凝胶过滤层析
第五章 凝胶过滤层析
第五章 凝胶过滤层析 第二节 原 理
三、凝胶过滤的有关理论问题 ㈠ 凝胶介质的多孔结构和凝胶柱的体积参数 凝胶过滤介质是由多聚物交联形成的具有三维网状结构的 颗粒。 凝胶柱的体积参数包括： 总柱床体积（total volume, Vt），是凝胶经溶胀、装柱、 沉降，体积稳定后所占据层析柱内的总体积； 外水体积（outer volume, V0），是柱中凝胶颗粒间隙的液 相体积的总和； 内水体积（inner volume, Vi），是存在于溶胀后的凝胶颗 粒网孔中的液相体积的总和； 凝胶体积（gel volume, Vg），又称支持物基质体积 （matrix volume of the support, Vs）或干胶体积，是凝胶 颗粒固相所占据的体积，
第五章 凝胶过滤层析 第三节 凝胶过滤介质
一、凝胶过滤介质的基本结构 凝胶介质的基本结构都是具有多孔网状结构的水不溶性多 聚物。 理想的凝胶过滤介质必须符合以下条件： （1）有较强的机械稳定性，能满足层析过程所需流速， 在其标称的操作压力范围内不发生体积变化； （2）高化学稳定性，凝胶颗粒对分离过程中常用的试剂 和样品都保持惰性，在很宽的pH范围内保持稳定，耐去 污剂、有机溶剂，耐高温，从而方便清洗和消毒灭菌； （3）球形，颗粒直径均匀，呈现亲水性； （4）不带电荷，不对样品产生吸附作用。
第五章 凝胶过滤层析 第一节 概 述
凝胶过滤具有的优势 : （1）凝胶介质不带电荷，具有良好的稳定性，分离条件温 和，回收率高，重现性好； （2）通常情况下，溶液中存在各种离子、小分子、去污剂、 表面活性剂、蛋白变性剂等不会对分离产生影响，层析还能 在不同pH、温度下进行； （3）应用范围广，能分离的物质相对分子质量的覆盖面 宽，从几百到数百万，因此既适用于分子量较低的寡糖、寡 肽、聚核苷酸等生物小分子的分离，也适用于蛋白质、多糖、 核酸等大分子物质的纯化； （4）设备相对简单、易于操作、分离周期短、连续分离时 层析介质不需再生即可反复使用。
凝胶过滤层析简介
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
柱的选择 柱的装填
同样直径的层析柱 同样长度的层析柱 同样体积的层析柱 理想的层析柱
长层析柱比短的分辨率高； 直径大的比小的分辨率高； 层析柱长的比短的分辨率高。 直径与长度之比是1：25-1：100
常用的支持物有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃等。 空柱中应留约1/5的水或溶剂。 不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。
测定分子量
当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。
0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。
|分类与性质
凝胶
分类性质
凝 胶 含大量液体的具三维网状开孔弹性结构的多聚体结构，
一般制成球状颗粒。
性
能 多孔、亲水、惰性、稳定、色谱性能好
凝胶过滤层析技术
凝胶过滤层析技术 content
凝胶过滤的基本原理
凝胶分类与性质 凝胶过滤的基本操作
凝胶过滤层析的应用
|基本原理
原理
分子
洗脱体积
分配系数
凝胶过滤法又称为分子筛层析、凝胶 层析或排阻层析,是利用凝胶 的网状结构根据分子大小进 行分离的一种方法。凝胶过
Services 滤所用的介质是由交联葡萄
| 基本操作
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
凝胶再生 凝胶保存
仅使用过一次的凝胶柱，通常进行更新平衡后 即可再次使用； 湿法：洗净的凝胶悬浮于蒸馏水和缓冲液中，应加入 适量的防腐剂如氯仿、0.05％NaN3或20％乙醇等，不 先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲液进行 然微生物将生长。 平衡，平衡毕，即可重复使用 干法：用浓度逐步升高的乙醇洗净凝胶，使其脱水收 把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理 缩，再抽干乙醇，用60-80℃的暖风吹干，在室温下 方法进行，处理后重新装柱即可再行使用 保存。 半缩法：是过度法，用60%-70%的乙醇使凝胶部分脱 水，然后封口，4 ℃保存。
凝胶过滤层析法
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Sephadex经改性后比其母体具有更广泛的用途，适用于脂类、甾类、脂肪酸、激素、维生素及其他小分子的分级分离。
10
15-20
72
5
150
5000-400000
1000-150000
15
20-30
72
5
200
5000-800000
1000-200000
20
30-40
72
5
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Sephadex的型号及性能
