应用在棉花、高粱、烟草等作物上.杜春芳［36］通过花粉管通道法将GUS基因导入油菜花粉，并证明GUS基因已整合到油菜基因组中.文献［37］利用此方法转化芥菜型油菜得到了抗草甘磷的植株.柴国华等［38］利用花粉管通道法将一个与含油量相关的转录因子WR1的反义序列导入甘蓝型油菜中，经PCR和Southern blot分析，获得了3株转基因植株，通过半定量PCR得出WR1的反义基因成功抑制油菜本身的BnWR1的表达.到目前为止，用于转化油菜的目的基因非常多，其赋予油菜的性质各异.经统计分析，油菜的转化育种主要集中在油菜品质改良、抗性育种和杂交体系中不育系的建立等几个方面.4.1.1 脂肪酸组分的改良油菜脂肪酸主要成分是芥酸、油酸、亚油酸和亚麻酸.近年来对油菜脂肪酸改良的报道主要有：文献［39-40］将脂肪酸延长酶1基因(BnFAE 1)反义表达载体导入油菜，T3代转基因油菜种子芥酸含量下降60.8% ～90.1%，油酸含量大量增加，总脂肪酸含量不变;并利用RNA干扰技术使油菜FAD2基因转录水平显著下降，从而导致转基因油菜 T3代种子中油酸含量增加13.90%～32.20%.Taylor等［41］从小豆蒄中克隆到 3-酮类酰基辅酶合成酶基因(KCS)，在油菜中异源表达，使芥酸含量下降，神经酸含量高达30%，应用于医药及工业生产.Bondaruk等［42］用“猫爪”棕榈酰酰基运送蛋白基因(ACP)转化甘蓝型油菜，使油菜种子中不饱和脂肪和硬脂酸含量增加.芥酸及其衍生物是塑料膜生产行业中重要的可再生原料.Katavic等［43］将拟南芥的FAE1基因和酵母的SLC1-1基因导入甘蓝型油菜，使芥酸含量提高.4.1.2 种子贮藏蛋白的遗传改良通常情况下，油菜种子中油脂和蛋白质占有量分别为40%和20%，种子中的贮藏蛋白主要是napin和cruciferin，分别占种子总蛋白的20%和40% ～50%.文献［44］将编码napin蛋白的反义基因导入油菜品种Westar中，导致其种子中napin含量下降、crucifein含量增加，但蛋白质总量没有变化.Poulsen等［45］将反义 cruciferin基因导入油菜，使cruciferin含量下降、napin含量增加，且赖氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸的含量也增加，从而使蛋白品质大大提高.文献［46］以油菜子叶柄为外植体，通过农杆菌介导，将赖氨酸富含蛋白基因(LRP)导入甘蓝型油菜，油菜种子中赖氨酸含量提高了16.7%.文献［47］将一个裂殖子表面蛋白-1基因(MSP-1)和一个环孢子蛋白基因(CSP)拼接成一个新基因，命名为MLC，在甘蓝型油菜中表达，得到一种约25 kDa的蛋白，经验证重组蛋白可用作医疗诊断的抗原和抗疟疾用疫苗.4.2.1 抗除草剂基因目前用于转化的基因主要为2种：抗草甘磷基因和抗草丁磷基因.草甘磷是目前普遍使用的非选择性除草剂，可控制世界上大多数有害杂草，对动植物无毒性，会很快被土壤微生物分解.美国Monsanto公司将抗草甘磷的EPSP合成酶基因导入油菜，得到抗草甘磷除草剂的油菜，并实现商业化.草丁磷是一种谷酰胺合成酶的抑制剂，抗性基因有2个：一个是克隆自土壤细菌Streptomyces hygrocopicus的BAR基因;另一个是Ghufosinate抗性基因 PAT，来自 S.viridochromogenes，2个基因表达产物有相似的催化能力.加拿大等国已育成了带BAR基因的抗草丁磷油菜新品种，并已开始田间实验［48］.Miki等［49］在拟南芥中克隆出Ahyclroxyacid合成酶基因(AHAS)突变体，将其导入油菜，使油菜具有咪唑基除草剂的抗性.4.2.2 抗病虫害基因近年来对于提高油菜抗病虫害的研究较多.文献［50］将孢子囊和几丁质酶基因导入油菜中，得到的转基因油菜具有很强的抗小菜蛾和核盘菌能力.