细胞的原代培养(Cell primary culture)
原代细胞培养过程
原代细胞培养过程细胞是生命的基本单位，是构成生物体的基本组成部分。
细胞的研究对于生命科学的发展具有重要的意义。
原代细胞是从组织或器官中分离出来的未经过传代的细胞，具有较高的生物学活性和生物学特性，是细胞学、生物学、医学等领域的重要研究对象。
原代细胞培养是将原代细胞在体外培养的过程，是细胞学研究的重要手段之一。
原代细胞培养的目的原代细胞培养的主要目的是为了研究细胞的生物学特性、生长和分化规律、细胞信号传导、细胞凋亡、细胞周期等方面的问题。
同时，原代细胞培养还可以用于药物筛选、毒性测试、细胞治疗等方面的研究。
原代细胞培养的步骤原代细胞培养的步骤主要包括细胞分离、细胞培养、细胞传代等。
1. 细胞分离细胞分离是将组织或器官中的细胞分离出来的过程。
常用的细胞分离方法有机械分离、酶消化、胶原酶消化等。
其中，酶消化是最常用的方法之一。
酶消化可以使细胞间的胶原纤维、基质等物质被消化，从而使细胞分离出来。
酶消化的时间和酶的浓度需要根据不同的组织和细胞类型进行调整。
2. 细胞培养细胞培养是将分离出来的细胞在体外培养的过程。
细胞培养需要提供适宜的培养基、培养条件和培养器具。
培养基是细胞培养的基础，包括营养物质、生长因子、激素等。
培养条件包括温度、湿度、氧气浓度、CO2浓度等。
培养器具包括培养皿、培养瓶、细胞培养箱等。
3. 细胞传代细胞传代是将原代细胞在体外培养的过程中，将细胞分离并继续培养的过程。
细胞传代的次数越多，细胞的生物学特性和生物学活性就越低。
因此，在进行原代细胞培养时，需要根据实验的需要和细胞的特性来确定细胞传代的次数。
原代细胞培养的注意事项1. 细胞分离时需要注意细胞的完整性和活性，避免对细胞造成损伤。
2. 细胞培养时需要注意培养基的配制和培养条件的控制，避免对细胞造成不良影响。
3. 细胞传代时需要注意细胞的生长状态和细胞的传代次数，避免对细胞造成不可逆的影响。
4. 细胞培养过程中需要注意细胞的无菌性和培养器具的消毒，避免细胞被细菌、真菌等微生物污染。
原代培养
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细胞克隆
• 克隆（clone）: 指单个细胞通过有丝分裂形成的 细胞群体。
• 细胞克隆化培养（cell cloning culture）:指将单 个细胞在一定支持物上（如软琼脂或甲基纤维素） 增殖培养而产生的细胞群落。
• 有均一性
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细胞系（cell line）：原代培养经首次传代成功后即成 细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞谱系所组 成。 有限细胞系（finite cell line）：不能继续传代或传代数 有限 连续细胞系(continuous cell line)：可连续传代，即 “已建成的细胞系”（established cell line）
再用0.25%胰蛋白酶-柠檬酸盐消化液处理 • 用EDTA溶液洗细胞，再用0.25%胰蛋白酶-1mmol/L
EDTA消化细胞 • 用1mmol/L EDTA洗细胞，然后用0.25%胰蛋白酶和
200μ/ml胶原酶，配合柠檬酸盐或EDTA消化细胞 • 机械刮削法 • 在培养液中加入分散酶(0.1mg/ml)或蛋白酶(0.1～
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培养液的更换 培养液的pH值下降 细胞浓度 细胞类型 细胞形态学
视频
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第四节 细胞系与细胞克隆
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组织培养常用术语
原代培养（primary culture）：从直接取 自生物体细胞、组织或器官开始的培养。
传代培养（passage culture）：将细胞从 一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即 称为传代培养。
开蛋壳，玻璃棒挑出鸡胚
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小鼠胚胎的剖取过程（13天 ）
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Байду номын сангаас
组织细胞培养
组织细胞培养概述组织细胞培养一般泛指所有的体外培养，包括组织培养、细胞培养和器官培养。
其中，组织培养（Tissue Culture）指从活体内取出组织，模拟体内生理环境，在体外无菌、适当温度和一定培养条件下，使之生存和生长，并维持其结构和功能的方法。
