第六章毛状根培养
毛状根培养2
毛状根诱导的分子机理
1
发根土壤杆菌识别受伤植 物释放的诱导物（乙酞丁 香酮等酚性物质）
2
发根土壤杆菌识别信号 分子后,向受伤细胞作趋 化性运动,并与宿主细胞 发生粘接。
4
T-DNA基因进人寄主细 胞的细胞核，并整合到核 基因组中,然后在寄主细 胞中表达,从植物的感染 点诱导毛状根.
3
发根土壤杆菌Ri质粒上的 vir区（致病区）基因被 乙酞丁香酮等物质活化, 使Ri质粒上的T-DNA片段 被切割下来并转入植物细 胞,但vir区本身不转入。
2.激素自养性
3.遗传稳定性
4.可塑造性
与中药现代化生产
次生代谢产物的 规模化生产 生产药用植物 的活性成分
成功应用 于工业生 产的例子
药用植物人参、紫草、长春花、甜菜胡萝卜 (Daucuscarota)等植物的毛状根能够通过生 物反应器培养来进行其次生物质的规模化生 产。
展望
优：毛状根培养体系是一种非常有潜力的生产次生代谢物的
因此，如何更好的开发和利用毛状根培育技术，使其能够达
到基础研究和大规模工业化生产的要求还需要进一步探讨
毛状根培养反应器
毛状根培养反应器
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。 毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。 毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。 发根农杆菌中的斑质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中LOGO毛状 Nhomakorabea培养技术
毛状根培养技术
1
毛状根培养技术简介 毛状根诱导培养体系的建立 毛状根培养技术与中药生产 展望
浅谈Ri质粒介导的毛状根技术在获得人参药用成分研究中的应用-论文.doc
浅谈Ri质粒介导的毛状根技术在获得人参药用成分研究中的应用-论文【关键词】人参；,Ri质粒；毛状根【关键词】人参；Ri质粒；毛状根Ri质粒介导的毛状根技术是20世纪80年代后期，在植物细胞培养技术领域中发展起来的一项新技术。
它是将发根农杆菌含有的Ri质粒中的TDNA片段整合到植物细胞的DNA上，诱导出毛状根，从而建立起毛状根培养系统用于次生代谢物的生产［1］。
由于Ri质粒转化的毛状根具有生长快、易于培养、有用成分高、代谢通路表达完整的特点［２］，在利用生物技术生产药用植物有效成分领域，显示出极大的应用潜力和广阔的发展前景。
在利用Ri质粒介导的毛状根技术生产人参皂苷、人参多糖等次生代谢物方面已经做了大量的研究。
本文就该方面的研究作一综述。
1Ri质粒转化形成毛状根的机制［3~7］Ri质粒是位于发根农杆菌染色体之外的独立的双链环状DNA，一般在180～250kb之间，具有2个非常主要的功能区：TDNA区（TransferredDNAregion）和Vir区（virulanceregion）。
农杆碱型Ri质粒上的TDNA是不连续的，分为TLDNA和TR-DNA。
TRDNA上带有编码农杆碱合成酶基因（ags）和生长素合成酶基因（tms1和tms2），后者指导IAA的合成。
发根农杆菌侵染形成毛状根的过程可分为四个步骤：①发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细胞合成一种特殊的小分子化合物，如酚类化合物，从而诱导Ri质粒的Vir区基因群活化；②在Vir基因表达产生的酶的作用下，TDNA被切下；③TDNA转移到植物细胞并整合到植物基因组DNA；④TDNA在植物细胞中得到转录和翻译，发挥其机能，刺激植物细胞形成毛状根。
2Ri质粒介导的毛状根技术在获取人参药用成分研究中的应用众多的学者已经对人参毛状根体系的建立，不同的培养基成分、菌株、诱导子对毛状根生成以及对产生次生物质的影响，人参毛状根生理生化活性，利用人参毛状根合成其他药物成分以及人参毛状根的生物反应器培养等方面进行了大量的工作，为获取人参药物成分的工业化生产奠定了基础。
浅谈毛状根及在药用植物中的应用
3.2获得毛状根转基因植物
以Ri质粒为载体转入外源功能基因，获得药 用植物的转基因植株。 通过转基因技术，一、可以对克隆出的目的 基因进行功能验证；二、导入外源功能基因， 可以改善药用植物的某些特性。 可以产生新的有效物质、提高栽培品种抗病 虫害的能力等。
3.3毛状根再生植株，缩短良种繁育时间
菌株类型
目前采用的发根农杆菌主要有天然农杆碱A4、 ATCC15834、16834、LBA9402及1601、R1000、 R1200等； 黄瓜碱型的2635、2657、2659等； 甘露碱型的 5196、TR101、TR7等；
每一种菌株对不同植物诱导毛状根的能力是 不同的。
预培养时间
外植体经预培养后能够促进细胞分裂；
毛状根再生植株与天然或栽培植株相比，一般具 有叶片皱缩、节间缩短、植株矮化、须根发达等 特点；
主要的药效成分含量高于天然的；
