实验三、鸡胚细胞的原代培养(改进)
细胞的原代培养实验报告
实验十一细胞的原代培养一、实验目的1、了解细胞体外培养的原理、基本方法。
2、掌握无菌操作方法及注意事项。
3、学习观察体外培养细胞的形态及生长状况。
二、实验原理模仿体内生长环境，使来自机体的细胞、组织、器官能够在人工培养条件下生存、生长、繁殖。
三、实验器材1、纯水设备：纯水仪2、干燥消毒设备：电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、过滤器及0.22 m滤膜；3、超净工作台4、培养设备：普通培养箱、CO2培养箱；5、贮存设备：冰箱、液氮罐6、观察设备：倒置显微镜7、其他设备：天平、离心机、水浴锅等培养主要用品1、培养瓶、皿：以玻璃器皿为主，应选择透明度好、无毒、中性硬度玻璃制品（1）培养瓶（2）培养皿2、血球计数板3、眼科剪、镊；实验材料7－14日龄鸡胚（肝素）抗凝血原代培养材料选择幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养分化程度低的组织比分化高的容易培养肿瘤组织比正常组织容易培养。
实验试剂1、D’Hanks液KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖 1.0g，Na2HPO4•H2O 0.06g，加H2O至1000ml注：Hank’s液可以高压灭菌。
4℃下保存。
2、o．25％胰蛋白酶（D’Hanks液配）3、M199 培养液4、小牛血清5、青、链霉素6、5％NaHCO3、2％碘酒7、75％酒精8、洗液：由重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水按一定比例配制而成四、实验方法与步骤一）培养前的准备工作1、用品清洗与消毒2、溶液配制与消毒（1）培养液、酶、抗生素等生物活性成分需过滤消毒（2）平衡盐等高压蒸汽消毒3、预热溶液4、工作间及超净台消毒：紫外线、消毒液。
5、洗手和着装6、进入无菌室7、关闭超净工作台内的紫外光灯,点燃酒精灯(一切操作均需在酒精灯火焰下进行)将消毒过的所用物品放入超净工作台中组织块培养法培养鸡心肌细胞步骤1、配M199完全培养液：M199基础培养液90％小牛血清10％青霉素100IU/ml链霉素100 g/ml过滤除菌。
鸡胚细胞的原代培养
2.塑料篮子内：无菌袖套
操
1. 2. 3. 4. 5. 6.
作
照egg, 画气室线。 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 台面消毒; 将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中清洗。
标记气室示意图
操
• • • • • •
作
照egg, 画气室线。 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 台面消毒; 将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中用 Hank’s液清洗。
鉴定各种细胞产物的程序。
无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某
种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞 株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需 补加物也不同。
无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶
段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养 基使用时还需添加血清
人间充质干细胞无血清培养基:上海依科赛公司 CHO无血清培养基：维森特公司 树突状细胞无血清培养基：达优公司
肺
肝
腿部 肌肉
肾脏
摘自 《细胞培养基本知识》-Invitrogen
注 意
清理台面,用品洗净,交回。酒பைடு நூலகம்灯和酒精棉球瓶要补 加酒精。 实验报告：这次的原代培养与细胞传代和冻存的实验 一起写一份细胞报告。 重点：要对实验结果进行分析和讨论。 实验考核：本次实验的实验结果记入一次实验课成绩 考核内容。无菌实验操作记入实验考核。
鸡胚细胞的原代培养
摘自 《细胞培养基本知识》-Invitrogen
细胞培养的用途
照片来自 《动物细胞培养-基本技术指南》
提
纲
1.培养基的类型及配制 2.原代培养的过程 3.原代培养的注意事项 4. 本次实验操作要点 5.实践操作
实验三、鸡胚细胞的原代培养
原代培养的概念