郑巨云等［51］将苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白基因(Bt)和反枝觅菜凝集素基因(ARA)构建成双价基因表达载体，并将其转化至油菜中，得到抗性小植株.蓝海燕等［52］将β-1，3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因导入油菜，获得转基因油菜植株的抗菌核病的能力明显强于对照.另外，抗黑胫病基因、抗根肿病基因、抗黑腐病基因、抗黑斑病基因等都已得到转基因植株［8］.4.2.3 抗非生物逆境干旱、高低温、重金属、高盐碱、强紫外线等非生物逆境的存在，使植物面临着很大的生存压力，于是人们通过基因改造来使植物具有逆境抗性.文献［53］将拟南芥的液泡Na+/H+反向运输蛋白基因导入油菜中，获得可以在高盐条件下正常生长的转基因油菜，其产量与质量变化不大.文献［54-55］分别将冷诱导基因的转录因子CBF1和抗旱基因COX转入油菜，得到抗寒性和抗旱性提高的转基因材料.Gasic等［56］将拟南芥的植物络合素基因导入到芥菜型油菜中，得到稳定表达的转化株，油菜对镉和锌的抗性增强.文献［57］在油菜中异源表达肌醇多磷酸化激酶基因(ThIPK2)，转基因植株表现为具有较强的抗盐、抗干旱、抗氧化等能力. 通过杂种优势进行油菜育种一直是油菜生产国所重视的.传统的途径是通过细胞质“三系”杂种、细胞核不育杂种、化学杀雄杂种和自交不亲和杂种进行育种.然而，它们都存在一定的局限性.随着分子生物学的迅速发展，通过基因工程技术培育新的杂种生产体系成为了可能.Mariani等［58］首先提出了创造不育系、恢复系及保持系的思路，将编码核糖核酸酶基因barnase置于烟草花药绒毡层特异表达的启动子TA29后，并与BAR基因形成嵌合基因，然后转化油菜，得到雄性不育系;之后又在Bacillus amyloliquefaciens细胞中发现一种核糖核酸酶抑制蛋白BARSTAR，能与BARNASE蛋白高效结合形成稳定的复合物，从而抑制BARNASE的活性，植株可以正常发育成熟的花粉粒，恢复油菜育性，保持系为原来未转基因油菜植株.该杂交生产模式已在加拿大应用于生产.Gupta等［59］将一个α-tubulin：rolB 基因导入油菜，转基因油菜表现为雄性不育.至今，油菜转基因及其应用已取得了长足的进展，油菜转基因体系日臻成熟，但仍存在较多的缺陷和有待解决的问题：1)提高油菜转化体系的稳定性及转化率近年来伴随着转基因技术的快速发展，作为经济作物的油菜，其研究受到关注.研究表明，油菜遗传转化体系的建立主要受以下因素的影响：基因型、受体材料、苗龄、湿度、光照等环境因子及植物激素、抗生素和Ag+离子等.随着对油菜基因转化研究的不断深入，已有越来越多的油菜栽培品种应用于基因的改良，特别是对于油菜转化体系的优化，使油菜遗传转化体系趋向于稳定，特别是农杆菌介导的花絮浸泡方法，不受品种的限制，前景更开阔.2)提高转基因油菜外源基因的表达调控及其遗传稳定性目前导入的外源基因整合到油菜基因组中是随机的，其表达水平、表达部位、表达时间等都存在不确定性.另外，由于外源基因是随机插入的，其在油菜基因组中的拷贝数是不确定的，并且常常会出现外源基因的沉默，或转基因植株为嵌合体(chimera).因此，转基因植株应尽量避免外源基因的沉默和嵌合体的形成.为了更好地优化油菜遗传转化体系，我们仍需对油菜的生长发育分子机理进行深入的研究，使用其本身特定的启动子、优化转化方法等策略来避免这些问题，并提高其遗传稳定性.3)转基因油菜的安全性问题随着基因工程改良作物的增加及其国际性产业化趋势的扩大，转基因作物的安全性已成为全球性的热门话题.首先，转基因油菜环境释放后是否会对其他生物造成危害或影响，如：抗病虫害基因是否也会毒杀一些有益的昆虫和动物?抗除草剂基因是否会使得一些杂草经过环境选择后变成超级杂草或它自身也可能杂草化?