细胞培养（Cell Culture）则是指离散细胞的培养，这些细胞通过酶学的、机械的或化学方法从来源组织中获得，培养物是单个细胞或细胞群。
器官培养（Organ Culture）是指以器官的原基、器官的一部分或整个器官为培养物，应用与组织培养相似的条件，使培养物保持着体内组织部分或全部组织学特征，在体外生存、生长并保持一定的功能。
组织培养与细胞培养并无严格区别，组织培养可出现细胞单一化现象，即趋向变成单一类型细胞，最终也变成了细胞培养。
细胞在培养过程中的生命活动是互相依存的，呈现着一定的“组织”特性。
（一）体外培养方式的分类体外培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养，又称初代培养（Primary Culture），即对从生物体内取出的细胞、组织和器官进行实效培养的过程，这样的细胞称为原代细胞，通常只能培养10-50代左右即退化死亡。
传代培养（Passage Culture），是指无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶。
原代培养物经首次传代成功后即为细胞系（Cell Line）。
如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line），而已获无限繁殖能力能够持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。
由某一细胞系分离出来的、在性状上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞的亚系（Subline）。
（二）体外培养细胞的分型根据离体细胞在培养皿中生长时是否贴壁，可将体外培养细胞分为贴壁型和悬浮型两类。
1.贴壁型细胞：培养细胞需贴附在支持物上生长，大多数细胞属于此型，也称锚着依赖性细胞（anchorage-dependent cells）。
细胞培养技术_第一讲
消化液
(1) 胰蛋白酶溶液 主要作用是使细胞间的蛋白质水解，从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落
并使细胞游离分散开来 常用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。
(2) EDTA溶液 作用机制是破坏细胞间的连接。 对于一些贴壁特别牢固的细胞，可用EDTA和胰酶的混合液 EDTA溶液的使用浓度为0.02%，配制时应加碱助溶
克隆培养（clone culture）：即将少数细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距 离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。
群体培养（左）和克隆培养（右）
原代培养第4天，成纤维样细胞散布于培养瓶底，个别集 落形成，细胞围绕中心漩涡状排列﹙×100﹚
原代培养第7天，多个集落形成并融合﹙×100﹚
细胞系：500元/每株
菌种准备时间 一般情况CCTCC收到订购人的汇款后的3-4天寄出，每周寄送 二次（周一，周五）。
二、细胞的生长条件 细胞的营养
碳水化合物、氨基酸和脂类三大类 也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素
细胞培养常用液体
水 平衡盐溶液 pH调节液 消化液 抗生素溶液 培养基
近年各种条件已商品化系列化，应用冷冻技术， 各国建立细胞库
我国组织培养的发展
20世纪30年代传入我国。
20世纪50年代起步。
20世纪70年代，成为医学和生物学研究 中普遍应用的手段。
细胞培养的优点
1、活细胞： 能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、 生命活动。
2、可控制： 选择对象：均一性、重复性（类型、性质、阶段） 调节条件：各种因素（物理、化学、生物等因素） 利用方法：研究技术、记录方法
常用培养器皿及清洗消毒
玻璃器皿的清洗 一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏
细胞原代培养、传代培养、冻存和复苏细胞培养是指将生物体内分离出的细胞种植在培养基中，供其生长和繁殖的实验过程。
细胞培养已成为生命科学和医学研究中不可或缺的基础工具。
在细胞培养中，常见的术语有原代培养、传代培养、冻存和复苏。
原代培养原代培养是将从组织中分离出的细胞直接进行培养，即首次培养。
通常将组织切割成小段或分散成单细胞悬液，加入培养基中，使其中的细胞粘附在培养基表面上生长。
原代培养中所得细胞经常受到组织来源、细胞类型和培养条件等因素的影响，因此可能表现出较高的细胞异质性。
传代培养传代培养是将进行了原代培养的细胞进行维持和扩增的过程。
