《医学分子生物学》课件：常用分子生物学技术的原理及其应用
常用分子生物学技术的原理及其应用
基因突变技术的最新进展
近年来，随着技术的发展，基因突变技术不断取得新 的突破和进展。
输标02入题
高通量突变筛选技术使得能够在短时间内对大量基因 进行突变和筛选，加速了基因功能研究和药物研发的 进程。
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基因编辑技术的出现，如CRISPR-Cas9系统，使得能 够实现精准地编辑基因组，为基因治疗和生物育种等
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基因突变技术在生物工程中广 泛应用于菌种改良、基因治疗
和生物制药等领域。
通过基因突变技术可以改良微 生物菌种的代谢途径，提高产
物的产量和品质。
在基因治疗中，基因突变技术 可用于纠正致病基因的缺陷， 治疗遗传性疾病和癌症等疾病
。
在生物制药中，基因突变技术 可用于产生具有特定性质的蛋 白质或酶，用于药物研发和生
常用分子生物学技术的原理及其应 用
目 录
• 基因克隆技术 • 基因表达技术 • 基因突变技术 • 蛋白质组学技术
01 基因克隆技术
基因克隆技术原理
基因克隆技术是通过将外源DNA片段插入到载体DNA中，然后将其转化到宿主细胞 中进行复制和表达，从而获得目的基因或基因片段的过程。
基因克隆的关键步骤包括：目的基因的获取、载体的选择和制备、DNA连接、转化 和筛选。
疾病治疗
基因表达技术可用于疾病 治疗，如基因疗法和基因 编辑等。
基因表达技术的最新进展
CRISPR-Cas9系统
这是一种新型的基因编辑技术，通过向导RNA和Cas9蛋白的引导，实现对特 定DNA序列的切割和编辑。
人工染色体
通过基因表达技术，可以人工构建染色体，实现生物体的染色体数目和结构的 改变。
领域带来了革命性的变革。
第二十二章常用分子生物学技术的原理及应用
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•一、基本工作原理
•Template • 5 DNA
•5
• 5
•Cycle 1
•Primer 1 •5 •Primer 2
•5 • 5
•5 •5
•Cycle 2
•5 • 5
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• 5
•5
• 5
•5 •5
•目 录
•5 • 5
• 5 • 5
•Cycle 3
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•第 八 节
•蛋白质相互作用研究技术
•Research Technology of Interaction of Protein
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•蛋白质之间相互作用研究的重要性
• 蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而 形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主 要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括 DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、 信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间 的相互作用。
•生 物 芯 片 技 术
•Biological Chip Technology
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第二十二章常用分子生物学技术的原 理及应用
•一、基因芯片(gene chip)
•DNA芯片(DNA chip)
•cDNA芯片(cDNA chip)
• 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片
段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位
三、几种重要的PCR衍生技术
（一）反转录PCR技术 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术
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分子生物学课件：2016-09 常用分子生物学技术的原理及其应用3
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Northern杂交的探针可 以是DNA，也可以是 RNA。
Northern杂交可以相对 定量检测细胞内的特定 mRNA表达水平。
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3. Dot Blot 斑点杂交：将RNA或变性DNA样品点到一张硝
标记物：
同位素:
32P， 35S，3H
非同位素:
生物素、地高辛、荧光素
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2. 加入变性的探针DNA
Add denatured probe DNA (labeled,complementary to the desired template), Mix
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第二十章. 常用分子生物学技术的 原理及其应用
第三节、
核酸印迹技术与分子杂交
Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization
1. Southern印迹（Southern Blot） 2. Northern印迹（Northern Blot ） 3. 点杂交（Dot Blot ） 4. 原位分子杂交（in situ hybridization）LOGO
DNA的复性：
• 单链DNA在溶液中随机 碰撞
• 互补单链通过碱基配对 形成氢键
• 两条重新缠绕在一起的 互补链不一定是原来的 两条链