其次，转基因油菜环境释放后，由于遗传物质的横向传递，对一些野生物种可能会造成污染，特别是亲源关系很近的植物.浦惠明等［60］研究了转基因抗除草剂油菜对近缘作物的基因漂流，发现对芸苔属黑芥、埃芥、芥菜型油菜、白菜型油菜、甘蓝型油菜的漂移率为0.02% ～3.00%.李键等［61］研究发现转基因油菜的外源Barstar基因向周围非转基因油菜和新疆野生油菜进行转移.宋小玲等［62］研究发现抗草丁磷油菜和抗草甘磷油菜与野芥菜田间隔行种植分别产生0.020%和0.014%的携带抗性基因的F1杂种.Gressel［63］就转基因油菜种子特性表达基因的漂流问题进行了报道.最后，转基因油菜在食用方面是否是安全的?这一系列的问题都需要去解答.总之，自人类获得第一株转基因植物至今20余年时间里，植物基因工程的研究与应用已取得了重大的进展.转基因油菜的研究与生产备受瞩目，特别是随着世界能源和粮食危机愈演愈烈，科学家在努力寻找石油的替代品，生物柴油成为解决这些问题的关键途径之一，而油菜作为最重要的油料作物之一成为制造生物柴油的最佳选择.另外，据中国油粮信息网数据显示，2009年我国油菜籽的播种面积预计为3 070万hm2，产量约占世界总产量的22.5%，提供的菜籽油占全国食用油的40%～45%，油菜在我国国民经济中的地位举足轻重.因此，培育优质高产的油菜新品种势在必行.特别是近年分子生物技术应用于油菜育种，大大加速了油菜育种的进程，在我国已有很多实验室成功建立了油菜遗传转化体系.我们在正确认识和解决油菜转基因问题的同时，要很好地利用转基因油菜的发展潜力.【相关文献】［1］Horsch R，Fry J，Hoffmann N，et al.A simple and general method for transferring genes into plants［J］.Science，1985，227(4691)：1229-1231.［2］Moloney M M，Walker J M，Sharma K K.High efficiency transformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors［J］.Plant Cell Reports，1989，8(4)：238-242.［3］Maheshwari P，Selvaraj G，Kovalchuk I.Optimization of Brassicanapus(canola)explant regeneration for genetic transformation［J］.New 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属、十字花科植物和杂草的基因转移情况． 结果表明， 转基因油菜与周围非转基因油菜和新疆野生油菜杂交能产
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摘 要 ：在人工杂交与田问自然授粉两种条件下，研究了转 Ｂ ｒａ 基因油菜 Ｔ ４ ａｔ ｓｒ ７ ２向非转基因油菜、其他芸薹
维普资讯
第 ３ 卷第 ６ ２ 期
２０ ０ ６年 １ ２月
湖南农业大学学报（ 自然科 学版）
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蓝型、白菜型、芥菜型．可见转基因油菜的外源 Ｂ ｒａ 基因可向周围非转基因油菜和新疆野生油菜进行转移， ａｓｒ ｔ
而很难 向其他 十字 花科植 物或杂草转移 ．
关
键 词 ；转基因油菜；基因转移；杂交；聚合酶链式反应
中图分类号 ：￥６ ． ３ ３ ５５ ０． ４ ５
文 献标识码 ：Ａ
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