由于毛状根生长迅速，将其根尖切下，便可繁殖 出大量的无性繁殖再生植株，大大缩短了药用植 物的栽培周期。
3.4为药用植物种质保存提供新途径
毛状根具有高度的繁殖潜能，可以制成 人工种子长期保存。 由于带有顶端分生组织或分枝的发根切 段能够再生出整个植株，可以用海藻酸 钠凝胶包裹发根切段制成了人工种子。
4存在的困难与解决方法
第一个困难是由于许多单子叶植物和部分裸 子叶植物对发根农杆菌不敏感，还不能诱导 出毛状根。 第二个困难是部分植物的毛状根有效成分含 量较低或不含有效成分。
对于第一个困难，人们正在通过建立和发 展基因转移技术，来逐步解决。 如PEG法、电击法、微注射法、激光微柬法、 超声波法、基因抢法等。 对于第二个困难，人们正在通过环境因子 调控和培养绿色毛状根等技术来逐步解决。
药用植物器官培养生产次生代谢物的路线图
实验1毛状根诱导和培养
准备工作
• 下周实验前，用YEB活化培养菌株 • 菌株：ＡＴＣＣ１５８３４ harboring
wild type agropine pRiA4b • 培养时间：30h until the OD 600 of
suspension is ca 0.8
THANKS FOR YOUR ATTENTION!
3.4 叶盘法产生毛状根的实验过程
4，需准备的下次实验的材料
• 1.MS固体培养基（不加激素，0.8%琼脂，pH6.0）,每 人4-6瓶（20—30mL果酱瓶）
• 2.MS 液体培养基，每组200mL（稀释活化菌液用） • 3.YEB 液体培养基，pH7. 共2,2升（全班用） • 4.YEB固体500mL（全班用） • 5.无菌水（每人至少4瓶）和空瓶1-2个/人。 • 6.每人无菌吸水纸和牛皮纸各一包（灭菌后供下次用） • 7.接种工具（镊子，手术刀等）包裹灭菌。
实验一， 毛状根的诱导和培养
实验目的
• 1.掌握毛状根产生的原理 • 2.掌握毛状根诱导和培养的方法 • 3.掌握毛状根鉴定的方法
Ri质粒ED C源自G virB AT-DNA
LB RB
Hairy root genes and opine synthase
Ri opine
catabolism
ori
1.毛状根产生的原理
2.毛状根产生过程
• 毛状根形成：
• 菌种活化培养—感 染-吸附到细胞伤 口附近—穿过细胞 壁,膜-质-进入细胞 核内进行插入整合 和表达—形成毛状 根。
3.毛状根的诱导方法
• 1.叶盘法 2.原生质体共培养 3.活体接种法(PPT 演 示)
褐脉少花龙葵毛状根
叶盘法（Horsch et al 1985）
毛状根
发根农杆菌诱导黄瓜毛状根的研究陈佳20072502613华南师范大学生命科学学院广州510630摘要：本实验用发根农杆菌对无菌黄瓜子叶侵染，诱导长出不定根。
并将不定根转入不同卡那霉素浓度的筛选培养基内筛选。
结果表明：MS+Cep500+Kana400的培养基筛选转化根效果最好，嫩根长出的毛状根平均长0.8cm，能明显看到黄瓜毛状根生长。
但总体上讲，黄瓜子叶的转化率并不高。
关键词：发根农杆菌；黄瓜；毛状根；卡那霉素Study on Inducing Cucumber Hairy Roots by AgrobacteriumRhizogenesChen Jia 20072502613College of Life Sciences of South China Normal University, Guangzhou, 510630 Abstract:The cucumber cotyledons were infected respectively by agrobacterium rhizogenes R160 and induced to grow adventitious roots. The results showed that the medium contain 400mg/L kanamycin have the best effect on screening the transformated one .It’s obvious that some hairy roots have growed and the average length is 0.8cm. Generally speaking, the conversion ratio is not high. Key word: Agrobacterium rhizogenes; Cucumber; Hairy Loot; Kanamycin含有Ri质粒的发根农杆菌对植物的侵染也是自然界存在的天然植物遗传转化系统。
第六章毛状根培养
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。 毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。 毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。 发根农杆菌中的Ri质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中
