凝胶过滤层析
第五章 凝胶过滤层析
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
三、凝胶过滤的有关理论问题 ㈠ 凝胶介质的多孔结构和凝胶柱的体积参数 凝胶过滤介质是由多聚物交联形成的具有三维网状结构的 颗粒。 凝胶柱的体积参数包括： 总柱床体积（total volume, Vt），是凝胶经溶胀、装柱、 沉降，体积稳定后所占据层析柱内的总体积； 外水体积（outer volume, V0），是柱中凝胶颗粒间隙的液 相体积的总和； 内水体积（inner volume, Vi），是存在于溶胀后的凝胶颗 粒网孔中的液相体积的总和； 凝胶体积（gel volume, Vg），又称支持物基质体积 （matrix volume of the support, Vs）或干胶体积，是凝胶 颗粒固相所占据的体积，
第五章 凝胶过滤层析 第三节 凝胶过滤介质
一、凝胶过滤介质的基本结构 凝胶介质的基本结构都是具有多孔网状结构的水不溶性多 聚物。 理想的凝胶过滤介质必须符合以下条件： （1）有较强的机械稳定性，能满足层析过程所需流速， 在其标称的操作压力范围内不发生体积变化； （2）高化学稳定性，凝胶颗粒对分离过程中常用的试剂 和样品都保持惰性，在很宽的pH范围内保持稳定，耐去 污剂、有机溶剂，耐高温，从而方便清洗和消毒灭菌； （3）球形，颗粒直径均匀，呈现亲水性； （4）不带电荷，不对样品产生吸附作用。
第五章 凝胶过滤层析 第一节 概 述
凝胶过滤具有的优势 : （1）凝胶介质不带电荷，具有良好的稳定性，分离条件温 和，回收率高，重现性好； （2）通常情况下，溶液中存在各种离子、小分子、去污剂、 表面活性剂、蛋白变性剂等不会对分离产生影响，层析还能 在不同pH、温度下进行； （3）应用范围广，能分离的物质相对分子质量的覆盖面 宽，从几百到数百万，因此既适用于分子量较低的寡糖、寡 肽、聚核苷酸等生物小分子的分离，也适用于蛋白质、多糖、 核酸等大分子物质的纯化； （4）设备相对简单、易于操作、分离周期短、连续分离时 层析介质不需再生即可反复使用。
凝胶过滤层析
C. Sephadex G-150（分级范围， 5,000-400,000 D）
凝胶粒度的影响
凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱 流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒 凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐 等。 在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μ m左右较合适。对于在水中 保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μ m左右。凝胶颗粒大小 要均匀，这样流速稳定，效果较好
层析柱 （ a ）自制简易层祈柱（ 1 ．玻璃 管；2.橡皮塞；3．尼龙网）； （b）普通商品柱； （c）双底板层析柱（1.洗脱液进 出口； 2. 多孔底板； 3 ．柱床； 4 ．恒温水进口； 5 ．恒温水出口； 6．可调节的塞子）
4、样品的准备
样品的粘度：粘度大产生介质吸附， 一般要求样品粘度小于0.01Pa· s
选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小 分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd=0， 小分子的Kd＝1。这样能取得最好的分离效果。
例题：从某蛋白质溶液（MW=5500D）中除去无机盐，应选择下 列哪种凝胶最合适？
A. Sephadex G-15（分级范围， <1,500 D） B. Sephadex G-25（分级范围，1000-5000 D）
凝胶过滤层析
定义
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层 析（size exclusion chromatography）、分子筛层 析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗 透层析（Gel Permeation Chromatography）
凝胶过滤层析
持柱床面平整；
