毛状根培养2
毛状根培养2
毛状根培养技术
毛状根培养技术
1
毛状根培养技术简介 毛状根诱导培养体系的建立 毛状根培养技术与中药生产 展望
2 3 4
什么是毛状根培养 ？
毛状根是一种多分枝的、生长迅速的不定根，
它是将发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA转 化到植物细胞的T-DNA上,使植物细胞诱导产生 毛状根。
毛状根培养技术是20世纪80年代发展起来的基
生物技术，其次级代谢物质的生产能力遗传及生化稳定性增 加生物量的可操作性等特点都引起了人们相当大的兴趣 。 缺：目前的生物反应器还难以满足毛状根大规模培养的要求, 主要限制因素为物质的转移,毛状根生长时易成团,限制了营养 和氧气的进入。 缺：由于目前对农杆菌不同菌株间侵染物种能力的差异机理 还不够了解，并且不同物种间诱导形成毛状根的能力也不同 ，目前为止仅应用于部分的双子叶植物和少部分的单子叶植 物及裸子植物，应用范围较窄。
毛状根培养反应器
毛状根培养反应器
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。 毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。 毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。 发根农杆菌中的斑质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中
毛状根诱导的分子机理
1
发根土壤杆菌识别受伤植 物释放的诱导物（乙酞丁 香酮等酚性物质）
2
发根土壤杆菌识别信号 分子后,向受伤细胞作趋 化性运动,并与宿主细胞 发生粘接。
4
T-DNA基因进人寄主细 胞的细胞核，并整合到核 基因组中,然后在寄主细 胞中表达,从植物的感染 点诱导毛状根.
3
实验1毛状根诱导和培养
准备工作
• 下周实验前，用YEB活化培养菌株 • 菌株：ＡＴＣＣ１５８３４ harboring
wild type agropine pRiA4b • 培养时间：30h until the OD 600 of
suspension is ca 0.8
THANKS FOR YOUR ATTENTION!
3.4 叶盘法产生毛状根的实验过程
4，需准备的下次实验的材料
• 1.MS固体培养基（不加激素，0.8%琼脂，pH6.0）,每 人4-6瓶（20—30mL果酱瓶）
• 2.MS 液体培养基，每组200mL（稀释活化菌液用） • 3.YEB 液体培养基，pH7. 共2,2升（全班用） • 4.YEB固体500mL（全班用） • 5.无菌水（每人至少4瓶）和空瓶1-2个/人。 • 6.每人无菌吸水纸和牛皮纸各一包（灭菌后供下次用） • 7.接种工具（镊子，手术刀等）包裹灭菌。
实验一， 毛状根的诱导和培养
实验目的
• 1.掌握毛状根产生的原理 • 2.掌握毛状根诱导和培养的方法 • 3.掌握毛状根鉴定的方法
Ri质粒ED C源自G virB AT-DNA
LB RB
Hairy root genes and opine synthase
Ri opine
catabolism
ori
1.毛状根产生的原理
2.毛状根产生过程
• 毛状根形成：
• 菌种活化培养—感 染-吸附到细胞伤 口附近—穿过细胞 壁,膜-质-进入细胞 核内进行插入整合 和表达—形成毛状 根。
3.毛状根的诱导方法
• 1.叶盘法 2.原生质体共培养 3.活体接种法(PPT 演 示)
褐脉少花龙葵毛状根
叶盘法（Horsch et al 1985）
毛状根
发根农杆菌诱导黄瓜毛状根的研究陈佳20072502613华南师范大学生命科学学院广州510630摘要：本实验用发根农杆菌对无菌黄瓜子叶侵染，诱导长出不定根。
并将不定根转入不同卡那霉素浓度的筛选培养基内筛选。
结果表明：MS+Cep500+Kana400的培养基筛选转化根效果最好，嫩根长出的毛状根平均长0.8cm，能明显看到黄瓜毛状根生长。
但总体上讲，黄瓜子叶的转化率并不高。
关键词：发根农杆菌；黄瓜；毛状根；卡那霉素Study on Inducing Cucumber Hairy Roots by AgrobacteriumRhizogenesChen Jia 20072502613College of Life Sciences of South China Normal University, Guangzhou, 510630 Abstract:The cucumber cotyledons were infected respectively by agrobacterium rhizogenes R160 and induced to grow adventitious roots. The results showed that the medium contain 400mg/L kanamycin have the best effect on screening the transformated one .It’s obvious that some hairy roots have growed and the average length is 0.8cm. Generally speaking, the conversion ratio is not high. Key word: Agrobacterium rhizogenes; Cucumber; Hairy Loot; Kanamycin含有Ri质粒的发根农杆菌对植物的侵染也是自然界存在的天然植物遗传转化系统。