原代培养 （primary culture）：也叫初代 培养，指直接从体内取出的细胞、组织 和器官进行的第一次的培养。在首次传 代前的培养可认为是原代培养。原代培 养的细胞生长比较缓慢。
原代培养
• 优点：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未 发生很大变化，在一定程度上能反映体内状 态。在供体来源充分、生物学条件稳定的情 况下，采用原代培养做各种实验，如药物测 试、细胞分化等，效果很好。
• 2．操作前要洗手，进入超净工作台后手要 用75%酒精擦试，试剂瓶等也要擦试。
• 3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用 盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
• 4. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能 暴露过久，以免溶液蒸发。
• 5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐 热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧 灼时间不能太长，并冷却后才能夹取组织， 吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧 焦形成碳膜。
• 二、 培养细胞的生长方式 • 1、贴附生长：必须贴附于支持
物表面才能生长。见于各种实体 瘤细胞 • 2、悬浮生长：于悬浮状态下即 可生长，不需要贴附于支持物表 面。各种造血系统肿瘤细胞
每代贴附生长细胞的生长过程
• 潜伏期 • 对数生长期 • 停止期（平台期）
• 游离期：
• 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也 称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆 球形。
• A.切取合适大小的组织块或者器官，在平 衡盐溶液或者培养液中洗涤，除去血污， 剔除脂肪、被膜结缔组织以及坏死的组 织。可滴加培养液或者平衡盐溶液来保 持湿润；
• B. 将组织块放置于盛有培养液的培养皿中， 剪碎，（接种），组织碎块和培养液一 起移到离心管中，吸去上清液；
C. 加入蛋白酶消化液，密封于37℃消化 ；
实验报告-细胞原代培养实验
细胞生物学实验报告实验三细胞原代培养1引言1.1 实验目的1. 理解细胞原代培养原理。
2. 了解细胞原代培养的应用。
3. 独立进行鼠胚和鸡胚细胞原代培养操作。
4. 巩固无菌操作技术。
1.2 实验原理细胞原代培养：原代培养组织直接从机体获取后，通过组织块长出单层细胞或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，严格意义上的原代培养指在首次传代前的培养，但通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。
2实验仪器、试剂及操作步骤2.1 实验仪器超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒（头）、废液缸、手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶等2.2 实验试剂DMEM培养基、D-Hanks缓冲液、血清、抗生素、胰蛋白酶消化液等2.3 实验材料动物：9至12日龄的鸡胚、15日龄的鼠胚2.4 实验步骤A.鸡胚成纤维细胞的原代培养1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。
2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。
3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。
4.在D-Hanks缓冲液中按1：100的比例加入双抗。
5.取9-12日龄鸡胚，用照蛋器照检，画出气室边界和胎位。
将鸡胚置于鸡卵架上，用酒精棉球擦拭蛋壳。
6.用镊子在鸡蛋气室位置敲一道划痕，然后用镊子小心去除气室部位的蛋壳。
7.换用洁净的无菌镊子揭开膜，取出鸡胚至灭菌的培养皿中，用D-Hanks缓冲液冲洗鸡胚。
8.用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，然后用D-Hanks缓冲液充分洗涤躯干。
9.将躯干置于小平皿盖中，用D-Hanks缓冲液至少洗涤3次，充分弃除红细胞。
10.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。