洗脱时流速不可太快或太慢；
透析袋中的液体不可装满，否则会将透析袋
胀破。
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六、实验结果
磷酸盐的鉴定
试剂量
透析前杯内 蒸馏水 透析后杯内 蒸馏水
钼酸铵试剂
氨基萘酚磺酸试剂
反应结果
15滴 10滴
2滴 2滴
3滴 3滴
无 蓝色
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蛋白质的鉴定
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实验八
凝胶过滤分离高铁血红蛋白与 高铁氰化钾及透析技术
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一、实验目的
掌握凝胶层析的原理
通过血红蛋白脱盐实验，初步掌握凝 胶层析技术 了解凝胶层析的应用
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二、实验原理
凝胶过滤层析：
是利用具有网状结构凝胶的分子筛作用， 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离，也称分子筛层析、排阻层析。
层析管洗净、排出管中气泡
关闭出口
固定在铁架上 加入缓冲液没过砂芯
关闭出口
将凝胶缓缓注入管内
打开出口
自然沉降至柱床高度达20cm左右 不可露出床面 盖滤纸
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装柱要求:
连续
均匀 无气泡
无分层
床面平整
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3. 平衡
层析柱稳定后接储液瓶，打开出 口，用两倍于床体积的缓冲液洗脱平 衡(5-10min )，不可露出床面，关闭 出口
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蛋白质的鉴定
试液量 透析前杯内蒸 馏水 透析后杯内蒸 馏水 透析袋内溶液 15%三氯醋酸 反应结果
40滴 40滴 10滴
凝胶过滤层析简介
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
柱的选择 柱的装填
同样直径的层析柱 同样长度的层析柱 同样体积的层析柱 理想的层析柱
长层析柱比短的分辨率高； 直径大的比小的分辨率高； 层析柱长的比短的分辨率高。 直径与长度之比是1：25-1：100
常用的支持物有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃等。 空柱中应留约1/5的水或溶剂。 不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。
测定分子量
当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。
0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。
|分类与性质
凝胶
分类性质
凝 胶 含大量液体的具三维网状开孔弹性结构的多聚体结构，
一般制成球状颗粒。
性
能 多孔、亲水、惰性、稳定、色谱性能好
凝胶过滤层析技术
凝胶过滤层析技术 content
凝胶过滤的基本原理
凝胶分类与性质 凝胶过滤的基本操作
凝胶过滤层析的应用
|基本原理
原理
分子
洗脱体积
分配系数
凝胶过滤法又称为分子筛层析、凝胶 层析或排阻层析,是利用凝胶 的网状结构根据分子大小进 行分离的一种方法。凝胶过
Services 滤所用的介质是由交联葡萄
| 基本操作
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
凝胶再生 凝胶保存
仅使用过一次的凝胶柱，通常进行更新平衡后 即可再次使用； 湿法：洗净的凝胶悬浮于蒸馏水和缓冲液中，应加入 适量的防腐剂如氯仿、0.05％NaN3或20％乙醇等，不 先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲液进行 然微生物将生长。 平衡，平衡毕，即可重复使用 干法：用浓度逐步升高的乙醇洗净凝胶，使其脱水收 把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理 缩，再抽干乙醇，用60-80℃的暖风吹干，在室温下 方法进行，处理后重新装柱即可再行使用 保存。 半缩法：是过度法，用60%-70%的乙醇使凝胶部分脱 水，然后封口，4 ℃保存。
