第九章 凝胶过滤及
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凝胶层析技术(凝胶过滤)
目前使用较多的是葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶，其商品为生物凝胶-P（Bio-Gel P）组成单位是丙烯酰胺（CH2=CH-CONH2）与 甲叉双丙稀酰胺，共聚交联成聚丙烯酰胺。 优点：全惰性的，适宜作为凝胶层析的载体。 缺点：不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羧基，使凝 胶带有一定的离子交换基团，一般只在pH为11范 围内使用。 交联葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex）。 优点：具有良好的化学稳定性等优点。目前最常用。
原理
● 凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每 个颗粒犹如一个筛子。 ● 当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子 质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙， 随着溶剂流动，首先流出层析柱； ● 相对分子质量较小的物质可自由地进出 凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率 慢而最后流出层析柱。 ● 中等大小的分子在大分子物质与小分子 物质之间被洗脱。 ● 这样，经过层析柱，混合物中的各物质 按其分子大小不同而被分离。
3、样品的加入 吸取1ml血红蛋白——核黄素混合液，加到凝胶床的表面上， 不要沿柱壁加样品，注意加样时勿将床冲起。 打开出口管，用少量水流一下，接触过样品的管壁，再加水扩 展洗脱，用试管将洗脱液。 4、洗脱： 加0.1mol/l的Nacl溶液洗脱，流速为每分钟1ml,两分钟收一 管。 5、比色测定：波长，红色部分520nm,黄色部分450nm 绘制洗脱曲线： 以光密度为纵座标，以时间为横座标，并标明洗脱峰的名称 。 6、凝胶的回收。
特点：与被分离物质分子的 大小和凝胶颗粒孔隙的大小 有关
Kd=0
大分子量 小分子量
Hale Waihona Puke 0＜Kd<1 Kd=1
洗脱体积
应用
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、 多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可 以完全将它们分开。 利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、 去热源和脱色。
凝胶过滤名词解释
凝胶过滤名词解释
凝胶过滤是一种常用的物质分离和纯化方法，通常用于分离生物分子（如蛋白质、核酸等）或颗粒（如细胞、病毒等）。
在凝胶过滤中，通过使用一种类似于海绵的凝胶材料作为分离层，较大的分子或颗粒无法穿过凝胶的孔隙而被滞留在上层，较小的分子或颗粒则可以通过凝胶的孔隙移动到下层。
因此，凝胶过滤可以根据样品中分子或颗粒的大小将它们分离开来。
凝胶过滤常用于分离生物样品中的某些组分，用于去除高分子量杂质、富集目标分子或净化样品。
常见的凝胶材料包括琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶和硅凝胶等，选择适当的凝胶材料取决于待分离的分子或颗粒的大小范围和特性。
凝胶层析技术(凝胶过滤)
四、凝胶层析的特点
1、凝胶是一种不带电荷的惰性物质，本身不 会与被分离物质相互作用，分离效果好，重 复性高。 2、设备简单，操作简便。
五、影响凝胶层析的因素
（一）凝胶的选择： （二）凝胶粒度对分离效果的影响 40-60目为粗粒。 100-200目为细粒（应用较多）能使洗脱曲线的峰区变得对 称和狭窄。 250-400目为最细粒。 （三）洗脱流速对分离效果的影响： 一般采用流速在30-200ml/小时，过快会使色层谱变形。 （四）离子强度和附值 （五）样品液体积对分离效果的影响 通常样品液体积约为凝胶床总体积的5-10%。 （六）凝胶柱的长度，直径和分离效果的关系 （七）Vo和Vi