在胚胎组织块中加入1mL的胎牛血清，用滴管吸取组织块接种到培养瓶内。
在培养瓶中放置10-15个组织块。
11.在培养瓶的另一侧面加入完全培养基，注意不要冲到组织块。
鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞培养鸡胚原代细胞培养细胞是一微小而完整的生命单位，它组成各种生物体并生长、繁殖。
在生命体外，如果提供类似生物体内的环境条件，细胞也能生长繁殖。
要使每个细胞都能从人造环境中获得营养物质，必须将组织块分散成单个细胞。
组织培养法是目前培养病毒应用最广的一种方法，其优点是：一般没有隐性感染，没有免疫抵抗力，便于选择易感细胞，实验条件易于控制，成本便宜，经济适用。
组织培养法多应用于病毒的分离、鉴定、病毒感染细胞的机制、生产疫苗和抗原等。
很多组织，包括鸡胚，各种动物的肾脏组织，人胎羊膜细胞或流产胎儿组织等均可作组织培养的来源。
细胞来源的选择，主要是根据细胞对病毒的敏感性而定。
组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。
原代培养是指将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。
本试验介绍原代细胞的鸡胚成纤维细胞培养方法。
（一）实验目的了解单层细胞培养方法（二）实验材料1、10日龄鸡胚。
2、1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒。
3、无菌组织培养瓶、吸管、滴管、剪子、镊子、超净工作台、CO2培养箱、蒸水器、纯水器（生物级）、滤器、真空泵、高压灭菌锅、培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）。
（三）实验方法1、用碘酒消毒鸡卵气室端外壳，并将鸡胚直立于卵架上。
以镊子将小鸡取出放在无菌培养皿内，去头，爪、内脏和骨骼，用Hanks氏溶液洗2-3次。
2、用小剪在小烧瓶内将鸡胚剪成小块（1～２mm3），加Hankr 氏溶液（约１０ml）冲洗2-3次，静置１～２分钟，用毛细吸管吸去液体，依同法再洗涤２次，将血球充分洗去。
鸡胚实验报告
一、实验目的1. 了解鸡胚的发育过程及形态变化；2. 掌握鸡胚培养的基本操作技能；3. 熟悉鸡胚培养在生物科学研究和医学领域的应用。
二、实验原理鸡胚是一种常用的实验动物模型，其胚胎发育过程与哺乳动物胚胎发育过程具有相似性。
通过观察鸡胚的发育过程，可以了解胚胎发育的规律和机制。
鸡胚培养是生物科学研究和医学领域的重要技术手段，可用于病毒分离、疫苗制备、基因功能研究等。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 新鲜鸡蛋- 生理盐水- 灭菌滤纸- 鸡胚培养液- 培养皿- 显微镜- 培养箱- 计时器2. 实验仪器：- 研钵- 研杵- 灭菌镊子- 灭菌剪刀- 灭菌移液器四、实验步骤1. 鸡胚培养液的准备：- 将生理盐水加入研钵中，用研杵搅拌均匀；- 将生理盐水倒入培养皿中，用灭菌滤纸过滤；- 将过滤后的生理盐水倒入培养瓶中，加入鸡胚培养液，充分混合。
2. 鸡胚的收集：- 将鸡蛋放入温水中浸泡，待鸡蛋表面温度与室温相近；- 将鸡蛋敲碎，取出蛋黄和蛋白，弃去；- 将鸡蛋清加入鸡胚培养液中，搅拌均匀。
3. 鸡胚的接种：- 将鸡胚培养液倒入培养皿中，厚度约1cm；- 将鸡胚放入培养皿中，用灭菌镊子轻轻压平；- 将培养皿放入培养箱中，保持适宜的温度和湿度。
4. 鸡胚的观察：- 每日观察鸡胚的发育情况，记录发育过程；- 利用显微镜观察鸡胚的形态变化，如胚胎细胞分裂、器官形成等。
5. 实验结果分析：- 根据观察结果，分析鸡胚的发育规律和机制；- 结合相关文献，探讨鸡胚培养在生物科学研究和医学领域的应用。
五、实验结果1. 鸡胚发育过程：- 鸡胚在培养过程中，细胞分裂迅速，胚胎逐渐形成；- 随着时间的推移，胚胎细胞分化出不同的器官，如心脏、肝脏、肺等。
2. 鸡胚形态变化：- 通过显微镜观察，可见鸡胚细胞分裂、胚胎形成、器官发育等过程；- 鸡胚的形态变化与相关文献描述相符。
六、实验讨论1. 鸡胚培养在生物科学研究和医学领域的应用：- 鸡胚培养可用于病毒分离和疫苗制备；- 鸡胚培养可用于基因功能研究和疾病模型构建；- 鸡胚培养为研究胚胎发育规律和机制提供了有力工具。
原代细胞培养
鸡胚原代细胞的培养[实验目的]掌握鸡胚原代细胞培养操作的基本程序，观察单层细胞生长情况。
[实验材料]9~10日龄鸡胚，Hank`s液（已含0.5%乳蛋白水解物），0.25%胰蛋白酶，NaHCO，双抗，3牛犊血清，手术剪，眼科镊，培养皿，细胞瓶，三角瓶，玻璃珠（置于三角瓶内），漏斗，纱布（置于漏斗中），30ml注射器，10ml注射器，塞子若干，蛋座，水浴锅。