凝胶过滤层析法
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Sephadex经改性后比其母体具有更广泛的用途，适用于脂类、甾类、脂肪酸、激素、维生素及其他小分子的分级分离。
10
15-20
72
5
150
5000-400000
1000-150000
15
20-30
72
5
200
5000-800000
1000-200000
20
30-40
72
5
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Sephadex的型号及性能
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3、主要用途：孔径较小的凝胶主要用于脱盐、肽与其他小分子的分离；孔径较大的凝胶用于蛋白质与其他大分子的分离。DNA级的Sephadex适用于DNA或低聚核苷酸的分离。
峰宽：峰的基线宽度，通过层析峰两侧拐点作切线交于基线上的距离。
标准差：样品组分被带出层析柱的分散度，用σ表示。两侧拐点之间的距离为2个标准差。
Wb=4 σ=1.699W1/2
W1/2=2.354 σ
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保留值：表示样品中各组分在层析柱中停留时间的长短或组分流出时所需流动相体积的大小。
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Sephacryl系列产品性能
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(五)、Superdex系列产品 是最新的凝胶过滤介质，属BioProcess介质中的一种。是将葡聚糖以共价键方式结合到高交联的多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。是将交联葡聚糖优良的过滤选择性及高交联的琼脂糖的物理化学稳定性集于一身的具有优良选择性和高分辨率的产品。可在0.1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液中40℃处理400小时而分辨率保持不变。
凝胶过滤层析原理
凝胶过滤层析原理凝胶过滤层析原理是一种生物化学技术，常用于对蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
它基于凝胶的选择性，通过分子大小和形状的差异来实现生物大分子的分离。
凝胶是一种多孔结构的凝胶体，通常由聚丙烯酰胺或琼脂糖等高分子物质组成。
凝胶过滤层析的原理就是将待分离样品加入到一层固定在糖凝胶基质上的膜中，再通过注入缓冲液使其在凝胶中进行迁移。
不同大小和形状的分子会在凝胶中通过不同的速度、途径和距离进行移动和分离。
在凝胶层析中，分子的迁移受到凝胶孔隙大小的限制。
孔隙越小，分子迁移的速度就越慢，分子会在凝胶中停留更长的时间。
因此，分子的分离程度取决于其分子大小和凝胶孔隙大小之间的差异。
凝胶层析可以分为两种类型：凝胶过滤层析和凝胶渗透层析。
凝胶过滤层析是利用凝胶基质孔隙大小的差异实现不同分子的过滤和分离。
较大的分子被阻挡在凝胶中，而较小的分子可以通过凝胶基质的孔隙，从而实现分离。
凝胶渗透层析则是利用凝胶基质孔隙中水合盖层的形成来实现分离。
分子在凝胶中形成水合物，而较大的分子受到水合盖层的阻挡，不能通过凝胶孔隙，从而停留在凝胶中。
较小的分子则可以通过凝胶孔隙，由于不形成水合物，迅速透过凝胶，实现分离。
凝胶层析可以通过调节凝胶孔隙大小来实现对不同大小分子的选择分离。
通过改变凝胶基质的组成、交联程度和浓度，可以调节凝胶的孔隙结构。
此外，还可以根据分子的分子量进行凝胶层析的选择性分离。
在凝胶层析中，常用的缓冲液是通过控制pH和离子浓度来维持凝胶中分子的稳定迁移。
较小的分子通常迁移速度较快，而较大的分子迁移速度较慢。
根据样品的性质，可以调节缓冲液的pH和离子浓度，以改变分子的迁移速度，实现更好的分离效果。
总之，凝胶层析通过凝胶基质的孔隙大小和水合盖层的形成来实现对生物大分子的分离和纯化。