在细胞生长到足够数量时，将细胞分散到更大容量的培养器中，以继续扩增细胞数量。
传代培养次数过多时可能导致细胞老化并失去功能。
在细胞传代培养过程中，注意以下几点：•选择合适的培养基和培养条件；•周期性检测细胞的形态、生长状态和细胞数目；•保持细胞复合度和细胞同型性。
冻存为了保存细胞株，通常会将细胞用特殊培养基和添加剂冻存。
冻存过程中，细胞首先保护在保护剂中，然后在液氮的温度下迅速冷冻，以避免细胞深受冰晶形成的伤害。
冻存后的细胞可保存数年，并可进行后续的实验研究。
## 复苏冻存后，需要将细胞复苏。
推荐以下步骤：•用生长培养基预热，将细胞移植到生长培养基中，尽量使样品在细胞数目、时间和温度上保持一致；•在细胞培养箱中培养，控制CO2浓度（通常为5％）和口袋气体混合在空气中的湿度；•更换完整的生长培养基，加入所需的辅助剂，如血清或其它所需的生长因子。
如上所述，细胞培养是生物学和医学研究中不可或缺的基础工具。
正确地进行细胞培养和细胞处理很重要，因为不同的操作条件将影响最终培养出的细胞的数量和质量。
在实验中进行细胞培养和处理时，应该遵守正式的安全和操作规程。
细胞生物学名词解释
细胞融合：是指两个或两个以上的细胞融合成一个细胞的过程。
细胞融合（cell fusion）或细胞杂交（cell hybridization）：细胞融合与细胞杂交技术-真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交（cell hybridization）。
呼吸链（电子传递链）：线粒体内膜上存在多种酶与辅酶组成的电子传递链，可使还原当量中的氢传递到氧生成水。
细胞周期：细胞从前一次分裂结束开始到下一次分裂完成，称为一个细胞周期。
有丝分裂促进因子(MPF)：调节细胞进出M期所必需的蛋白质激酶，具有广泛的生物功能；通过促进靶蛋白的磷酸化而改变其生理活性。
MPF自身活性随细胞周期的运转而发生周期性变化。
干细胞：机体中未分化的、具有永久细胞分裂潜能、具有不断更新潜能、具有细胞分化潜能的细胞群体。
相当一部分干细胞处于休眠状态。
受体：能够识别和选择结合信号分子并能引起一系列生物学效应的生物大分子奢侈基因：对细胞本身生存无直接影响，却对细胞分化起极为重要作用的基因。
管家基因(House-keeping gene)：维持细胞最基本生命活动所必需的基因，即译制基本生命活动所必需的结构和功能蛋白的基因，与细胞分化关系不大。
细胞全能性：各种分化状态的细胞虽然结构和功能不同，但都保留着与合子同样的基因组，即分化本身仍然有生物个体生长发育所需要的全部遗传信息，这称为细胞的全能性(Totipotency)。
细胞分化(Cell Differentiation) ：同源细胞逐渐变为结构、功能与生化特征相异的细胞过程。
多聚核糖体：是指合成蛋白质时，多个甚至几十个核糖体串联附着在一条mRNA分子上，形成的似念珠状结构。
收缩环：有丝分裂的后、末期，在赤道板质膜下形成的微丝束环（由肌动蛋白和肌球蛋白组成）。
核纤层：核纤层是位于细胞核膜下的纤维蛋白片层或纤维网络，核纤层由1至3种核纤层蛋白多肽组成。
细胞的原代培养与传代培养
细胞的原代培养与传代培养原代培养通过组织块直接长出单层细胞或用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。
原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。
特别是在细胞培养会合时，原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈。
在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。
在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，采用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化等，效果很好。
但应注意，原代培养组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。
即使全为同一类型的细胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍具有异质性，在分析细胞生物学特性时比较困难。
其次，由于供体的个体差异及其他一些原因，细胞群生长效果有时也不一致。
原代培养也是建立各种细胞系（株）必经的阶段。
假如原代培养能够维持几小时甚至更长，即可进行进一步筛选。
有的细胞具有继续增殖能力，有的细胞类型只是存活而不增殖，而另外一些细胞只是在特殊条件下应用而不存活，因而细胞类型的分布将会改变。
在单层培养的情况下，瓶底全部铺满细胞，达到会合以后，对密度有依赖性的细胞则逐渐减少生长，而失去密度依赖敏感性的细胞则生长增加，天然或自发转化的细胞则过度生长。
借助于频繁传代，保持细胞低密度生长，有利于保存细胞的正常表型（如小鼠成纤维细胞）。