[实验内容及操作程序]1、配液在Hank`s液中加入青、链霉素，使其含量为青霉素1000IU/ml，链霉素100ug/ml。
胰蛋白酶用含有青链霉素的Hank`s液（简称H液）按1:9比例稀释。
用7.5%NaHCO调整pH至7.2~7.4（玫瑰红色）。
32、取胚及剪碎将胚蛋气室端向上竖直于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，注意不能让蛋壳碎屑掉入气势内，撕破卵膜并揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，用镊子夹住或勾住鸡胚脖子部位，取出胚胎于平皿中。
剪去头部、翅爪及内脏，用H 液洗去体表血液。
用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使其成为约1mm3大小的碎块，用H液小心洗涤2次。
3、消化将洗涤好的胚胎碎块转移入三角瓶中，尽量不要让组织块沾到平皿壁上，按组织块量约3~5倍胰酶，加上瓶塞，37℃水浴约20min左右，每隔5min轻轻摇动1次。
待液体变混而稍稠，中止消化。
4、分散取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后轻轻倒去胰酶，塞好瓶塞，用力振摇三角瓶，以使细胞分散下来。
加入H液，轻轻振荡，待组织块下沉后，通过漏斗中的纱布将H液过滤于细胞瓶中，小心不让组织块一并倒出。
继续用力振摇三角瓶，加H液过滤，重复两次，最后一次连同组织块一起倒入漏斗。
5、加入血清在过滤好的细胞悬液中加入牛犊血清，使血清含量为10%。
塞好瓶塞，轻摇细胞瓶混匀。
6、分装将加入血清的细胞悬液分装至各个细胞瓶中，约占细胞瓶容积的10%左右。
塞紧瓶塞，将细胞瓶横卧，瓶上注明组别、日期，置37℃温箱培养。
4h后细胞可贴附于瓶壁，每隔24h观察一次，24~36h生长成单层细胞，此时可吸取培养液，更换维持液，并接种病毒。
胚的培养实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握胚胎培养的基本原理和操作步骤。
2. 学习在体外条件下模拟胚胎发育过程，观察胚胎的形态变化和生长情况。
3. 探讨不同培养条件对胚胎发育的影响。
二、实验原理胚胎培养是指将受精卵或早期胚胎置于体外的人工培养系统中，模拟体内环境，使其继续发育和生长。
通过胚胎培养，可以研究胚胎发育的规律，筛选优良胚胎，以及进行胚胎基因编辑等。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 受精卵或早期胚胎- 培养基：DMEM/F12、KSR、Hams F12- 胎牛血清（FBS）- 促性腺激素（如hCG）- 透明质酸酶- 胚胎培养皿- 显微镜- CO2培养箱- 移液器- 计时器2. 实验仪器：- 超净工作台- 恒温箱- 高压灭菌器- 电子天平四、实验步骤1. 准备培养基：- 将DMEM/F12、KSR、Hams F12培养基按照说明书比例配制，并加入胎牛血清（FBS）。
- 将培养基在无菌条件下过滤除菌，并分装于培养皿中，备用。
2. 胚胎处理：- 将受精卵或早期胚胎置于超净工作台中，用消毒后的移液器吸取一定量的透明质酸酶，轻轻涂抹在胚胎表面。
- 适当放置一段时间，使透明质酸酶作用于胚胎表面，使其分散成单个细胞。
3. 胚胎培养：- 将处理后的胚胎放入装有培养基的培养皿中，放入CO2培养箱中培养。
- 每天观察胚胎的生长情况，记录胚胎的形态变化和细胞分裂情况。
4. 不同培养条件实验：- 将胚胎分别置于不同浓度的胎牛血清（FBS）培养基中培养，观察胚胎的生长情况。
- 将胚胎置于不同温度、pH值、氧气浓度等条件下培养，观察胚胎的生长情况。
5. 结果记录与分析：- 记录不同培养条件下胚胎的形态变化、细胞分裂情况以及生长速度。
- 对实验结果进行统计分析，探讨不同培养条件对胚胎发育的影响。
五、实验结果1. 正常培养条件下：- 胚胎在正常培养条件下能够正常发育，细胞分裂速度较快，形态变化明显。
2. 不同胎牛血清（FBS）浓度条件下：- 随着胎牛血清（FBS）浓度的增加，胚胎的生长速度和细胞分裂速度逐渐加快。
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细胞培养的优点
1.便于应用物理、化学、生物等外界 因素探索和揭示细胞生命活动的规 律； 2.便于应用各种不同技术方法研究和 观察细胞结构和功能的变化； 3.可以长期研究和观察细胞遗传行为 的改变； 4.可以提供大量生物性状相同的细胞 作为研究对象。
提 纲
1.关于原代培养的概念 2.培养基的类型及配制 3.原代培养的过程 4.原代培养的注意事项 5.本次实验操作要点 6 .实践操作.