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核酸分子杂交是指具有一定同源序列的两 条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按 碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源 双链的过程。
检测染色体、细胞和组织原位的 DNA。
判断特定序列是否存在或确定其在 染色体上位置。
箭头所示为杂交信号
基因组原位杂交（genome in situ hybridization，GISH）
《医学分子生物学》课件：常用分子生物学技术的原理及其应用
三、免疫筛选
首先制备和纯化得到目标基因的抗体位检测和进行。
目录
第四节 生物芯片技术
Biological Chip Technique
目录
一、基因芯片
Cycle 3
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25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
目录
PCR技术原理示意图
目录
PCR的基本反应步骤
变性 95˚C
延伸 72˚C
退火 Tm-5˚C
目录
目录
引物：
引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸。 PCR反应中的引物有两条，即5′端引物和3′端引物。 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。 PCR引物的设计与PCR反应的成败关系密切。
目录
基因芯片的分类：
(1)根据固相支持物的不同，DNA芯片分为无机(玻 璃、硅片、陶瓷等)和有机(聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼 龙膜等)芯片。
(2)根据芯片上所用探针不同分为寡核苷酸芯片和 cDNA芯片。
(3)根据芯片点样方式不同，可分为原位合成芯片、 微矩阵芯片(分喷点和针点)和电定位芯片3类。
(4)根据用途的不同分类为基因表达芯片和基因测序 芯片、诊断芯片、指纹图谱芯片。
commonusedtechniquesmolecularbiology目术目录molecularhybridizationblottingtechnique目录一核酸分子杂交nucleicacidhybridization在dna复性过程中如果把不同来源的dna单链分子放在同一溶液中或把dna与rna放在一起只要在dna或rna的单链分子之间有一定的碱基配对关系就可以在不同的分子之间形成杂化双链heteroduplex目录复性rnadna目录目录用可检测的放射性核素生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为探针探针可以与固定在nc膜上的待测的核苷酸片段结合判断是否有同源的核酸分子存在
第20章常用分子生物学技术的原理及其应用
第20章常用分子生物学技术的原理及其应用分子生物学技术是研究生物分子结构、功能、调控及其相互关系的重要手段，具有识别、分离、纯化、检测和重组生物分子的功能。
在生命科学研究和生物技术应用中，常用的分子生物学技术主要包括核酸提取、聚合酶链式反应（PCR）、限制酶切片段长度多态性分析（RFLP）、DNA测序、原位杂交、Northern和Southern blot杂交等。
下面将介绍这些常用分子生物学技术的原理及其应用。
1.核酸提取：核酸提取是从细胞或组织中获得目的核酸的方法。
其原理是通过细胞破碎及蛋白酶消化等步骤，将细胞内的核酸释放出来，并进行纯化。
核酸提取技术广泛应用于基因克隆、基因组学研究、医学诊断以及法医学中的DNA分析等领域。
2.聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种体外合成DNA的技术，通过多轮的循环温度反应，可以快速扩增一段特定的DNA序列。
其原理是利用DNA聚合酶酶活与特定引物的作用，在一系列温度循环中，使DNA序列通过链分离、引物结合、DNA合成循环进行扩增。
PCR技术被广泛应用于基因分型、基因克隆、突变检测、DNA测序等领域。
3.限制酶切片段长度多态性分析（RFLP）：RFLP是一种检测DNA序列多态性的方法，通过限制酶切割目的DNA，在凝胶电泳中观察DNA片段的长度差异。
其原理是利用限制酶对特定序列的识别和切割，形成不同长度的DNA片段，经凝胶电泳分离，通过核酸探针杂交或染料染色等方法来观察差异。
RFLP技术广泛应用于基因分型、基因组学研究、变异检测等领域。
4. DNA测序：DNA测序是一种确定DNA序列的方法，通过测定DNA的碱基顺序，揭示基因组结构和功能。
常用的DNA测序技术包括Sanger测序和高通量测序。
Sanger测序原理是利用DNA聚合酶、引物和一种特殊的停止链终止剂，在DNA合成过程中随机终止，形成不同长度的DNA片段，通过电泳分离后，通过染料或探针检测碱基顺序。
高通量测序技术基于快速测序平台和大规模并行测序，提高了测序效率和准确性，广泛应用于基因组学、转录组学等领域。
医学分子生物学PPT课件
基因诊断技术在临床中应用案例分析
01
基因诊断技术在临床中应用广泛，如用于遗传性疾病的诊断、病原体 检测、药物基因组学等。
02
例如，对于遗传性疾病的诊断，基因诊断技术可以检测出患者是否携 带某种遗传病的致病基因，为疾病的早期预防和治疗提供依据。
03
在病原体检测方面，基因诊断技术可以快速、准确地检测出病原体的 种类和数量，有助于临床医生及时采取有效的治疗措施。
04
药物基因组学则是利用基因诊断技术，分析个体对药物的代谢和反应 差异，为个体化用药提供指导。
07
基因治疗策略安全性问题 探讨
基因治疗策略概述
基因治疗定义
通过修改或操纵人类或其 他生物的遗传物质以达到 治疗疾病的目的。
06
基因诊断技术原理临床应 用
基因诊断技术原理简介
基因诊断是利用分子生物学技术 ，检测和分析基因的结构和功能 异常，从而对疾病进行诊断和预
测。
基因诊断技术基于DNA或RNA 水平的变化，包括基因突变、基 因缺失、基因插入、基因重排等
。
通过检测这些变化，可以确定个 体是否携带某种疾病的易感基因 或已经患病，为临床诊断和治疗
提供依据。
基因诊断技术方法分类
基因诊断技术主要包括核酸检 测技术、基因芯片技术、高通
量测序技术等。
核酸检测技术是最常用的基因 诊断方法之一，包括聚合酶链 式反应（PCR）、实时荧光定 量PCR等，可用于检测病原体
、基因突变等。
