《医学分子生物学》课件：常用分子生物学技术的原理及其应用
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引物设计遵循下列原则：
① 引物长度一般为15～30个碱基。引物过短，扩增的特异 性降低；引物过长，虽提高扩增的特异性，但敏感性下降。
② 引物中碱基的发布是随机的尽量避免多聚嘌呤或多聚嘧啶。 ③ G＋C的含量在引物的碱基中一般为45％～55％。 ④ 引物内避免存在互补序列，以免折叠形成发夹结构。 ⑤ 两引物间不应存在有互补序列，尤其是避免3′端的互补。⑥ 引物的碱基序列不应与非扩增序列有同源性。 ⑦ 引物的3′端碱基一定要与模板互补配对；而5′则可相对不严， 甚至还可做一些修饰，如附加限制性内切酶的位点，引入突变 位点等。
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第二节
PCR技术的原理与应用
The Principle and Application of PCR Technology
目录
PCR：Polymerase Chain Reaction 1983
聚合酶链反应，一种DNA片段（基因）的体外扩增术 以待扩增的DNA片段为模板，以一对与模板互补的寡核 苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，依半保留复制机制 沿模板链延伸直至完成2条新链的合成，重复这一过程，即 可使目的DNA片段得以扩增。
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三 种 印 迹 技 术 的 比 较
目录
放 射 自 显 影 照 片
目录
其他： （1）斑点印迹 (dot blotting)
不经电泳分离而直接将样品点在NC膜上用于杂交分析。 （2）原位杂交 (in situ hybridization)
样品不经提取而直接用组织切片或细胞涂片用于杂交分析。 （3）DNA芯片技术 (DNA chip)。
Molecular Hybridization and Blotting Technique
目录
一、分子杂交与印迹技术的原理
（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在 DNA 复 性 过 程 中 ， 如 果 把 不 同 来 源 的
DNA 单 链 分 子 放 在 同 一 溶 液 中 ， 或 把 DNA 与 RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子 之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的 分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
目录
Southern 印迹杂交流程：
标记的探针
组织或细胞 基因组DNA 限制酶酶解及电泳分离
转移到硝酸纤维膜或尼龙膜
杂交
预杂交
洗膜
放射自显影
目标DNA
总DNA
用限制酶消化
不同大小的DNAHale Waihona Puke Baidu断
同标记的DNA探针孵育、 滤膜转印、变性 鉴定
根据片段大小 用凝胶电泳分离
目录
目录
预杂交： 将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必
Cycle 3
5
5
5
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5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
目录
PCR技术原理示意图
目录
PCR的基本反应步骤
变性 95˚C
延伸 72˚C
退火 Tm-5˚C
目录
目录
引物：
引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸。 PCR反应中的引物有两条，即5′端引物和3′端引物。 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。 PCR引物的设计与PCR反应的成败关系密切。
常用分子生物学技术的 原理及应用
The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology
目录
一、分子杂交与印迹技术 二、PCR技术 三、基因文库 四、生物芯片技术 五、生物大分子相互作用研究技术
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第一节 分子杂交与印迹技术
目录
二、PCR技术的主要用途
（一）目的基因的克隆
• 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获 得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直 接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；
• 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得 序列相似的基因片段；
• 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆 基因。
目录
PCR体系基本组成成分 • 模板DNA • 特异性引物 • 耐热DNA聚合酶 • dNTPs • 含Mg2+缓冲液
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一、PCR技术的工作原理
Template DNA
5
5
5
Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5 5
5 5
5 5
Cycle 2
5 5
5 5
目录
5 5
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（三）印迹技术
利用各种物理方法（毛细作用）使电泳胶中 的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为 固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张 上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹 技术。 将载有DNA单链分子的NC膜放在杂交反 应液中，溶液中具有互补序列的DNA单链分子 就可以与NC膜上的DNA单链分子互补结合而得 以检测。
目录
二、印迹技术的类别及应用
（一） Southern blotting (DNA印迹 )
用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
（二） Northern blotting (RNA印迹 )
用于RNA的定性定量分析。
（三） Western blotting (蛋白质印迹 )
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
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复性
RNA
DNA
目录
目录
（二）探针技术
用可检测的放射性核素、生物素或荧光染 料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸 链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜 上的待测的核苷酸片段结合，判断是否有同源 的核酸分子存在。
目录
核酸分子杂交现探针技术的应用：
研究DNA分子中某一种基因的位置。 鉴定两种核酸分子间的序列相似性。 检测某些专一序列在待检样品中存在与否。 是基因芯片等技术的基础 。
目录
（二）基因突变
利用PCR技术可以随意设计引物在体 外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突 变等改造。
须先进行一个预杂交的过程。因为能结合DNA片段的膜 同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所 有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。
预杂交液实际上就是不含探针的杂交液 ，其中主要 含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低， 不会与待测DNA或探针杂交）、牛血清等，这些大分子 可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。
引物设计遵循下列原则：
① 引物长度一般为15～30个碱基。引物过短，扩增的特异 性降低；引物过长，虽提高扩增的特异性，但敏感性下降。
② 引物中碱基的发布是随机的尽量避免多聚嘌呤或多聚嘧啶。 ③ G＋C的含量在引物的碱基中一般为45％～55％。 ④ 引物内避免存在互补序列，以免折叠形成发夹结构。 ⑤ 两引物间不应存在有互补序列，尤其是避免3′端的互补。⑥ 引物的碱基序列不应与非扩增序列有同源性。 ⑦ 引物的3′端碱基一定要与模板互补配对；而5′则可相对不严， 甚至还可做一些修饰，如附加限制性内切酶的位点，引入突变 位点等。