其结构如图：
由右旋葡萄糖单位通过1.6-糖苷键连结成链状结构，再由 3-氯-1,2-环氧丙烷（Cl-CH2-CH-CH2）作交联剂而形成 的多孔网状结构的高分子 、 （1）凝胶在使用前必须在过量的溶剂中充分地 膨胀，否则影响层析的均一性，甚至使柱破裂， 自然溶解需24小时以上，加热至沸需2小时即可。 （2）用倾斜法除去混杂的小颗粒，重复2-3次。 2、凝胶的装填 、 装柱是凝胶层析中最重要的一步操作。 a.将柱垂直安装好 b.在柱内先装入1/5的水，用玻棒搅拌凝胶沿玻 棒倒下待凝胶开始沉降时，打开出口。凝胶床 必须装得均匀，尽量一次装完，以免出现不均 匀的凝胶带，因此，在装柱时需打开下口，并 调节适当的流速。 c.连接恒压洗脱瓶，平衡流速，开始流速不能 太大，应低于层析时所需的流速。 d.经平衡后的凝胶床顶部留下1ml左右的液体。 关闭出口管上的螺旋夹。
小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外还可进入凝胶颗粒的微孔之中因此在向下移动的过程中它们先从凝胶内扩散至颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒这样不断进入和扩散必然使小分子物质的下移速度落后于大分子物质从而使样品中分子大小不同的物质流出柱外而得到分离
凝胶过滤及离子交换层析介质详解
温度控制
温度对分离效果也有一 定影响，可以通过控制 实验温度来优化分离效 果。
案例分享：成功应用案例剖析
案例一
使用琼脂糖凝胶成功分离大分子蛋白质混合物，通过优化流动相和洗脱条件，实现了高 纯度蛋白质的获取。
案例二
应用离子交换层析技术成功分离了复杂样品中的痕量金属离子，通过选择合适的离子交 换树脂和优化实验条件，提高了分离效果和检测灵敏度。
现状
目前，凝胶过滤层析介质已经广泛应用于生物大分子的分离纯化，如蛋白质、酶、多糖等。同时，随着技术的不 断进步，新型凝胶过滤层析介质不断涌现，为生物分离领域提供了更多的选择。
应用领域与前景
要点一
应用领域
凝胶过滤层析介质在生物医药、生物工程、食品科学等领 域具有广泛的应用。例如，在生物医药领域，可用于药物 的分离纯化、蛋白质组学研究、抗体药物研发等；在生物 工程领域，可用于基因工程产物的分离纯化、酶工程产物 的分离纯化等；在食品科学领域，可用于食品添加剂的分 离纯化、功能性食品的研发等。
对未来发展趋势进行预测
层析技术的创新与应用拓展
随着科学技术的不断发展，层析技术将继续创新并拓展应用领域。例如，开发新型高效层析介质、优化层析条件、提 高分离效率等。
与其他技术的联合应用
层析技术可以与多种其他技术联合应用，如质谱、光谱等，实现复杂样品的高效分离和检测。这种联合应用将在未来 得到更广泛的关注和应用。
在生物医药等领域的应用前景
生物医药等领域对高纯度、高活性物质的需求不断增加，层析技术作为一种重要的分离纯化方法，将在 这些领域发挥越来越重要的作用。
THANKS
感谢观看
03
离子交换层析介质
根据目标离子的电荷性质和大小，选择合适的离子交换树脂，如阳离子
温度对分离效果也有一 定影响，可以通过控制 实验温度来优化分离效 果。
案例分享：成功应用案例剖析
案例一
使用琼脂糖凝胶成功分离大分子蛋白质混合物，通过优化流动相和洗脱条件，实现了高 纯度蛋白质的获取。
案例二
应用离子交换层析技术成功分离了复杂样品中的痕量金属离子，通过选择合适的离子交 换树脂和优化实验条件，提高了分离效果和检测灵敏度。
现状
目前，凝胶过滤层析介质已经广泛应用于生物大分子的分离纯化，如蛋白质、酶、多糖等。同时，随着技术的不 断进步，新型凝胶过滤层析介质不断涌现，为生物分离领域提供了更多的选择。
应用领域与前景
要点一
应用领域
凝胶过滤层析介质在生物医药、生物工程、食品科学等领 域具有广泛的应用。例如，在生物医药领域，可用于药物 的分离纯化、蛋白质组学研究、抗体药物研发等；在生物 工程领域，可用于基因工程产物的分离纯化、酶工程产物 的分离纯化等；在食品科学领域，可用于食品添加剂的分 离纯化、功能性食品的研发等。
对未来发展趋势进行预测
层析技术的创新与应用拓展
随着科学技术的不断发展，层析技术将继续创新并拓展应用领域。例如，开发新型高效层析介质、优化层析条件、提 高分离效率等。
