译文—血糖调节肝FXR受体的表达

血糖调节肝FXR受体的表达高甘油三酯血症和胆囊疾病在糖尿病或胰岛素抵抗患者的发生呈普遍增加的趋势。

高甘油三酯血症同胆囊疾病风险呈正相关。

类法尼醇X受体（FXR）是胆汁酸激活的核受体在胆汁酸和甘油三酯稳态中发挥重要作用。

对控制FXR基因表达的机制知之甚少。

这项研究评估是否通过血糖稳态的改变调节FXR基因的表达。

FXR表达在链霉素诱导的糖尿病鼠肝脏中减少，在胰岛素补充后其表达上升至正常。

随着糖尿病的进展，FXR的表达在中老年糖尿病Zucker鼠中也减少。

在原代大鼠肝细胞中，D-葡萄糖以剂量和时间依赖的方式增加了FXRmRNA，然而胰岛素却有着不同的反应。

除了木酮糖-5-磷酸盐的前体木糖醇，作为D-葡萄糖增加原发性大鼠肝细胞FXR的表达。

最终，FXR靶基因（SHP和载脂蛋白C-III）的表达是通过D-葡萄糖和FXR配体双重调节的。

这项研究证明FXR在糖尿病动物模型中减少。

另外，FXR通过葡萄糖经过磷酸戊糖途径调节的。

FXR表达的调节失常或许能引起糖尿病或胰岛素抵抗患者糖脂代谢失常。

全球超过3亿人正处于患糖尿病的风险。

1型糖尿病相对来说发生的比较早，是由于胰岛β细胞的破坏所致。

相反，2型糖尿病在中年人中发病较多，是由于生活方式引起胰岛素抵抗的结果。

胰岛素抵抗最初以糖耐量受损为特征，随后以胰岛细胞受损最终发展为2型糖尿病。

2型糖尿病患者通常发生高甘油三脂血症，而这同发生胆囊疾病风险呈正相关，是糖尿病患者一个普遍存在的病理改变。

另外，胆汁组成的改变被描述在糖尿病患者中。

然而胆汁酸代谢和甘油三酯稳态在糖尿病或胰岛素抵抗中的分子联系仍有待于进一步研究。

血糖是基因表达的重要调节器。

最近研究已经识别出转录因子，例如上游刺激因子，固醇反应元件结合蛋白-1c，鸡卵白蛋白上游启动子转录因子-2和糖类反应元件结合蛋白，作为糖诱导基因调节的调节器。

然而，糖调节这些因子的转录活性的机制仍不十分清楚。

葡萄糖影响基因转录或许是由代谢分子如葡萄糖-6-磷酸盐（葡萄糖-6-磷酸酶合成的底物）调节的，或者是木糖醇-5-磷酸盐，是磷酸戊糖途径的非氧化分支的中间代谢物。

除此之外，己糖胺旁路也通过葡萄糖参与了基因的调节。

类法尼醇X受体（FXR）是核受体超家族的一员，在肾上腺、肠道、肾脏和肝脏内表达。

FXR与FXR反应元件（FXREs）结合在异二聚体之后与类维生素A结合。

对于FXR/RXR 异二聚体最佳DNA结合序列是被核酸隔开的两个AGGTCA反向重复序列。

然而，FXR作为一个单体也与延伸的半位点结合。

胆汁酸是天然的FXR配体，然而GW4064是合成的非固醇类FXR激动剂。

FXR通过减少固醇-7α-羟化酶（Cyp7a1）的表达负反馈调节胆汁酸的合成，Cyp7a1是胆汁酸合成的限速酶，在某种程度上通过间接机制参与小分子异源二聚体伴侣（SHP）的诱导。

另外，通过增加回肠胆汁酸结合蛋白的转录，抑制肝脏胆汁酸主动转运Na-牛黄胆酸盐联合转运多肽的表达，诱导胆酸盐输出泵和多药抵抗相关蛋白，FXR控制胆汁酸的肠肝循环。