2.激素自养性
毛状根的培养方法
具体培养方法
固体培养
•
成批培养 连续培养
液体培养法
两相培养法
•
•
大规模发酵培养
毛状根的筛选与鉴定
筛选：选择生长速度较快、分枝较多的毛状根 株系进行扩大培养 鉴定：
形态学水平：激素自养，根丛生，多分枝
多根毛，无向地性 细胞水平：冠瘿碱的测定 （硝酸银染色）
，
毛状根培养反应器
利用发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA
整合到植物细胞上,使植物细胞诱导产生 毛状根。
2.毛状根培养体系
除菌
发根农杆菌菌株的筛选及活化
发根农杆菌菌株的类型： 农杆碱型（agropine type） 胭脂碱型 章碱型
农杆菌菌株的筛选及活化
将菌株在液体培养基上培养（含乙酰丁香酮），
激活vir区的基因，为Ri质粒的转移提供先决条件
生物技术，其次级代谢物质的生产能力遗传及生化稳定性增 加生物量的可操作性等特点都引起了人们相当大的兴趣 。 缺：目前的生物反应器还难以满足毛状根大规模培养的要求, 主要限制因素为物质的转移,毛状根生长时易成团,限制了营养 和氧气的进入。 缺：由于目前对农杆菌不同菌株间侵染物种能力的差异机理 还不够了解，并且不同物种间诱导形成毛状根的能力也不同 ，目前为止仅应用于部分的双子叶植物和少部分的单子叶植 物及裸子植物，应用范围较窄。
苦参毛状根及愈伤组织培养研究
苦参毛状根及愈伤组织培养研究苦参毛状根及愈伤组织培养研究植物组织培养技术是一种能够实现植物体外生长和发育的关键技术之一，对于植物根系的研究和利用具有重要意义。
本文将对苦参（Sophora flavescens Ait.）的毛状根及愈伤组织培养研究进行探讨。
苦参是一种草本植物，广泛分布于我国华北、华东、华南和西南等地区。
其根系富含多种生物碱、黄酮类化合物和皂甙等有效成分，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等药理活性，被广泛应用于中药制剂和功能食品中。
毛状根是苦参植物根系生长过程中形成的一种特殊结构，具有未分化的细胞和较高增殖能力。
通过毛状根培养，可以大量繁育苦参植物，并提取其有效成分。
在实验室条件下，以苦参幼苗为材料进行细胞悬浮培养、愈伤组织诱导和愈伤组织分化等步骤，可成功获得愈伤组织。
愈伤组织是在植物组织培养过程中诱导和分化的一种未分化、增殖能力强的细胞群体。
通过愈伤组织培养，可以实现大规模生产苦参有效成分的愈伤组织悬浮培养液，具有较高的药用价值。
同时，愈伤组织还可以作为研究苦参生物合成途径和代谢调控的模型系统，为深入研究苦参药理作用提供了重要工具。
本研究以苦参幼苗为材料，在适当培养基中进行毛状根和愈伤组织培养试验。
实验结果表明，通过调节培养基中植物生长调节剂的浓度和配比，可以有效诱导苦参幼苗形成毛状根和愈伤组织。
并通过显微镜观察和组织切片技术对所培养的毛状根和愈伤组织进行形态学和组织学分析。
进一步的研究发现，愈伤组织呈现出较高的细胞分裂活性和增殖能力，通过增加培养基中激素的浓度，可以进一步促进愈伤组织的增殖。
同时，对培养过程中的营养供给、光照和温度等环境因素进行优化，也对苦参毛状根和愈伤组织的形成和生长起到重要作用。
本研究为深入了解苦参植物根系的发育规律和有效成分的生物合成机制提供了重要依据。
通过组织培养技术，可以实现苦参植物的快速繁育和有效成分的大规模生产，为苦参的利用和开发提供了重要途径。
此外，本研究还为其他草本植物毛状根和愈伤组织培养技术的研究和应用提供了一定的借鉴意义综上所述，本研究通过苦参幼苗的毛状根和愈伤组织培养试验，成功诱导了苦参幼苗形成毛状根和愈伤组织，并对其进行了形态学和组织学分析。
花生毛状根诱导及其体外培养_刘杰
花生毛状根诱导及其体外培养刘杰1，2，任艳2，张宗申1，袁美2*，李双铃2，禹山林2（1．大连工业大学生物工程学院，辽宁大连116034；2．山东省花生研究所，山东青岛266100）摘要［目的］优化花生毛状根诱导条件，为体外培养毛状根生产白藜芦醇以及培养花生根结线虫奠定基础。
［方法］研究不同的发根农杆菌及其菌液浓度、外植体类型、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度对花生毛状根诱导的影响。
［结果］发根农杆菌ACCC10060的毛状根诱导率高于ATCC11325；幼叶外植体的毛状根诱导率高于子叶；最佳侵染菌液浓度为0．2 0．4；最佳共培养时间为2d ；最佳侵染时间为10 15min ；菌液中添加75μmol /L 乙酰丁香酮（AS ）可以提高毛状根诱导率。
通过毛状根能在无激素的MS 培养上自主生长以及毛状根冠瘿碱检测，确定发根农杆菌中Ri 质粒中已整合到花生基因组中。
毛状根体外培养的研究表明，液体培养效果好于固体培养，最佳液体培养基为无激素的MS 培养基。