第六章毛状根培养
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。 毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。 毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。 发根农杆菌中的Ri质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中
2.激素自养性
毛状根的培养方法
具体培养方法
固体培养
•
成批培养 连续培养
液体培养法
两相培养法
•
•
大规模发酵培养
毛状根的筛选与鉴定
筛选：选择生长速度较快、分枝较多的毛状根 株系进行扩大培养 鉴定：
形态学水平：激素自养，根丛生，多分枝
多根毛，无向地性 细胞水平：冠瘿碱的测定 （硝酸银染色）
，
毛状根培养反应器
利用发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA
整合到植物细胞上,使植物细胞诱导产生 毛状根。
2.毛状根培养体系
除菌
发根农杆菌菌株的筛选及活化
发根农杆菌菌株的类型： 农杆碱型（agropine type） 胭脂碱型 章碱型
农杆菌菌株的筛选及活化
将菌株在液体培养基上培养（含乙酰丁香酮），
激活vir区的基因，为Ri质粒的转移提供先决条件
生物技术，其次级代谢物质的生产能力遗传及生化稳定性增 加生物量的可操作性等特点都引起了人们相当大的兴趣 。 缺：目前的生物反应器还难以满足毛状根大规模培养的要求, 主要限制因素为物质的转移,毛状根生长时易成团,限制了营养 和氧气的进入。 缺：由于目前对农杆菌不同菌株间侵染物种能力的差异机理 还不够了解，并且不同物种间诱导形成毛状根的能力也不同 ，目前为止仅应用于部分的双子叶植物和少部分的单子叶植 物及裸子植物，应用范围较窄。
毛状根实验报告
一、实验目的1. 了解毛状根的生物学特性及生长规律。
2. 掌握毛状根的培养方法及实验操作技能。
3. 探究不同培养基、温度、光照等条件对毛状根生长的影响。
二、实验材料1. 植物材料：紫花苜蓿品种WL-525HQ2. 发根农杆菌：LBA9402、R16013. 培养基：MS培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基4. 药品与试剂：抗生素、温度计、pH计、紫外灯、移液器、培养皿、无菌操作台等三、实验方法1. 发根农杆菌的培养与活化：将发根农杆菌接种于含有抗生素的LB培养基中，37℃恒温培养过夜。
次日，将菌液按1:100的比例稀释，涂布于含有抗生素的LB培养基平板上，37℃恒温培养过夜，获得单菌落。
2. 外植体准备：将紫花苜蓿品种WL-525HQ的茎段剪成1-2cm长，用70%乙醇消毒30秒，无菌水冲洗3次，再用0.1%氯化汞消毒10分钟，无菌水冲洗5次，最后将茎段切成0.5cm长的小段。
3. 毛状根诱导：将外植体接种于含有发根农杆菌的培养基中，置于28℃、光照强度为1500lx的培养箱中培养。
每隔3天更换一次培养基，持续培养30天。
4. 培养基筛选：将诱导出的毛状根分别接种于MS培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基中，观察毛状根的生长情况。
5. 温度、光照条件探究：将毛状根分别置于不同温度（20℃、25℃、30℃）和光照强度（1000lx、1500lx、2000lx）的培养箱中培养，观察毛状根的生长情况。
6. 数据统计与分析：对毛状根的生长情况（长度、直径、分枝数等）进行统计与分析。
四、实验结果1. 发根农杆菌培养结果：在含有抗生素的LB培养基平板上，成功获得单菌落。
2. 外植体诱导结果：接种外植体后，部分外植体在培养基上形成了毛状根。
3. 培养基筛选结果：在1/2MS培养基中，毛状根生长情况最好，长度、直径、分枝数均较高。
4. 温度、光照条件探究结果：在25℃、1500lx条件下，毛状根生长情况最佳。
第六章毛状根培养
到基础研究和大规模工业化生产的要求还需要进一步探讨
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。
2.激素自养性
毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。
3.遗传稳定性 4.可塑造性
毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。
发根农杆菌中的Ri质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中