与其他技术的联合应用
层析技术可以与多种其他技术联合应用，如质谱、光谱等，实现复杂样品的高效分离和检测。这种联合应用将在未来 得到更广泛的关注和应用。
在生物医药等领域的应用前景
生物医药等领域对高纯度、高活性物质的需求不断增加，层析技术作为一种重要的分离纯化方法，将在 这些领域发挥越来越重要的作用。
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03
离子交换层析介质
根据目标离子的电荷性质和大小，选择合适的离子交换树脂，如阳离子
第九章 凝胶过滤及
据实验技术 据固定相的形状不同 据流动相的物态不同 按操作方式不同
低压色谱 中压色谱 高压色谱 电泳
柱色谱 纸色谱 薄层色谱
气相色谱 液相色谱 超临界流体色谱
迎头法
顶替法
洗脱法
凝胶层析分类
特征
吸附力不同 各物质与固定相之间的离子交换能力的不同 各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同 各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不同 巯基化合物的巯基与固定相表面的二硫键作用力不同 各物质在两液相间的分配系数不同 各物质的分子大小或形状不同 利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不同
60年代末，70年代初，高效液相色谱仪的研制成功， 使色谱实现机械化、自动化操作，提高了操作的 复现性。这类全自动的生产规模级的层析系
统（如 瑞典Pharmacia com.的BioprocessⅠ、）， 能高速处理大量样品，流速从4-20L/h到40400L/h，能满足各类规模生产的需要。他们的填 料特点是：
第三节 凝胶过滤介质的主要品种
一、葡聚糖系列 Sephadex
1、结构 以氯代环氧丙烷 进行交联的葡聚糖 珠状凝胶，孔径大 小取决交联度。按 孔径不同形成G系 列凝胶。
葡聚糖结构
G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度，也 代表持水量。X数字越小，交联度越大，网孔越小， 适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联 度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品。X
Sephadex G-75 superfine 3000-70000 10-40 Sephadex G-100 4000-150000 40-120 较大蛋白
的分离 Sephadex G-100 superfine 4000-100000 10-40 Sephadex G-150 5000-300000 40-120 大蛋白的
凝胶过滤与分配层析
凝胶过滤与分配层析一、凝胶过滤凝胶过滤是一种基于分子大小不同的分离技术，通过将样品溶液通过装有凝胶颗粒的柱子，根据分子大小不同，样品中的组分被分离。
凝胶颗粒的孔径可以控制，从而可以选择性地保留或排除特定大小的分子。
凝胶过滤主要用于蛋白质、DNA等生物分子的分离和纯化。
凝胶过滤的原理是：样品溶液通过装有凝胶颗粒的柱子时，分子较大的物质由于不能进入凝胶颗粒的微孔而被排斥在外，最先流出柱子；而分子较小的物质则能进入凝胶颗粒的微孔，从而被滞留在了柱子的内部。
随着淋洗液的不断流过，小分子物质会逐渐被带出柱子，而大分子物质则被不断洗脱。
凝胶过滤的应用领域广泛，如生物制药、生物化学、分子生物学等领域。
它是一种简单、快速、有效的分离方法，尤其适用于分离大分子物质。
然而，凝胶过滤的分离效果受多种因素影响，如样品浓度、柱子的长度和直径、淋洗液的性质等。
二、分配层析分配层析是一种利用样品中各组分在固定相和流动相之间的分配系数不同的原理进行分离的技术。
样品溶液通过装有固定相和流动相的层析柱时，各组分在两相之间进行分配。
由于不同组分在固定相和流动相之间的分配系数不同，因此它们在层析柱中的移动速度也不同，从而达到分离的目的。
分配层析的原理是：样品溶液中的各组分在固定相和流动相之间进行分配，根据其在两相之间的分配系数不同，其移动速度也不同。
固定相是层析柱中的固体部分，流动相则是通过层析柱的液体部分。