而自发转化则倾向于高细胞密度的过度生长。
细胞密度过大，培养基消耗将尽，细胞代谢产物积聚过度，细胞增殖变慢，应进行传代培养。
传代培养原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。
原代培养在首次传代时即为细胞系，能连续培养下去的为连续细胞系；不能连续培养的为有限细胞系。
通常，传代培养是指扩大培养，也就是将一份细胞一分为二或者一分为三进行培养等。
但严格说来，不论稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。
细胞生物学名词解释(期中)
第一章绪论1、细胞生物学（cell biology）：是研究细胞基本生命活动规律的科学，是在显微、亚显微和分子水平上，以研究细胞结构与功能，细胞增殖、分化、衰老与凋亡，细胞信号传递，真核细胞基因表达与调控，细胞起源与进化等为主要内容的一门学科。
2、显微结构（microscopic structure）：在普通光学显微镜中能够观察到的细胞结构，直径大于0.2微米，如细胞的大小及外部形态、染色体、线粒体、中心体、细胞核、核仁等，目前用于研究细胞显微结构的工具有普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜等。
3、亚3、显微结构（submicroscopic structure）：在电子显微镜中能够观察到的细胞分子水平以上的结构，直径小于0.2微米，如内质网膜、核膜、微管、微丝、核糖体等，目前用于亚显微结构研究的工具主要有电子显微镜、偏光显微镜和X线衍射仪等。
4、细胞学（cytology）：研究细胞形态、结构、功能和生活史的科学，细胞学的确立是从Schleiden（1838）和Schwann（1839）的细胞学说的提出开始的，而大部分细胞学的基础知识是在十九世纪七十年代以后得到的。
在这一时期，显微镜的观察技术有了显著的进步，详细地观察到核和其他细胞结构、有丝分裂、染色体的行为、受精时的核融合等，细胞内的渗透压和细胞膜的透性等生理学方面的知识也有了发展。
对于生殖过程中的细胞以及核的行为的研究，对于发展遗传和进化的理论起了很大作用。
5、分子细胞生物学（molecular cell biology）：是细胞的分子生物学，是指在分子水平上探索细胞的基本生命活动规律，主要应用物理的、化学的方法、技术，分析研究细胞各种结构中核酸和蛋白质等大分子的构造、组成的复杂结构、这些结构之间分子的相互作用及遗传性状的表现的控制等。
第二章细胞的统一性与多样性1、细胞（cell）：由膜转围成的、能进行独立繁殖的最小原生质团，是生物体电基本的开矿结构和生理功能单位。
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m: 稀释倍数
实验报告
1.简述体外培养细胞的形态特征。
2.淋巴细胞分离液的作用？ 3.细胞培养获得成功的关键要素是什么？ 4.实验结果：培养后淋巴细胞增加的数量、
提高百分率。
Thanks !
实验试剂：
（1）RPMI 1640 培养液 （2） 小牛血清 （3）肝素钠（180 IU／ml） （4） 青、链霉素 （5） PHA（2 mg/ml） （6） Hank’s液
（7） 5％NaHCO3
（9） 2％碘酒棉球
（8） 1N 盐酸
（10） 75％酒精棉球
（11） 1%台盼蓝
实验步骤
（1） 配培养液：
实验步骤
（7） 结果：培养3天后观察结果。
细胞计数：淋巴细胞增殖情况。
注意事项
1. 过滤消毒
2. 淋巴细胞的分离
3. 洗涤：Hank’s 液、RPMI 1640培养液4 ml
各洗涤一次。
4. 计数：浓度3-5×105个/ml，1 ml /10 ml瓶。
5.培养
原细胞悬液细胞数/ml=n/4×10 000×m n: 4大格中的细胞总数
RPMI 1640基础培养液 80％
小牛血清
肝素（180 IU／ml） PHA（2 mg/ ml） 青、链霉素
20％
3.6 IU/ml 40 g/ml 100 IU/ml 100 g/ml
调pH至6.8－7.2，0.22 m滤膜过滤除菌。
实验步骤
（2）采血：肝素抗凝，静脉采血。 （3）分离淋巴细胞 （4）洗涤淋巴细胞 （5）细胞计数、细胞活力检查 （6）稀释培养
跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳
定，有时难以和其他细胞相区别。
4、多型细胞型：
有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定 的形态，统归于此类。
背景资料
悬浮型：
• 胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这 类细胞容易大量繁殖。 • 见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及 白血病细胞。