毛状根培养技术
毛状根培养技术
教学内容
1 毛状根培养技术简介 2 毛状根诱导培养体系的建立
33 毛状根培养、筛选和鉴定
4 毛状根培养技术与中药生产
5
展望
1. 毛状根培养技术简介
毛状根（hairy root）概念
毛状根：植物受伤后，被发根农杆菌感染，在 伤口处就会形成不定根，并产生多个分枝，呈 毛发状；这些不定根又被称为毛状根。
ori
1. 毛状根培养技术简介
发根农杆菌Ri质粒
？什么是毛状根培养技术
➢毛状根培养技术是20世纪80年代发展起
来的基因工程和细胞工程相结合的一项 新技术。
➢利用发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA
整合到植物细胞上,使植物细胞诱导产生 毛状根。
2.毛状根培养体系
除菌
发根农杆菌菌株的筛选及活化
1. 毛状根培养技术简介
发根农杆菌 Agrobacterium rhizogenes
发根农杆菌一种侵染性非常广泛的土壤细菌， 革兰氏阴性。发根农杆菌能侵染多种植物,诱发被 感染植物的受伤部位长出毛状根，其特征是迅速增 生、高度分化出大量不定根。
毛状根培养技术在获得药用植物次生代谢产物中的应用
２０２１ 年 ６ 月
景德镇学院学报
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３６No．
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２０２１
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毛状根培养技术在获得药用植物
次生代谢产物中的应用
司春灿 ①,林 英
(景德镇学院 生物与环境工程学院,江西 景德镇 ３３３４００)
平,相对于正常植物根内次生代谢产物的量,增加量
并不是很大,可以通过正常的根培养来实现,这表明
需要更好的实验设计来进行毛状根的代谢工程.由
于毛状根主要在暗 环 境 下 培 养,一 些 与 光 合 作 用 相
关的代谢产物在发根内的含量并不高.相对于只需
要一到几天就能繁 殖 一 代 的 微 生 物 而 言,某 些 毛 状
状根技术对药用植物进行改良也是近些年的发展趋
势之一,主要有以下几种方式:
２．
２．
１ 毛状根再生植株
植物 被 发 根 农 杆 菌 侵 染 后 产 生 毛 状 根,通 过 添
养条件下,皂苷的产量显著提高 [１２].
２．
３ 毛状根与微生物共生产生次生代谢产物
微生物能够促进药用植物毛状根次生代谢产物
超量积累. WuJY 等 发 现,细 菌 Ba
种改良和良种选育 等 方 面 发 挥 着 重 要 作 用,但 是 不
①
化生产等优点,在诱 导 产 生 发 根 的 过 程 中 还 可 以 导
入外源基因,达到改良改进药用植物品种的目的 [３].
常见的中药材有 ３０％ 以上来源 于 药 用 植 物 的 根 部,
毛状根培养生产药用次级代谢产物
2毛状根生长机理 毛状根生长机理
2.1发根农杆菌Ri质粒及其作用机理
发根农杆菌属土壤农杆菌， 革兰氏阴性。发 根农杆菌能侵染多种植物, 诱发被感染植物的 受伤部位长出毛状根。 发根农杆菌之所以具 有这种致根性， 是因为它具有能诱导毛状根 产生的 Ri 质粒。Ri 质粒是发根农杆菌染色体 外的一个约250kb的大质粒， 在Ri质粒上有 T-DNA。当发根农杆菌感染植物时， Ri 质粒 上的 T-DNA 可以转化并插入到植物细胞的基 因组中，其整合和表达的结果是产生了大量的 毛状根。
4毛状根合成次生代谢产物 毛状根合成次生代谢产物
培养基进行培养，主要影响因素有 光照、温度、 PH 、培养基成分 （碳源、氮源、激素等）等，经过 培养毛状根产生并积累次级代谢产 物,经分离提取可做药品、色素、调 味品、香料、兴奋剂、杀虫剂等。
5结语 结语
随着毛状根诱导技术的不断 成熟，毛状根培养取得了显 著的发展，目前需要解决的 主要问题是如何进行大规模 培养，如何提高次级代谢产 物的产量。
badboy11植物被发根农杆菌感染后在伤口处就会形成不定根不定根除菌后能迅速生长传基因稳定生长迅速于培养次生代谢产物含量高等特点
毛状根培养生产药用 次级代谢产物
Bad Boy
1毛状根概念及特点 毛状根概念及特点
1.1 植物被发根农杆菌 感染后，在伤口处就会 形成不定根，不定根除菌后能迅速生长， 并 产生多个分枝， 呈毛发状， 该不定根又被称 为毛状根 。 1.2 毛状根具有遗传基因稳定、 生长迅速、 易 于培养、 次生代谢产物含量高等特点。关于 毛状根诱导的技术发展很快，特别是利用毛状 根大量生产药用植物活性成分的研究， 成为 研究热点。
3毛状根培养步骤 毛状根培养步骤 外植体的选择及处理 毛状根的转化 毛状根的鉴定除菌
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毛状根诱导的分子机理
1
发根土壤杆菌识别受伤植 物释放的诱导物（乙酞丁 香酮等酚性物质）
2
发根土壤杆菌识别信号 分子后,向受伤细胞作趋 化性运动,并与宿主细胞 发生粘接。
4
T-DNA基因进人寄主细 胞的细胞核，并整合到核 基因组中,然后在寄主细 胞中表达,从植物的感染 点诱导毛状根.