［结论］该研究建立的花生毛状根培养体系，将为花生转基因技术的完善及利用毛状根生产白藜芦醇和无菌的花生根结线虫提供试验基础。
关键词花生；发根农杆菌；毛状根；体外培养中图分类号S565．2文献标识码A 文章编号0517－6611（2012）06－03229－05Induction and in vitro Culture of Hairy Roots in Peanut （Arachis hypogaea L．）LIU Jie et al （School of Biological Engineering ，Dalian Polytechnic University ，Dalian ，Liaoning 116034）Abstract ［Objective ］To optimize the induction conditions of hairy roots in peanut ，so as to lay foundation for producing resveratrol and thepropagation of root-knot nematode．［Method ］Effects of different Agrobacterium rhizogenes strains ，explants type ，bacteria concentration ，co-culture time ，infection time and AS concertration on the induction of hairy roots in peanuts were studied．［Result ］Agrobacterium rhizogenes ACCC10060had higher induction rate of hairy roots than strains ATCC11325．Leaflet had higher induction rate of hairy roots than cotyledon ，the optimal bacte-ria concentration was 0．2－0．4，the optimal co-culture time was 2d ，the best infection time was 10－15min ，the dose of 75μmol /L acetosyrin-gone （AS ）could improve induction rate of hairy roots．Hairy roots could grow independently on MS medium without hormone ，and presence of o-pines from hairy roots of peanut confirmed that Ri plasmid of Agrobacterium rhizogenes was integrated into the genome of peanut．Hairy roots grewfaster in liquid culture than in solid culture ，and the optimal medium was MS liquid medium without hormone．［Conclusion ］Establishment of hairy roots culture system of peanut provided a foundation for the improvement of peanut transgenic technique ，industrial production of resveratrol and propagation of sterile root-knot nematodes．Key words Arachis hypogaea L．；Agrobacterium rhizogenes ；Hairy roots ；in vitro culture基金项目科技部作物种业科技工程（2011BAD35B04）。
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利用发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA
整合到植物细胞上,使植物细胞诱导产生 毛状根。
2.毛状根培养体系
除菌
发根农杆菌菌株的筛选及活化
发根农杆菌菌株的类型： 农杆碱型（agropine type） 胭脂碱型 章碱型
农杆菌菌株的筛选及活化
将菌株在液体培养基上培养（含乙酰丁香酮），
激活vir区的基因，为Ri质粒的转移提供先决条件
毛状根诱导的分子机理
1
发根土壤杆菌识别受伤植 物释放的诱导物（乙酰丁 香酮等酚性物质）
2
发根土壤杆菌识别信号 分子后,向受伤细胞作趋 化性运动,并与宿主细胞 发生粘接。
4
T-DNA基因进人寄主细 胞的细胞核，并整合到核 基因组中,然后在寄主细 胞中表达,从植物的感染 点诱导毛状根.