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第二节
PCR技术的原理与应用
The Principle and Application of PCR Technology
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PCR：Polymerase Chain Reaction 1983
聚合酶链反应，一种DNA片段（基因）的体外扩增术 以待扩增的DNA片段为模板，以一对与模板互补的寡核 苷酸片段为引物，在DNA聚合酶作用下，依半保留复制机制 沿模板链延伸直至完成2条新链的合成，重复这一过程，即 可使目的DNA片段得以扩增。
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三 种 印 迹 技 术 的 比 较
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放 射 自 显 影 照 片
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其他： （1）斑点印迹 (dot blotting)
不经电泳分离而直接将样品点在NC膜上用于杂交分析。 （2）原位杂交 (in situ hybridization)
样品不经提取而直接用组织切片或细胞涂片用于杂交分析。 （3）DNA芯片技术 (DNA chip)。
Molecular Hybridization and Blotting Technique
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一、分子杂交与印迹技术的原理
（一）核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在 DNA 复 性 过 程 中 ， 如 果 把 不 同 来 源 的
DNA 单 链 分 子 放 在 同 一 溶 液 中 ， 或 把 DNA 与 RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子 之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的 分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
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Southern 印迹杂交流程：
标记的探针
组织或细胞 基因组DNA 限制酶酶解及电泳分离
转移到硝酸纤维膜或尼龙膜
杂交
预杂交
洗膜
放射自显影
目标DNA
总DNA
用限制酶消化
不同大小的DNAHale Waihona Puke Baidu断
同标记的DNA探针孵育、 滤膜转印、变性 鉴定
根据片段大小 用凝胶电泳分离
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预杂交： 将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必
Cycle 3
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25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
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PCR技术原理示意图
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PCR的基本反应步骤
变性 95˚C
延伸 72˚C
退火 Tm-5˚C
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引物：
引物是指与待扩增靶DNA两端序列互补的寡核苷酸。 PCR反应中的引物有两条，即5′端引物和3′端引物。 引物决定PCR扩增产物的特异性和长度。 PCR引物的设计与PCR反应的成败关系密切。
常用分子生物学技术的 原理及应用
The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology
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一、分子杂交与印迹技术 二、PCR技术 三、基因文库 四、生物芯片技术 五、生物大分子相互作用研究技术
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第一节 分子杂交与印迹技术
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二、PCR技术的主要用途
（一）目的基因的克隆
• 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获 得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直 接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段；
• 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得 序列相似的基因片段；
• 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆 基因。
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PCR体系基本组成成分 • 模板DNA • 特异性引物 • 耐热DNA聚合酶 • dNTPs • 含Mg2+缓冲液
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一、PCR技术的工作原理
Template DNA
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Cycle 1
Primer 1 5 Primer 2
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（三）印迹技术
利用各种物理方法（毛细作用）使电泳胶中 的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为 固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张 上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹 技术。 将载有DNA单链分子的NC膜放在杂交反 应液中，溶液中具有互补序列的DNA单链分子 就可以与NC膜上的DNA单链分子互补结合而得 以检测。
目录
二、印迹技术的类别及应用
（一） Southern blotting (DNA印迹 )
用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
（二） Northern blotting (RNA印迹 )
用于RNA的定性定量分析。
（三） Western blotting (蛋白质印迹 )
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
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复性
RNA
DNA
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（二）探针技术
用可检测的放射性核素、生物素或荧光染 料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸 链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜 上的待测的核苷酸片段结合，判断是否有同源 的核酸分子存在。
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核酸分子杂交现探针技术的应用：
研究DNA分子中某一种基因的位置。 鉴定两种核酸分子间的序列相似性。 检测某些专一序列在待检样品中存在与否。 是基因芯片等技术的基础 。
目录
（二）基因突变
利用PCR技术可以随意设计引物在体 外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突 变等改造。
须先进行一个预杂交的过程。因为能结合DNA片段的膜 同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所 有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。
预杂交液实际上就是不含探针的杂交液 ，其中主要 含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低， 不会与待测DNA或探针杂交）、牛血清等，这些大分子 可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。