3
发根土壤杆菌Ri质粒上的 vir区（致病区）基因被 乙酞丁香酮等物质活化, 使Ri质粒上的T-DNA片段 被切割下来并转入植物细 胞,但vir区本身不转入。
2.激素自养性
3.遗传稳定性
4.可塑造性
与中药现代化生产
次生代谢产物的 规模化生产 生产药用植物 的活性成分
成功应用 于工业生 产的例子
药用植物人参、紫草、长春花、甜菜胡萝卜 (Daucuscarota)等植物的毛状根能够通过生 物反应器培养来进行其次生物质的规模化生 产。
展望
优：毛状根培养体系是一种非常有潜力的生产次生代谢物的
因此，如何更好的开发和利用毛状根培育技术，使其能够达
到基础研究和大规模工业化生产的要求还需要进一步探讨
毛状根培养反应器
毛状根培养反应器
毛状根培养反应器
毛状根培养技术的优点
1.生长速度快
毛状根有大量的分枝和根毛, 生长快,可用于大量培养。 毛状根中的T-DNA片段上有生长 素合成酶基因。 毛状根是细胞分化而来的根组 织，属于单克隆,具有遗传稳 定性。 发根农杆菌中的斑质粒是一个 很好的转基因载体,可把目的 基因导入植物细胞中LOGO毛状 Nhomakorabea培养技术
毛状根培养技术
1
毛状根培养技术简介 毛状根诱导培养体系的建立 毛状根培养技术与中药生产 展望
2 3 4
什么是毛状根培养 ？
毛状根是一种多分枝的、生长迅速的不定根，
它是将发根农杆菌的Ri质粒中含有的T-DNA转 化到植物细胞的T-DNA上,使植物细胞诱导产生 毛状根。
毛状根培养技术是20世纪80年代发展起来的基
生物技术，其次级代谢物质的生产能力遗传及生化稳定性增 加生物量的可操作性等特点都引起了人们相当大的兴趣 。 缺：目前的生物反应器还难以满足毛状根大规模培养的要求, 主要限制因素为物质的转移,毛状根生长时易成团,限制了营养 和氧气的进入。 缺：由于目前对农杆菌不同菌株间侵染物种能力的差异机理 还不够了解，并且不同物种间诱导形成毛状根的能力也不同 ，目前为止仅应用于部分的双子叶植物和少部分的单子叶植 物及裸子植物，应用范围较窄。
因工程和细胞工程相结合的一项新技术。
发根农杆菌Ri质粒
毛状根培养体系
除菌
无菌苗
诱导出的毛状根 进行液体培养
毛状根的诱导过程
无菌植株生长到一定时候,将植株的茎尖、叶片切去,剩
下茎秆和根部,在茎秆上划出伤口,将带Ri质粒的土壤杆 菌接种在伤口处和茎的顶部切口处,接种后继续培养被 感染的植株,经过一段时间（2一4周）的培养后,在接种 部位产生出毛状根。 诱导过程中可通过优化诱导条件，使毛状根生物量增殖 或有效成分含量增多。 要建立起正常的毛状根必须经过除菌以便获得无菌的毛 状根。通常用抗生素除菌即是：将毛状根从母体上切下 后移植到含抗生素的培养基上经数代转移直到完全无菌 为止。