凝胶过滤层析和凝胶渗透层析是其中两种常用的方法。
通过调节凝胶基质的孔隙结构和缓冲液的组成，可以实现对不同大小分子的选择性分离。
生化实验报告凝胶过滤
一、实验目的1. 理解凝胶过滤的原理和操作步骤。
2. 掌握凝胶过滤在蛋白质分离纯化中的应用。
3. 通过实验验证凝胶过滤的分离效果。
二、实验原理凝胶过滤，又称分子筛层析，是一种基于分子大小差异的分离技术。
层析柱内填充带有小孔的凝胶颗粒，凝胶颗粒的孔径大小不同。
当含有不同大小蛋白质的混合溶液通过层析柱时，小分子蛋白质能够进入凝胶颗粒的孔隙中，从而在层析柱中停留时间较长；而大分子蛋白质则无法进入孔隙，在层析柱中的停留时间较短。
因此，不同大小的蛋白质得以分离。
三、实验材料1. 蛋白质混合样品（如血红蛋白、肌红蛋白等）2. 凝胶过滤柱（如Sephadex G-75）3. 缓冲液（如磷酸盐缓冲液）4. 离心机5. 分光光度计6. 移液器7. 玻璃棒8. 实验记录表格四、实验步骤1. 柱的制备：将凝胶过滤柱垂直放置，用缓冲液充分洗涤，去除凝胶颗粒表面的杂质。
2. 样品的制备：取一定量的蛋白质混合样品，用缓冲液稀释至适当的浓度。
3. 样品的加载：将样品缓慢加入层析柱的顶部，使其自然流下。
4. 洗脱：用缓冲液以恒定流速（如1 mL/min）洗脱层析柱，收集洗脱液。
5. 检测：使用分光光度计检测洗脱液中的蛋白质含量，记录不同洗脱峰的位置和峰面积。
6. 收集：根据蛋白质含量变化，收集不同洗脱峰的蛋白质溶液。
五、实验结果与分析1. 洗脱曲线：根据洗脱曲线，可以观察到不同大小的蛋白质在层析柱中的洗脱顺序。
通常，小分子蛋白质先被洗脱，而大分子蛋白质后被洗脱。
2. 蛋白质分离效果：通过比较不同洗脱峰的峰面积，可以评估凝胶过滤的分离效果。
峰面积越大，说明蛋白质含量越高，分离效果越好。
六、实验讨论1. 凝胶过滤是一种高效、简便的蛋白质分离纯化方法，广泛应用于生物化学和分子生物学领域。
2. 凝胶过滤的分离效果受到凝胶类型、柱径、流速等因素的影响。
在实际应用中，需要根据具体实验目的和样品特性选择合适的凝胶类型和操作条件。
3. 凝胶过滤可以与其他分离技术（如SDS-PAGE、电泳等）联合使用，进一步提高蛋白质的分离纯化效果。
凝胶过滤层析
三 操作步骤
1 凝胶的选择和预处理 本实验样品中含有分子量差异不大的多中组 分，其中目的物为分子量60kd 的可溶性蛋白 质，因此属大分子化合物的分离纯化，故选 用SephadexG-75。对球形蛋白质而言，其排 阻限为3000-70000。 称取40g SephadexG-75，加入10倍以上吸液 量的蒸馏水浸泡，在水浴加热时充分膨胀。
三 操作步骤
4 样品预处理及加样 蛋白质样品浓度一般以不大于4%为宜，溶剂为洗脱液。 如样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后再上柱。 将床面多余的洗脱液除掉，吸至离层析床面2厘米处为止。 将出口打开，使床面的洗脱液流至1毫米，关闭出口。用 加样器将样品加入床表面1厘米左右，再打开出口，使样 品渗入凝胶内。样品加完后，用尽量少的洗脱液洗涤表 面1-2次。当样品完全渗入凝胶内后，再仔细加入洗脱液 至离床面3-4厘米处，即可接上洗脱瓶进行层析。
实验六 凝胶过滤层析
一 实验原理
凝胶层析是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相， 由于在层析过程中样品不同的蛋白质具有不同的洗脱， 使不同的分子量的组分得以分离的层析方法。凝胶层 析的分离过程是在装有多孔物质如交联聚苯乙烯、多 孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等填料的柱中进行的。 填料颗粒含有许多不同大小的孔隙。这些孔隙对于溶 剂分子而言是很大的，他们可以自由扩散出入。对于 溶质分子而言，如果分子大小合适时，则可以不同程 度地往孔隙中扩散，大分子量的溶质分子只能占有较 小的孔隙，而小分子量的溶质分子除能占住大孔隙外， 还可以占有另外一些起更小的孔隙。
一 实验原理
所以随着溶质分子尺寸的减小，其占有 孔隙体积迅速增加。当具有一定分子量 分布的高聚物溶液从柱中通过时，由于 溶质分子在孔隙中溶剂与颗粒溶剂之间 进行扩散分配的差异造成较小的分子在 柱中停留的时间比大分子停留的时间要 长，所以整个样品按分子大小顺序而分 开，最先洗脱出来是最大的分子。