背景资料
实验材料：
7－12日龄的鸡胚
实验用品
实验试剂：
（1） M199 培养液
（2） 小牛血清
（3） 青、链霉素 （4 ） Hank’s液 （5） 5％NaHCO3 （6） 2％碘酒 （7） 75％酒精
实验步骤
一、培养前的准备工作
（1） 清洗与消毒 （2） 配制溶液 （3） 预热溶液 （4） 紫外线消毒
实验 十一
细胞的原代培养
(Cell primary culture)
背景资料
原代培养(primary culture)：
从生物体取材进行培养，中途不分割培
养物、不更换培养物的生长器皿。
细胞的生长条件：
① 无菌 ② 温度 ③ pH ④ 渗透压 ⑤ 氧气 ⑥ 营养及生长调节因子
背景资料
成纤维细胞型细胞 上皮型细胞
状况。
实验原理
• 来自机体的细胞、组织、ห้องสมุดไป่ตู้官；
• 类似体内的体外环境；
• 人工培养条件下生存、生长、繁殖。
实验用品
主要仪器：
纯水仪；离心机；CO2培养箱； 电热干燥箱；高压蒸汽消毒锅；过滤器 及0.22 m滤膜； 超净台；眼科剪、镊；培养瓶；青霉素 瓶；平皿；吸管；移液管；血球计数板
实验用品
贴附型
培养细胞的 生长类型 悬浮型
游走型细胞 多形型细胞
背景资料
1、成纤维细胞型：
• 胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形
核，胞质突起，生长时呈放射状。
• 除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起 源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管
内皮等常呈本型状态。
• 培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为
实验用品
主要仪器：
纯水仪、离心机、CO2培养箱、 电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、过滤器 及0.22 m滤膜、 超净台、培养瓶、离心管、吸管、移液 管、血球计数板、一次性注射器
实验用品
实验材料：
（肝素）抗凝血
注射器中吸入0.1 ml 180 IU／ml肝素钠溶
液，鸡翅下静脉采血5 ml。
实验用品
实验步骤
三、植块培养法培养鸡表皮细胞
从鸡胚体表撕取表皮，剪成组织块进行培养。 具体实验操作过程与心肌细胞的培养相同。
注意事项
☞ 严格无菌操作。 ☞ 植块培养时注意黏附，加液量不 可过多或过少，过多，会漂浮；
过少，会干死。
实验步骤
四、观察培养结果
• 培养2－3天，细胞从植块向外迁移，随着培养时
间延长，在植块周围形成一圈细胞——“晕”，称 之为生长晕(growth hallow)。
原代细胞培养的一般方法:
• 植块培养法(explant culture) • 分离(散)细胞培养法
(dissociated cell culture)
一、心肌细胞、表皮细胞的培养
二、淋巴细胞的培养
心肌细胞、表皮细胞的原代培养
实验目的
• 了解细胞体外培养的原理、基本方 法，掌握无菌操作方法及注意事项。 • 学习观察体外培养细胞的形态及生长
成纤维细胞。
背景资料
2、上皮型细胞：
• 细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细 胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，
处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。
• 起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生
物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮
型形态。
背景资料
3、游走细胞型：
呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活
（5） 洗手和着装
（6） 进入无菌室
实验步骤
二、植块培养法培养鸡心肌细胞
（1） 配培养液：
含抗生素的M199基础培养液 小牛血清 9 ml 1 ml
过滤除菌。
实验步骤
（2） 获取心脏：
① ② ③ 消毒鸡蛋 取出鸡胚，Hank’s液洗涤。 取出心脏，Hank’s液清洗。
实验步骤
（3） 处理心脏
① 漂洗心脏，剪成约1 mm3大小的小块。 ② 将组织块排放在培养皿中，贴壁 ③ 培养
淋巴细胞的培养 (Lymphocyte culture)
实验目的
• 学习悬浮细胞的培养方法
• 细胞活力检查
• 悬浮细胞的形态特征观察
实验原理
• 外周血淋巴细胞表面具有有丝分裂原受体， 当在培养液中加入有丝分裂原PHA时，可与 淋巴细胞表面的相应受体结合使其激活，从 而促进淋巴细胞增殖。