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3、主要用途：孔径较小的凝胶主要用于脱盐、肽与其他小分子的分离；孔径较大的凝胶用于蛋白质与其他大分子的分离。DNA级的Sephadex适用于DNA或低聚核苷酸的分离。
峰宽：峰的基线宽度，通过层析峰两侧拐点作切线交于基线上的距离。
标准差：样品组分被带出层析柱的分散度，用σ表示。两侧拐点之间的距离为2个标准差。
Wb=4 σ=1.699W1/2
W1/2=2.354 σ
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保留值：表示样品中各组分在层析柱中停留时间的长短或组分流出时所需流动相体积的大小。
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Sephacryl系列产品性能
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(五)、Superdex系列产品 是最新的凝胶过滤介质，属BioProcess介质中的一种。是将葡聚糖以共价键方式结合到高交联的多孔琼脂糖珠体上形成的复合凝胶。是将交联葡聚糖优良的过滤选择性及高交联的琼脂糖的物理化学稳定性集于一身的具有优良选择性和高分辨率的产品。可在0.1mol/LHCl或1mol/LNaOH溶液中40℃处理400小时而分辨率保持不变。
实验七、凝胶过滤层析
装柱的两种方法： a.手工操作
1/3床体积水→加入少许凝胶积起1-2 厘米凝胶床→打开出水口→连续缓慢 加入凝胶
b.电动搅拌下的装柱法
（如图4-9）
样品上柱
分析用量：柱床体积的1—2% 制备用量：柱床体积的20—30%
部分收集器的操作方法
1．将“手/自”框内的键置于自动状态，按“定”和 “停”;使定时时间为零，放开“停”按“快”或 “慢”(“定”仍按着)至所需的定时时间，放开"慢" 和“定”，再按一下"停"设定定时时间工作就完毕。 若要查看设置时间，则只需按一下“定”键，就能 显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则 需按下“秒”键。
先关闭层析柱出水口向柱管内加入约13柱容积的洗脱液然后边搅拌边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中使其自然沉降等凝胶沉降约23cm后打开柱的出口调节合适的流速使凝胶继续沉集待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱关闭出水口
实验七 凝胶过滤层析纯化细胞 色素C
一、目的要求
1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的 原理与方法。 2.通过凝胶过滤柱层析对细胞色素C进行纯 化
（四）加样 1.准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪 2.打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直 至与胶面相切。沿管壁将细胞色素C样品溶液1 mL小 心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下 口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当 样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样 操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次。最后加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连 通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液 口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连。 （五）洗脱 洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.025 mol/LTrisHCl，以每管3 mL/10 min流速洗脱，用自动部分收集 器收集流出液。
凝胶过滤层析原理
凝胶过滤层析原理凝胶过滤层析原理是一种生物化学技术，常用于对蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
它基于凝胶的选择性，通过分子大小和形状的差异来实现生物大分子的分离。
凝胶是一种多孔结构的凝胶体，通常由聚丙烯酰胺或琼脂糖等高分子物质组成。
凝胶过滤层析的原理就是将待分离样品加入到一层固定在糖凝胶基质上的膜中，再通过注入缓冲液使其在凝胶中进行迁移。
不同大小和形状的分子会在凝胶中通过不同的速度、途径和距离进行移动和分离。
在凝胶层析中，分子的迁移受到凝胶孔隙大小的限制。
孔隙越小，分子迁移的速度就越慢，分子会在凝胶中停留更长的时间。