总之，胆汁酸激活的FXR控制胆汁酸稳态。

FXR也调节脂代谢。

缺乏FXR的老鼠显示血清胆固醇和甘油三酯水平升高。

而且，FXR 调节基因控制脂代谢，例如载脂蛋白C-II,载脂蛋白C-III, 载脂蛋白A-I, 载脂蛋白E和磷脂转运蛋白。

另外，FXR诱导过氧化物酶体增殖物激活受体-α的表达，其是另一个控制甘油三酯代谢的核受体，证实了FXR在甘油三酯代谢的潜在作用。

考虑到糖尿病患者高甘油三脂血症和胆汁酸代谢改变之间的临床联系以及FXR在甘油三酯和胆汁酸稳态中的关键作用，我们开始评价是否在改变血糖稳态的条件下调节FXR基因的表达。

我们的结果显示链脲霉素（STZ）诱导的糖尿病呈现出下调FXR基因的表达。

除此之外，肝FXR表达减少ZDF鼠伴随的糖尿病的进展。

而且，通过使用非糖尿病鼠的原发性肝细胞，我们得出D-葡萄糖确实以剂量依赖和时间依赖方式调节FXR基因的表达，可能是在转录水平发挥作用。

另外，FXR靶基因SHP和载脂蛋白C-III的表达是通过血糖和FXR配体调节的。

最后，我们得出葡萄糖的作用是通过磷酸戊糖途径的代谢物调节的。

研究设计和方法从IFFA CREDO购买的雄性大白鼠封闭在温度控制在12小时白天/黑夜循环的环境下，可以免费获取食物和水。

从基因模型中获得的5周龄的雄性祖克尔糖尿病肥胖和消瘦的老鼠，维持在普瑞纳5008饮食条件下。

一共48只老鼠分成三组，每组16只（8只ZDF鼠和8只ZLC鼠），分别在6周、10周、20周龄。

体重和食物消耗通过实验进行检测。

血液样本是在麻醉状态下眼窝穿刺获得的，检测出血糖和胰岛素水平。

所有试验根据指南实验动物方针和使用的基础上进行的。

STZ诱导的糖尿病该协议使用STZ诱导的糖尿病鼠在前面已经描述。

通过单一腹膜内注射STZ诱导糖尿病（6毫克/100克体重，n=14）。

对照组老鼠（n=5）接受腹腔内注射溶剂（3%柠檬酸钠）的方法。

通过饮食过量、烦渴和多尿的发展认为是糖尿病，通过血葡萄糖的水平证实糖尿病。

三周后STZ注射糖尿病鼠的一组使用胰岛素治疗。

在注射STZ后第四周进行了实验。

在这四周的实验中没有一只接受STZ的老鼠死掉。

原代大鼠肝细胞通过往大白鼠肝脏中输入胶原酶而使肝细胞分离。

在37°C温度5%二氧化碳95%空气的湿度下，在血清中加2mmol/l谷氨酸盐，25ug/ml庆大霉素，100 nmol/l地塞米松和0.1%游离脂肪酸，在这种条件肝细胞（通过台盼蓝清除试验测定细胞生存率＞85%）作为单层细胞进行培养。

4小时潜伏期之后，中间产物发生了变化，增加了2mmol/l谷氨酸盐，25ug/ml庆大霉素，100 nmol/l地塞米松，10mmol/l的乳酸盐和5.5mol/l的D-葡萄糖。

经过隔夜培养在指定的时间新鲜培养基中增加2mmol/l谷氨酸盐，25ug/ml庆大霉素，和100 nmol/l地塞米松后细胞培养出来，就像结果中所描述的那样有不同的化合物。