基因芯片技术是一种高通量的 基因检测技术，可以同时检测 多个基因的变化，适用于大规 模筛查和基因表达谱分析。
第21章 常用分子生物学技术的原理及其应用
阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反 应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统 对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。
蛋白质芯片作用原理 蛋白质分子间的亲和反应
目录
第六节
生物大分子相互作用研究技术
The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study
目录
克隆疾病相关基因的策略 • 功能克隆(functional cloning) • 定位克隆(positional cloning)
目录
（一）功能克隆
定义 从对一种致病基因的功能的了解出发来
克隆该致病基因。 应用
生化机制已明确、基因表达产物较易得 到部分纯化的遗传性疾病。
目录
利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。 用不同人的DNA片段转化与人类遗传疾病具有 类似表型的突变酵母，可以恢复(rescue)正常表型 的片段中所含有的基因即可能为致病基因。这种实 验称为功能互补试验 (functional complementation assay)。
3'
上游 5' 引物
R
Q
R
Q
3'
5'
5' 下游 3' 引物
5' 3'
目录
第三节 核酸序列分析
Nucleic Acid Sequence Analysis
目录
核酸序列分析的基本原理： • 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) • DNA链的末端合成终止法 (Sanger法)
目录
一、DNA链末端合成终止法
常用分子生物学技术的原理及其应用
常用分子生物学技术的原理及其应用常用分子生物学技术是一系列用于分析和操作分子生物学层面的实验技术。
这些技术基于对核酸（DNA和RNA）和蛋白质的结构和功能的研究，以及对基因表达和调控机制的理解。
在本文中，我将介绍常用分子生物学技术的原理和应用。
1.聚合酶链式反应（PCR）：PCR是一种能够从极少量的DNA样本中扩增特定DNA序列的技术。
它基于DNA的两条链之间的互补配对，使用DNA聚合酶酶和引物来在离子和温度周期变化的条件下进行。
PCR技术广泛应用于分子生物学和生物医学研究中，包括基因克隆、基因突变分析、DNA指纹鉴定以及病原体的检测等。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA，RNA和蛋白质的常用技术。
其中，聚丙烯酰胺（或琼脂糖）是一种高分子量聚合物，能够形成孔隙凝胶。
在电场的作用下，DNA，RNA或蛋白质在凝胶中迁移，根据大小和电荷的差异进行分离。
凝胶电泳广泛用于DNA和RNA的分离和纯化，以及蛋白质的分析和鉴定。
3.DNA测序：DNA测序是确定DNA序列的技术。
它通过测量DNA片段中的碱基顺序来分析DNA的序列信息。
目前有多种DNA测序技术，包括链终止测序（Sanger测序）和高通量测序（如Illumina测序和Ion Torrent测序）。
DNA测序在基因组学、遗传学和基因诊断中起着重要的作用。
4.基因克隆技术：基因克隆是指将目标基因从其源DNA中扩增，并将其插入到载体DNA 中，然后转化到宿主细胞中。
利用基因工程技术，克隆的基因可以在宿主细胞中被表达。
这种技术被广泛应用于重组蛋白质的定制表达、转基因生物的制备以及基因治疗的研究中。
5. 蛋白质电泳和Western blot：蛋白质电泳是一种分离和分析蛋白质的技术。
与DNA电泳类似，蛋白质电泳通过在聚丙烯酰胺凝胶中迁移蛋白质来分离不同大小和电荷的蛋白质。
Western blot是一种检测目标蛋白质的特异性抗体的技术，通过将蛋白质转移到膜上，然后使用特异性抗体与目标蛋白质结合来检测和定量蛋白质。
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预杂交液实际上就是不含探针的杂交液 ，其中主要 含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低， 不会与待测DNA或探针杂交）、牛血清等，这些大分子 可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。
常用分子生物学技术的 原理及应用
The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology
目录
一、分子用研究技术
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第一节 分子杂交与印迹技术
Cycle 3
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25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
目录
PCR技术原理示意图
目录
PCR的基本反应步骤
变性 95˚C
延伸 72˚C
退火 Tm-5˚C
目录
目录
引物：
引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸。 PCR反应中的引物有两条，即5′端引物和3′端引物。 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。 PCR引物的设计与PCR反应的成败关系密切。
目录
PCR体系基本组成成分 • 模板DNA • 特异性引物 • 耐热DNA聚合酶 • dNTPs • 含Mg2+缓冲液
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一、PCR技术的工作原理
Template DNA
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Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
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Cycle 2