因此，分子的分离程度取决于其分子大小和凝胶孔隙大小之间的差异。
凝胶层析可以分为两种类型：凝胶过滤层析和凝胶渗透层析。
凝胶过滤层析是利用凝胶基质孔隙大小的差异实现不同分子的过滤和分离。
较大的分子被阻挡在凝胶中，而较小的分子可以通过凝胶基质的孔隙，从而实现分离。
凝胶渗透层析则是利用凝胶基质孔隙中水合盖层的形成来实现分离。
分子在凝胶中形成水合物，而较大的分子受到水合盖层的阻挡，不能通过凝胶孔隙，从而停留在凝胶中。
较小的分子则可以通过凝胶孔隙，由于不形成水合物，迅速透过凝胶，实现分离。
凝胶层析可以通过调节凝胶孔隙大小来实现对不同大小分子的选择分离。
通过改变凝胶基质的组成、交联程度和浓度，可以调节凝胶的孔隙结构。
此外，还可以根据分子的分子量进行凝胶层析的选择性分离。
在凝胶层析中，常用的缓冲液是通过控制pH和离子浓度来维持凝胶中分子的稳定迁移。
较小的分子通常迁移速度较快，而较大的分子迁移速度较慢。
根据样品的性质，可以调节缓冲液的pH和离子浓度，以改变分子的迁移速度，实现更好的分离效果。
总之，凝胶层析通过凝胶基质的孔隙大小和水合盖层的形成来实现对生物大分子的分离和纯化。
凝胶过滤层析和凝胶渗透层析是其中两种常用的方法。
通过调节凝胶基质的孔隙结构和缓冲液的组成，可以实现对不同大小分子的选择性分离。
凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程
凝胶过滤层析进行蛋白纯化的流程引言：蛋白纯化是研究蛋白质结构和功能的关键步骤之一。
凝胶过滤层析是一种常用的蛋白纯化方法，通过分子大小的差异来分离和纯化目标蛋白。
本文将介绍凝胶过滤层析的流程及其应用。
一、凝胶过滤层析的原理凝胶过滤层析是基于分子大小的差异来分离蛋白的一种方法。
该方法利用特定的凝胶材料，通过将待纯化的蛋白溶液加入凝胶柱中，较大分子的蛋白无法渗透进入凝胶内部，而较小分子的蛋白则可以通过凝胶孔道进入凝胶内部。
通过这种方式，可以实现对蛋白的分离和纯化。
二、凝胶过滤层析的步骤1. 准备凝胶柱：选择适当的凝胶材料和柱子，根据待纯化蛋白的分子大小选择合适的孔径。
2. 杂质去除：使用缓冲液预先洗脱凝胶，去除其中的杂质和阻塞物。
3. 样品加载：将待纯化的蛋白溶液加载到凝胶柱中，注意保持柱子的垂直姿势，防止样品泄漏。
4. 洗脱：使用缓冲液进行洗脱，以去除非目标蛋白和杂质。
5. 收集纯化蛋白：将目标蛋白收集，可以使用分级洗脱或直接洗脱的方法。
三、凝胶过滤层析的优势和应用凝胶过滤层析具有以下优势：1. 无需特殊设备：相较于其他蛋白纯化方法，凝胶过滤层析不需要昂贵的设备，操作简单方便。
2. 高分辨率：凝胶过滤层析可以实现对不同分子大小的蛋白进行高效分离，得到高纯度的目标蛋白。
3. 适用范围广：凝胶过滤层析适用于各种类型的蛋白，包括酶、抗体、细胞因子等。
凝胶过滤层析在生物学研究中有广泛的应用，主要包括以下方面：1. 蛋白纯化：凝胶过滤层析是常用的蛋白纯化方法之一，可以用于从复杂的混合物中纯化目标蛋白。
2. 质量控制：凝胶过滤层析可以用于检测蛋白样品的分子大小和纯度，对蛋白质的质量进行评估。
3. 蛋白互作研究：凝胶过滤层析可以用于研究蛋白与其他分子（如核酸或小分子化合物）的相互作用。
4. 蛋白结构分析：凝胶过滤层析可以为蛋白的结构分析提供高纯度的样品。
结论：凝胶过滤层析是一种简单、快速且高效的蛋白纯化方法，通过分子大小的差异实现对目标蛋白的分离和纯化。
凝胶过滤层析
三 操作步骤
1 凝胶的选择和预处理 本实验样品中含有分子量差异不大的多中组 分，其中目的物为分子量60kd 的可溶性蛋白 质，因此属大分子化合物的分离纯化，故选 用SephadexG-75。对球形蛋白质而言，其排 阻限为3000-70000。 称取40g SephadexG-75，加入10倍以上吸液 量的蒸馏水浸泡，在水浴加热时充分膨胀。
三 操作步骤
4 样品预处理及加样 蛋白质样品浓度一般以不大于4%为宜，溶剂为洗脱液。 如样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后再上柱。 将床面多余的洗脱液除掉，吸至离层析床面2厘米处为止。 将出口打开，使床面的洗脱液流至1毫米，关闭出口。用 加样器将样品加入床表面1厘米左右，再打开出口，使样 品渗入凝胶内。样品加完后，用尽量少的洗脱液洗涤表 面1-2次。当样品完全渗入凝胶内后，再仔细加入洗脱液 至离床面3-4厘米处，即可接上洗脱瓶进行层析。
实验六 凝胶过滤层析
一 实验原理
凝胶层析是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相， 由于在层析过程中样品不同的蛋白质具有不同的洗脱， 使不同的分子量的组分得以分离的层析方法。凝胶层 析的分离过程是在装有多孔物质如交联聚苯乙烯、多 孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等填料的柱中进行的。 填料颗粒含有许多不同大小的孔隙。这些孔隙对于溶 剂分子而言是很大的，他们可以自由扩散出入。对于 溶质分子而言，如果分子大小合适时，则可以不同程 度地往孔隙中扩散，大分子量的溶质分子只能占有较 小的孔隙，而小分子量的溶质分子除能占住大孔隙外， 还可以占有另外一些起更小的孔隙。