• B分散细胞培养 目的——反映了单个细胞的生物学特性 ——对单一细胞类型进行分离和纯化
接种方法： 1. 用吸管吸取一定量的细胞悬液，加入培养 器皿中，加入适量的培养液，封口 2. 恒温培养 3. 观察细胞生长状态，及时更换培养液。
• C悬对培养基不断搅拌或者对培养器皿进行 振荡、旋转而维持细胞的悬浮状态。
6. 将材料转入B再次清洗; 7. A换Hank’s，材料再于A中漂洗; 8. 剪取1/5~1/3的组织,转入小烧杯(10ml) ，剪成 0.5~1mm3碎块。 9. 将碎块倒入三角锥瓶,用1ml胰酶清洗小烧杯, 合入锥瓶,迅速摇匀; 10. 锥瓶加塞,覆口,拿出工作台,于37 ℃水浴锅中 消化5~7分钟(严格)!,中间摇动2~3次; 11. 于超净工作台中加入4~5ml培养基,终止消化. 用吸管充分吹打7~8次; 12. 将细胞悬液用纱布过滤,进入20ml烧杯(凹面!) 用培养基清洗纱布2次,每次3~4ml;
预习下节课内容：细胞的传代培养/冻存 一个总的实验报告,包括上周实验准备工作, 本周的原代培养和传代培养. 要对结果进 行分析。
无血清培养基
1975年，Sato首次成功地无血清培养基培养了垂体 细胞株，近20多年来已报道用了几十种细胞系在无血清 培养基中成功地生长和增殖。 应用领域：在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等 研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞。 主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如 激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。 配制：无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成 分组成。 优点：无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确 性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和
合成培养基中血清的加入量：一般说来．含5％小 牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不 死．但支持细胞生长一般需加 10％血清。 血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清类型：有胎牛血清、新生牛血清、小牛血 清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细 菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟。 血清的消毒：过滤除菌。
13. 分别取2ml ,2ml和3ml细胞悬液接种至三只培 养瓶中(3ml在塑料瓶),补加培养液至总体积 5ml; 14. 培养瓶加塞, 侧面标记。 37 ℃培养. 15. 后天上午来观察细胞,并进行细胞传代.
生长面
含鸡胚鸡蛋示意图
标记气室示意图
培养中的成纤维细胞
注 意
清理台面,用品洗净,交回.
原代培养的概念
原代培养 （primary culture）：从动物机体 取出的进行培养的细胞群。原代培养的 细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代 数后（一般10代以内）停止生长，需要 重新更换培养基。将细胞从一个培养瓶 转移到另外一个培养瓶即称为传代或传 代培养（Passage）。
培养方式
• 组织培养 • 细胞培养 • 器官培养
血清的成分
血清中的成分复杂，至今尚未完全清楚。主要有 以下成分： ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）； ②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤 粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；⑤各种生长因子； ⑥转移蛋白；⑦不明成分。 血清中不仅存在促细胞生长因子，同时也存在细 胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养 基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复 杂血清因子的综合反应。
C. 加入蛋白酶消化液，密封于37℃消化 ；
D. 消化结束后，吸去含酶溶液，加入蛋白 酶抑制剂或者含有血清的培养基，终止 蛋白酶的活性；
E. 用吸管吹打消化液，使单个细胞游离； F. 过滤离心收集单个细胞，以少量的培养 液重新悬浮细胞； G. 用计数板计算细胞密度，调节细胞密度， 接种。
血球计数板计数法原理
鉴定各种细胞产物的程序。
无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某 种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞 株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需 补加物也不同。 无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶 段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养 基使用时还需添加血清
抗 菌 素 的 使 用
实验三、 鸡胚细胞的原代培养
为什么要进行细胞培养