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Molecular Hybridization and Blotting Technique
目录
一、分子杂交与印迹技术的原理
（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在 DNA 复 性 过 程 中 ， 如 果 把 不 同 来 源 的
DNA 单 链 分 子 放 在 同 一 溶 液 中 ， 或 把 DNA 与 RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子 之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的 分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
目录
（二）基因突变
利用PCR技术可以随意设计引物在体 外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突 变等改造。
目录
引物设计遵循下列原则：
① 引物长度一般为15～30个碱基。引物过短，扩增的特异 性降低；引物过长，虽提高扩增的特异性，但敏感性下降。
② 引物中碱基的发布是随机的尽量避免多聚嘌呤或多聚嘧啶。 ③ G＋C的含量在引物的碱基中一般为45％～55％。 ④ 引物内避免存在互补序列，以免折叠形成发夹结构。 ⑤ 两引物间不应存在有互补序列，尤其是避免3′端的互补。⑥ 引物的碱基序列不应与非扩增序列有同源性。 ⑦ 引物的3′端碱基一定要与模板互补配对；而5′则可相对不严， 甚至还可做一些修饰，如附加限制性内切酶的位点，引入突变 位点等。
目录
第二节
PCR技术的原理与应用
The Principle and Application of PCR Technology
目录
PCR：Polymerase Chain Reaction 1983
聚合酶链反应，一种DNA片段（基因）的体外扩增术 以待扩增的DNA片段为模板，以一对与模板互补的寡核 苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，依半保留复制机制 沿模板链延伸直至完成2条新链的合成，重复这一过程，即 可使目的DNA片段得以扩增。
目录
二、印迹技术的类别及应用
（一） Southern blotting (DNA印迹 )
用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
（二） Northern blotting (RNA印迹 )
用于RNA的定性定量分析。
（三） Western blotting (蛋白质印迹 )
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
目录
二、PCR技术的主要用途
（一）目的基因的克隆
• 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获 得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直 接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的• 利用随机引物从cDNA或基因组中克隆 基因。目录
（三）印迹技术
利用各种物理方法（毛细作用）使电泳胶中 的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为 固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张 上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹 技术。 将载有DNA单链分子的NC膜放在杂交反 应液中，溶液中具有互补序列的DNA单链分子 就可以与NC膜上的DNA单链分子互补结合而得 以检测。
目录
Southern 印迹杂交流程：
标记的探针
组织或细胞 基因组DNA 限制酶酶解及电泳分离
转移到硝酸纤维膜或尼龙膜
杂交
预杂交
洗膜
放射自显影
目标DNA
总DNA
用限制酶消化
不同大小的DNA片断
同标记的DNA探针孵育、 滤膜转印、变性 鉴定
根据片段大小 用凝胶电泳分离
目录
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预杂交： 将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必
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三 种 印 迹 技 术 的 比 较
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放 射 自 显 影 照 片
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其他： （1）斑点印迹 (dot blotting)
不经电泳分离而直接将样品点在NC膜上用于杂交分析。 （2）原位杂交 (in situ hybridization)
样品不经提取而直接用组织切片或细胞涂片用于杂交分析。 （3）DNA芯片技术 (DNA chip)。
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复性
RNA
ห้องสมุดไป่ตู้
DNA
目录
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（二）探针技术
用可检测的放射性核素、生物素或荧光染 料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸 链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜 上的待测的核苷酸片段结合，判断是否有同源 的核酸分子存在。
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核酸分子杂交现探针技术的应用：
研究DNA分子中某一种基因的位置。 鉴定两种核酸分子间的序列相似性。 检测某些专一序列在待检样品中存在与否。 是基因芯片等技术的基础 。