样品溶液通过层析柱时，组分会根据其分配系数在两相之间进行动态分配，从而实现分离。
分配层析的应用领域广泛，如化学、生物化学、药物化学等领域。
它具有分离效果好、分辨率高、操作简单等优点。
然而，分配层析的分离效果受固定相和流动相的性质、层析柱的长度和直径等因素影响。
三、固定相和流动相在凝胶过滤和分配层析中，固定相和流动相都是影响分离效果的重要因素。
固定相是层析柱中的固体部分，用于吸附样品中的组分；流动相则是通过层析柱的液体部分，用于将组分从固定相中洗脱出来。
凝胶过滤层析法
4、衍生系：在经典葡聚糖凝胶的基础上，引入特殊基团后生成葡聚糖凝胶的衍生系，主要有LH系，如以G25为母体引入羟丙基成LH20，以G50为母体引入羟丙基成为LH60。特点是LH系除具有凝胶过滤的作用外，同时具有分配层析及吸附层析的作用。
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Sephadex经改性后比其母体具有更广泛的用途，适用于脂类、甾类、脂肪酸、激素、维生素及其他小分子的分级分离。
10
15-20
72
5
150
5000-400000
1000-150000
15
20-30
72
5
200
5000-800000
1000-200000
20
30-40
72
5
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Sephadex的型号及性能
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3、主要用途：孔径较小的凝胶主要用于脱盐、肽与其他小分子的分离；孔径较大的凝胶用于蛋白质与其他大分子的分离。DNA级的Sephadex适用于DNA或低聚核苷酸的分离。
峰宽：峰的基线宽度，通过层析峰两侧拐点作切线交于基线上的距离。
标准差：样品组分被带出层析柱的分散度，用σ表示。两侧拐点之间的距离为2个标准差。
Wb=4 σ=1.699W1/2
W1/2=2.354 σ
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保留值：表示样品中各组分在层析柱中停留时间的长短或组分流出时所需流动相体积的大小。
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Sephacryl系列产品性能
第28页/共82页
(五)、Superdex系列产品 是最新的凝胶过滤介质，属BioProcess介质中的一种。是将葡聚糖以共价键方式结合到高交联的多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。是将交联葡聚糖优良的过滤选择性及高交联的琼脂糖的物理化学稳定性集于一身的具有优良选择性和高分辨率的产品。可在0.1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液中40℃处理400小时而分辨率保持不变。
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Sephadex经改性后比其母体具有更广泛的用途，适用于脂类、甾类、脂肪酸、激素、维生素及其他小分子的分级分离。
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Sephadex的型号及性能
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3、主要用途：孔径较小的凝胶主要用于脱盐、肽与其他小分子的分离；孔径较大的凝胶用于蛋白质与其他大分子的分离。DNA级的Sephadex适用于DNA或低聚核苷酸的分离。
峰宽：峰的基线宽度，通过层析峰两侧拐点作切线交于基线上的距离。
标准差：样品组分被带出层析柱的分散度，用σ表示。两侧拐点之间的距离为2个标准差。
Wb=4 σ=1.699W1/2
W1/2=2.354 σ
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保留值：表示样品中各组分在层析柱中停留时间的长短或组分流出时所需流动相体积的大小。