3
发根土壤杆菌Ri质粒上的 vir区（致病区）基因被 乙酰丁香酮等物质活化, 使Ri质粒上的T-DNA片段 被切割下来并转入植物细 胞,但vir区本身不转入。
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。 毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。 毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。 发根农杆菌中的Ri质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中
2.激素自养性
1. 毛状根培养技术简介
发根农杆菌 Agrobacterium rhizogenes
发根农杆菌一种侵染性非常广泛的土壤细菌， 革兰氏阴性。发根农杆菌能侵染多种植物,诱发被 感染植物的受伤部位长出毛状根，其特征是迅速增
生、高度分化出大量不定根。
1. 毛状根培养技术简介
发根农杆菌的生物学特性
（1）发根农杆菌能侵染 大多数双子叶植物和少数 单子叶植物 （2）Ri质粒(root inducing plasmid) T－DNA区（转 移区）、Vir区（致病区） 两个功能区
。
受体材料的选择及处理
外植体：植物幼嫩的叶片、茎尖、分生组织等 ；或愈伤组织；或原生质体 外植体处理：在培养基中进行预培养
发根农杆菌感染的方法：
向植物体直接注射 与原生质体共培养
对植物外植体进行接种感染
毛状根的除菌方法
• 抗生素除菌法 抗生素除菌法是将毛状根转移至含有抗生素的 培养基上，经数代转移直到完全无菌为止，常 用的抗菌素有青霉素、头孢霉素等； • 温度除菌法 温度除菌法是将毛状根转移至不含有抗生素的 培养基上，经过39~40℃温度条件处理，再转 移到新培养基上
生物技术，其次级代谢物质的生产能力遗传及生化稳定性增 加生物量的可操作性等特点都引起了人们相当大的兴趣 。 缺：目前的生物反应器还难以满足毛状根大规模培养的要求, 主要限制因素为物质的转移,毛状根生长时易成团,限制了营养 和氧气的进入。 缺：由于目前对农杆菌不同菌株间侵染物种能力的差异机理 还不够了解，并且不同物种间诱导形成毛状根的能力也不同 ，目前为止仅应用于部分的双子叶植物和少部分的单子叶植 物及裸子植物，应用范围较窄。
无菌苗
诱导出的毛状根 进行液体培养
毛状根的诱导过程
无菌植株生长到一定时候,将植株的茎尖、叶片切去,剩
下茎秆和根部,在茎秆上划出伤口,将带Ri质粒的土壤杆 菌接种在伤口处和茎的顶部切口处,接种后继续培养被 感染的植株,经过一段时间（2一4周）的培养后,在接种 部位产生出毛状根。 诱导过程中可通过优化诱导条件，使毛状根生物量增殖 或有效成分含量增多。 要建立起正常的毛状根必须经过除菌以便获得无菌的毛 状根。通常用抗生素除菌即是：将毛状根从母体上切下 后移植到含抗生素的培养基上经数代转移直到完全无菌 为止。
毛状根的培养方法
具体培养方法
固体培养
•
成批培养 连续培养
液体培养法
两相培养法
•
•
大规模发酵培养
毛状根的筛选与鉴定
筛选：选择生长速度较快、分枝较多的毛状根 株系进行扩大培养 鉴定：
形态学水平：激素自养，根丛生，多分枝
多根毛，无向地性 细胞水平：冠瘿碱的测定 （硝酸银染色）
，
毛状根培养反应器
因此，如何更好的开发和利用毛状根培育技术，使其能够达
到基础研究和大规模工业化生产的要求还需要进一步探讨
3.遗传稳定性
4.可塑造性
5.毛状根与中药现代化生产
次生代谢产物 的规模化生产 生产药用植 物的活性成 分
成功应 用于工 业生产 的例子
药用植物人参、紫草、长春花、甜 菜胡萝卜(Daucuscarota)等植物的 毛状根能够通过生物反应器培养来 进行其次生物质的规模化生产。
展望
优：毛状根培养体系是一种非常有潜力的生产次生代谢物的
毛状根培养技术
毛状根培养技术
教学内容
1
毛状根培养技术简介 毛状根诱导培养体系的建立
2
3 3 4
毛状根培养、筛选和鉴定
毛状根培养技术与中药生产
5展望1. 毛状根源自养技术简介毛状根（hairy root）概念
毛状根：植物受伤后，被发根农杆菌感染，在 伤口处就会形成不定根，并产生多个分枝，呈
毛发状；这些不定根又被称为毛状根。
E D C G B A
质粒
LB
Hairy root genes and opine synthase RB
T-DNA
vir
Ri
opine catabolism
ori
1. 毛状根培养技术简介
发根农杆菌Ri质粒
什么是毛状根培养技术 ？
毛状根培养技术是20世纪80年代发展起
来的基因工程和细胞工程相结合的一项 新技术。