高等生物是由多细胞构成的整体，在整体 条件下要研究单个细胞或某一群细胞在 体内（in vivo）的功能活动是十分困难的。 如果把活细胞拿到体外（in vitro）培养进 行观察和研究，则要方便得多。 高等动植物细胞要求的生存条件极其严格， 稍有不适就要死亡。所以细胞培养技术 （cell culture）就是选用最佳生存条件对 活细胞进行培养和研究的技术。
2.取材和培养材料的制备
• A.切取合适大小的组织块或者器官，在平 衡盐溶液或者培养液中洗涤，除去血污， 剔除脂肪、被膜结缔组织以及坏死的组 织。可滴加培养液或者平衡盐溶液来保 持湿润； • B. 将组织块放置于盛有培养液的培养皿中， 剪碎，（接种），组织碎块和培养液一 起移到离心管中，吸去上清液；
原代培养的注意事项
• 1.培养液 按照细胞生长情况，选择最适合的培养液； 摸索需要补加的成分及添加量； 培养体系的酸碱度； 适当换液。 • 2.培养空间 培养液体与液体上方的空间的体积比为 1:10为宜。液体的高度最好维持在 2-5mm；
本次实验内容
用品器材
1.超净工作台内： 污物缸1个、酒精灯2个、 酒精棉球1瓶、大镊子1把、打火机1个、 5毫升移液器, 1640培养基30毫升(方瓶，2人共用） 、 Hank’s液20毫升（圆瓶，2人共用）； 2.饭盒1个,枪头4支,
3.接种与培养
• A.植块培养 定义：——将组织切割成一定大小的 植块，接种到培养器皿中，加入 培养液进行培养。 目的：——观察植块的组织学生长行为， 使植块细胞迁移并在植块外分裂增 殖，取出植块后得到细胞培养物。
植块培养接种方法
1.用湿润的吸管将植块小心吸取并轻轻吹 出到培养瓶中，按照一定的形式或者间 隔将植块排列好； 2.加入培养基，倒转培养一天； 3.待植块贴壁后，再倒转培养瓶，使植块 浸没在培养液中，继续培养； 4.观察细胞生长情况，按照生长情况更换 培养液。
操
1. 2. 3. 4. 5.
作
照egg,画气室线. egg消毒,台面消毒; 戴无菌袖套.点燃酒精灯，手部消毒。 将egg置于蛋座（气室朝上），外表再次消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 Hank’s液→培养皿A，B。(大镊子夹瓶塞，用 吸管吸取) 6. 小镊撕内膜，挑出鸡胚→ A清洗,剪去头,肝, 腿,翅等。
（二）合 成 培 养 基
概念：是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用 人工方法模拟合成的。目前使用的合成培养基有 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 主要成分: 氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和 其它一些辅助物质。 优点: 标准化生产，组分和含量相对固定，成本低 。 缺点: 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需 要；人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细 胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基(如血 清)。
培 养 基
培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生 长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 （一）天然培养基： 类型：有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚 和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：1.来源受限。 2.成分复杂，影响对某些实验产物的提 取和实验结果的分析。 3.易发生支原体污染
利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一 种常用的细胞计数方法。此法的优点是直观、 快速。将经过适当稀释的细胞悬液放在血球计 数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微 镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的， 所以可以根据在显微镜下观察到的细胞数目来 换算成单位体积内细胞总数目。
取材注意事项
1. 取材要准确； 2. 因“材”制宜进行处理； 3. 保持湿润； 4. 使用锋利的刀剪，防止细胞损伤。 5. 动作快，耗时越少越好，可以使用 低温（4℃）。
培养基的配制
RPMI-1640培养粉 碳酸氢钠 青、链霉素 1袋 2.0 g 各100单位/毫升
加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。调节 pH值至7.2，加血清至终浓度为 10％。
原代培养的过程
取材——培养材料的制备 ——接种——加培养液— 培养
1.取材
1）准备工作： A. 解剖取材器具、用品的清洗、包装、 灭菌 B. 工作台面、工作环境的消毒 C. 操作者本人的消毒：肥皂水刷手， 0.2%新洁尔灭浸泡前臂或者用酒精擦 拭消毒，穿工作衣，戴帽、口罩 D.对实验动物消毒
抗生素的作用：在培养液配制后，培养液内常加 适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。
抗生素的使用量：通常是青霉素和链霉素联合使 用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每 毫升100单位。
庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳 定
完全培养基的组成
• • • • 基础培养基 血清 碳酸氢钠 青、链霉素 80％一95％ 5％一20％ 2.0 g/L 各100单位／毫升