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Sephacryl系列产品性能
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(五)、Superdex系列产品 是最新的凝胶过滤介质，属BioProcess介质中的一种。是将葡聚糖以共价键方式结合到高交联的多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。是将交联葡聚糖优良的过滤选择性及高交联的琼脂糖的物理化学稳定性集于一身的具有优良选择性和高分辨率的产品。可在0.1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液中40℃处理400小时而分辨率保持不变。
生化实验报告凝胶过滤
一、实验目的1. 理解凝胶过滤的原理和操作步骤。
2. 掌握凝胶过滤在蛋白质分离纯化中的应用。
3. 通过实验验证凝胶过滤的分离效果。
二、实验原理凝胶过滤，又称分子筛层析，是一种基于分子大小差异的分离技术。
层析柱内填充带有小孔的凝胶颗粒，凝胶颗粒的孔径大小不同。
当含有不同大小蛋白质的混合溶液通过层析柱时，小分子蛋白质能够进入凝胶颗粒的孔隙中，从而在层析柱中停留时间较长；而大分子蛋白质则无法进入孔隙，在层析柱中的停留时间较短。
因此，不同大小的蛋白质得以分离。
三、实验材料1. 蛋白质混合样品（如血红蛋白、肌红蛋白等）2. 凝胶过滤柱（如Sephadex G-75）3. 缓冲液（如磷酸盐缓冲液）4. 离心机5. 分光光度计6. 移液器7. 玻璃棒8. 实验记录表格四、实验步骤1. 柱的制备：将凝胶过滤柱垂直放置，用缓冲液充分洗涤，去除凝胶颗粒表面的杂质。
2. 样品的制备：取一定量的蛋白质混合样品，用缓冲液稀释至适当的浓度。
3. 样品的加载：将样品缓慢加入层析柱的顶部，使其自然流下。
4. 洗脱：用缓冲液以恒定流速（如1 mL/min）洗脱层析柱，收集洗脱液。
5. 检测：使用分光光度计检测洗脱液中的蛋白质含量，记录不同洗脱峰的位置和峰面积。
6. 收集：根据蛋白质含量变化，收集不同洗脱峰的蛋白质溶液。
五、实验结果与分析1. 洗脱曲线：根据洗脱曲线，可以观察到不同大小的蛋白质在层析柱中的洗脱顺序。
通常，小分子蛋白质先被洗脱，而大分子蛋白质后被洗脱。
2. 蛋白质分离效果：通过比较不同洗脱峰的峰面积，可以评估凝胶过滤的分离效果。
峰面积越大，说明蛋白质含量越高，分离效果越好。
六、实验讨论1. 凝胶过滤是一种高效、简便的蛋白质分离纯化方法，广泛应用于生物化学和分子生物学领域。
2. 凝胶过滤的分离效果受到凝胶类型、柱径、流速等因素的影响。
在实际应用中，需要根据具体实验目的和样品特性选择合适的凝胶类型和操作条件。
3. 凝胶过滤可以与其他分离技术（如SDS-PAGE、电泳等）联合使用，进一步提高蛋白质的分离纯化效果。
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系列名称
分离范围 颗粒大小
应用
Superdex prep grade系列
Superdex 30PG 小于10000 24~44微米
小肽
Superdex 75PG 3000~70000 24~44微米 一般蛋白
Superdex 200PG 10000~600000 24~44微米 单抗、大分子蛋白
LH系列的用途：
①用于有有机溶剂的凝胶过滤②结合了凝胶过滤、分配色 谱和吸附层析的特点，适用于其他凝胶难处里的样品， 能分离结构非常相似的分子。③排阻极性与母体凝胶相 同。④高负载长寿命，高分辨率，可载样300mg/g gel。
（书本P167列出了它们的性能参数）
二、琼脂糖系列
琼脂糖凝胶（agarose gel）由经过纯化琼脂糖制 备的。可以分离葡聚糖凝胶和生物胶所不能分离的大分 子，使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和病毒颗粒， 其最大范围可达相对分子质量108，但是由于琼脂有强 烈的吸附作用，给使用造成了困难，后来，从琼脂中分 离出两个组分，一个组分为带负电荷的琼脂果胶，含有 磺酸基和羧基；另一组分叫琼脂糖，它不含有带电基团， 其结构为：β-D-吡喃半乳糖和3，6脱水-L-吡喃半乳糖 相结合的链状多糖。