正如前文所描述那样，细胞在放线菌素D中培养，就像图例所显示D-葡萄糖加入培养基中。

RNA提取及定量PCR分析根据厂商说明使用Trizol试剂使得全部RNA从肝脏和原代肝细胞中分离。

RNA通过使用随机六聚体引物和200单位MMLV逆转录酶进行逆转录。

在MX-4000装置使用特异性引物（FXR前方：5-CCA ACC TGG GTT TCT ACCC-3; FXR 反方向: 5-CAC ACA GCT CAT CCC CTT T-3; SHP前方: 5-ACT GCC TGT GCC AGC AAC AC-3; SHP反方向: 5-AGC CGT CGC TGA TCC TCA TG-3; Cyp7a1前方: 5-ATG ATG ACT ATT TCT TTG ATT TGG GGA-3; Cyp7a1反方向: 5-CTT CTG TGT CCA AAT GCC TTC GCA GAA-3;LPK前方: 5-CGT GCG AGT GTG GCT CAA CTG ACC C-3; LPK反方向:5-GTC GTC AAT GTA GAT GCG GCC CCC C-3; apo C-III前方: 5-GAA CAA GCC TCC AAG ACG GT-3; apo C-III反方向: 5-GGG ATT TGA AGC GAT TGT CC-3; 36B4前方: 5-CAT GCT CAA CAT CTC CCC CTT CTC C-3; 和36B4反方向: 5-GGG AAG GTG TAA TCC GTC TCC ACA G-3)进行及时定量PCR反应对FXR，SHP,Cyp7a1,LPK, apo C-III和36B4 mRNA进行了量化。

PCR 扩增在25微升的容积中进行，溶剂中包含100nm/l的各自引物，4mmol/l氯化镁，PCR核心试剂以及荧光染料0.33X。

在95℃条件下10分钟，随后是在95°C条件下30秒,在55°C条件下30秒和在72°C条件下30秒进行40周期后mRNA正常化为36B4mRNA。

电泳迁移分析电泳迁移分析（EMSAs）使用放射性标记FXRE共识探头。

对于使用核提取物的实验在4℃消除过多的盐份进行一小时透析和纯化蛋白质。

核提取物使用电泳迁移实验在4℃条件下30分钟进行培养，在使用探针技术后在相同条件下进行30分钟。

对于这个实验，0.2微克抗FXR抗体在结合除了探头的设备20分钟被培养出来。

统计分析通过使用T检验或U检验分析由统计学意义。

P＜0.05认为有统计学意义。

结论在糖尿病鼠中肝FXR基因表达减少要确定在体内高血糖的条件下是否对FXR基因进行调节，在链脲霉素注射诱导的糖尿病鼠中检测肝FXRmRNA水平。

在STZ-诱导的糖尿病鼠中血糖水平要高于控制组或者胰岛素治疗组动物。

STZ-诱导的糖尿病鼠与控制组比较，肝FXRmRNA的表达显著降低。

有趣的是，对于胰岛素调节的糖尿病鼠恢复FXRmRNA水平与对照组动物相似。

表1 FXR表达在糖尿病鼠模型中减少。

ZDF鼠和ZLC鼠（每组8个）肝脏分为治疗组或者STZ诱导糖尿病鼠而没用胰岛素治疗或使用胰岛素治疗组，就像研究设计和方法所描述的那样，使用PCR定量分析测得FXRmRNA水平（C）。

FXRmRNA水平和36B4mRNA相比是正常的。

B;血糖水平来自一般治疗STZ诱导的糖尿病鼠或胰岛素治疗STZ诱导的糖尿病鼠。

D; 不同年龄段的ZDF和ZLC鼠的血糖和胰岛素水平。

数据用均数±标准差表示。

在控制组和第六周ZDF/ZLC或ZDF和ZLC之间任何年龄表明都有统计学意义。

为了评估肝脏FXR表达是否在2型糖尿病模型中发生了改变，研究了随着年龄的增长而逐渐发展为2型糖尿病的ZDF鼠模型。

年龄相匹配的ZDF和ZLC控制组老鼠的分析显示在ZDF鼠中血糖水平逐渐增加。

相反，血浆胰岛素水平在6周龄非常高，说明存在着胰岛素抵抗，从那之后随着糖尿病的进展逐渐减少。

ZDF鼠与年龄相匹配的ZLC鼠想比较，肝FXRmRNA水平显著提高。

有趣的是，肝FXRmRNA水平随着ZDF鼠年龄的逐渐增长而降低。

在ZDF鼠第二十周，肝FXRmRNA水平同第六周ZLC鼠肝FXRmRNA水平相似。

同ZDF鼠相比，瘦的ZLC鼠在20周显示肝FXRmRNA水平增高，而这是与随着年龄增长血糖浓度增高相适应的。

为了证明在糖尿病模型中肝FXRmRNA表达的降低是否与FXR靶基因表达的改变有联系，分析Cyp7a1的表达。

肝Cyp7a1表达在STZ诱导的糖尿病鼠中有增加的趋势，而在胰岛素治疗后趋于正常。

在ZDF鼠中肝脏Cyp7a1的表达随着年龄的增长逐渐增加。