Sephadex G-75 superfine 3000-70000 10-40 Sephadex G-100 4000-150000 40-120 较大蛋白
的分离 Sephadex G-100 superfine 4000-100000 10-40 Sephadex G-150 5000-300000 40-120 大蛋白的
复性较好，体
阶段
积不受限
亲和色谱 聚焦色谱
生物大分子与配体 分 辨 力 很 高 ， 一种配体只 适合纯花的各个 之间有特殊亲和力 流 速 快 ， 容 量 能用于一种 阶段
大 ， 体 积 不 受 生物大分子 限
等 电 点 和 离 子 交 换 分 辨 力 高 ， 流 进口试剂昂 纯化的后阶段
作用
速快，容量大 贵
Superose系列
Superose 6 PG 5000~5000000 20-40微米 蛋白、多糖、核酸、病
毒
Superose 12 PG 1000~300000 20-40微米 蛋白、多糖、核酸
Sephacryl HR系列
Sephacryl S-100 1000~10000 25-75微米 肽类、小蛋白
疏水性
优点
缺点
适用范围
操 作 简 便 ， 分 易受离子干 大量样品处理 辨率高，流速 扰 快，容量高
分 辨 力 中 等 ， 各种凝胶介 适合脱盐，去热 不 会 引 起 变 性 ，质昂贵，处 源和纯化的最后 流 速 低 ， 容 量 理量有限制 步骤 有限
分 辨 力 高 ， 重 影响因子多 适合纯花的各个
基团。
3、介质内孔径大小分布均匀，孔径分布要窄，才能保证 分离效果好。
4、凝胶珠大小均匀，均一性好。细粒填料能提高柱效。 5、机械强度高，易于消毒，能反顾使用。
三、凝胶介质的种类
主要为人工合成大分子和天然多糖类
1、多糖类骨架 这类多糖有纤维素、葡聚糖和琼脂糖
这类介质生物相容性好，亲水性强，不会导致生物分 子变性失活。由琼脂糖和葡聚聚合而成的糖新一代 复合凝胶——Superdex高效过滤介质，使生产效率 进一步提高，从小规模过滤延伸到大规模生产。
Sephadex G-50 medium 1500-30000 50-150
Sephadex G-50 fine 1500-30000 20-80
Sephadex G-50 superfine 1500-30000 10-40 Sephadex G-75 3000-80000 40-120 一般蛋白的分离
第三节 凝胶过滤介质的主要品种
一、葡聚糖系列 Sephadex
1、结构 以氯代环氧丙烷 进行交联的葡聚糖 珠状凝胶，孔径大 小取决交联度。按 孔径不同形成G系 列凝胶。
葡聚糖结构
G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度，也 代表持水量。X数字越小，交联度越大，网孔越小， 适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联 度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品。X
量相近的介质。组分多，大小分布广的样品应选分离范 围广的介质；成分简单的样品选择分辨率高的凝胶。 如需处理大量样品，要选择粒度较大，流速较快的介 质，要精细分离的，选粒度小分辨率高的介质。
装柱：均匀搅拌一次倒入柱中，不能有气泡和分层。为 确保柱效，可用1%丙酮、兰色葡聚糖等测定柱效。
加样：不能冲动凝胶表层，每次控制样品5%V。体积小 分辨率高。为减少非特异性吸附，可在缓冲液中加一 定浓度的盐，0.1-0.2M NaCl。
分离 Sephadex G-150 superfine 5000-150000 10-40 Sephadex G-200 5000-600000 40-120 大蛋白的
分离 Sephadex G-200 superfine 5000-250000 10-40
四、凝胶过滤注意事项 凝胶过滤常用于下游产品最终纯化步骤。 填料选择：根据样品中组分情况，选择分离范围与分子
Sephacryl S-200 5000~250000 25-75微米 一般蛋白
Sephacryl S-300 10000~1500000 25-75微米 抗体等较大蛋白
Sephacryl S-400 ~28000000 25-75微米 多糖、蛋白多糖、脂质体
Sephacryl S-500 ~60000000 25-75微米 <1078bp的DNA片断
2、合成大分子骨架介质
这类介质有聚丙烯酰胺类、聚乙烯醇系和含羟甲基酰 胺类等。克服了天然介质易受微生物侵蚀的缺点， 保留了多糖骨架亲水的优点。
3、天然大分子与合成高聚物构成混合骨架的介质 既亲水抗微生物侵蚀，又有很好的生物相容性和刚性。
分类原则
类型
据溶质分子与固定相相互 作用的机理不同
吸附色谱 离子交换色谱 疏水作用层 金属螯合色谱 共价作用色谱 分配色谱 凝胶过滤 亲和色谱
60年代末，70年代初，高效液相色谱仪的研制成功， 使色谱实现机械化、自动化操作，提高了操作的 复现性。这类全自动的生产规模级的层析系
统（如 瑞典Pharmacia com.的BioprocessⅠ、）， 能高速处理大量样品，流速从4-20L/h到40400L/h，能满足各类规模生产的需要。他们的填 料特点是：
Sephadex G-25 medium 1000-5000 50-150
Sephadex G-25 fine 1000-5000 20-80
Sephadex G-25 superfine 1000-5000 10-40 Sephadex G-50 coarse 1500-30000 100-300 小蛋白、多肽 的分离
第九章 凝胶过滤及离子交换层析介质
广东省韶关学院生物科学系
第一节 概 述
自茨维特 1903年发明色谱法以来，该方法已经广泛 用于生物分子的分析分离与制备。在蛋白质、多 糖、天然产物的分离纯化与除热源等方面得到了 广泛的应用。
其中的填料——色谱介质，是决定色谱分离效果的 主要、最重要的因素。
目前，各个国家的许多公司，均有专门的色谱出售。 有的用于分析效果好，有的适合大规模制备使用。
④机械强度 各种G系列凝胶均有一定机械强度，能承受 一定压力，机械强度大小取决于交联度。
Hale Waihona Puke 3、主要用途小孔径凝胶用于脱盐与小分子分离，大孔径凝胶用于蛋白 质、核酸等大分子分离。
4、衍生物
葡聚糖结构中引入-CH2-OH（羟丙基）即成为LH系列凝胶。 引入磺乙基（SE-Sephadex）、羧甲基（CM-Sephadex） 及二乙胺基乙基（DEAE-Sephadex A）等。用途更广，可 用于脂类，激素和维生素等小分子分离，也适用于有机 溶剂和极性有机溶剂缓冲液。
1、适用于实验室和大规模生产，重现性高。 2、易清洗、消毒和再生，理化性质稳定，使用寿命
长。 3、易装柱，高工作容量，高流速，利于工业化生产。
1975年Small提出了离子交换色谱法，1981年 Jorgenson创立了毛细管电泳法。
20世纪90年代后，出现的扩张床吸附技术，通 过一步纯化，达到萃取、浓缩和初步纯化的 目的，所用的填料是STREAMLINE介质—— 一种以Sepharose为基架的介质。
Sepharose 2B 70000~40000000 60-200微 米 大分子复合物 Sepharose 4B 60000~20000000 45-165微 米 病毒等大分子 Sepharose 6B 10000~4000000 45-165微 米 大分子
Sephadex LH系列 Sephadex LH20 100-4000 30-100微米 天然产物 Sephadex LH60 400-20000 40-120微米 天然产物 Sephadex系列 Sephadex G-10 小于700 40-120 Sephadex G-15 小于1500 40-120 Sephadex G-25 coarse 1000-5000 100-300 脱盐及更换缓冲 液用
常用于脱盐和分级分离。分级分离是将分子大小相近的物 质分开，且要选择合适的凝胶，单次上样量小，一般为 床柱体积的5%-10%。分子大小彼此相差25%的样品， 只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开
二、凝胶介质应具备的条件
优良的凝胶介质是获得良好分离效果的前提，介质必须：
1、惰性材质，不与溶质和溶剂反应。 2、没有或极少的非特异性吸附，提高回收率。消除带电
操作压力小于0.5 MPa 操作压力在0.5～5 MPa之间 操作压力在5～40 MPa之间 溶质分子在电场中的移动速度不同