一 实验原理
所以随着溶质分子尺寸的减小，其占有 孔隙体积迅速增加。当具有一定分子量 分布的高聚物溶液从柱中通过时，由于 溶质分子在孔隙中溶剂与颗粒溶剂之间 进行扩散分配的差异造成较小的分子在 柱中停留的时间比大分子停留的时间要 长，所以整个样品按分子大小顺序而分 开，最先洗脱出来是最大的分子。
凝胶过滤层析的原理
凝胶过滤层析的原理
凝胶过滤层析是用一定大小的凝胶柱作为分离介质，在固定相（吸附剂）和流动相之间加入适当的溶液，使两种组分通过柱时发生不同的作用而分离开来的一种分离方法。
凝胶是一种高分子聚合物，它具有多孔结构，大分子间可相互接触并可相互渗透，由于大分子间有氢键和离子键等相互作用，因此它们在溶液中很容易扩散。
大分子在流动相中是分散的，因此在流动相中它们很容易受到洗脱。
凝胶层析利用凝胶中所含的高分子聚合物（如蛋白质、多糖等）能吸附溶质分子而使其不能通过而在另一种溶液中析出的特性进行分离。
凝胶过滤层析是分离技术中最复杂、最难的方法之一，也是研究得最多、应用最广的方法之一。
蛋白质、多糖等大分子物质在流动相（如NaOH）中不能快
速通过大分子间的作用力而被吸附在柱上。
但当蛋白或多糖等大分子物质达到一定浓度时，大分子间的作用力就会减弱或消失，这时它就会通过柱，但这时由于上柱过程中水和溶质不能完全洗脱，所以就会有部分蛋白质或多糖留在柱上。
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C. Sephadex G-150（分级范围， 5,000-400,000 D）
凝胶粒度的影响
凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱 流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒 凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐 等。 在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μ m左右较合适。对于在水中 保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μ m左右。凝胶颗粒大小 要均匀，这样流速稳定，效果较好
层析柱 （ a ）自制简易层祈柱（ 1 ．玻璃 管；2.橡皮塞；3．尼龙网）； （b）普通商品柱； （c）双底板层析柱（1.洗脱液进 出口； 2. 多孔底板； 3 ．柱床； 4 ．恒温水进口； 5 ．恒温水出口； 6．可调节的塞子）
4、样品的准备
样品的粘度：粘度大产生介质吸附， 一般要求样品粘度小于0.01Pa· s
选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小 分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd=0， 小分子的Kd＝1。这样能取得最好的分离效果。
例题：从某蛋白质溶液（MW=5500D）中除去无机盐，应选择下 列哪种凝胶最合适？
A. Sephadex G-15（分级范围， <1,500 D） B. Sephadex G-25（分级范围，1000-5000 D）
凝胶过滤层析
定义
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层 析（size exclusion chromatography）、分子筛层 析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗 透层析（Gel Permeation Chromatography）
内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。
基质体积(Vg)是指凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积(Vt)就是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积
凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）
分配系数（Kd）
每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数
应用
凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多 肽、激素、多糖、核酸类等物质。
分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一 凝胶床就可以完全将它们分开。 利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液 进行脱盐、去热源和脱色。
原理
凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每 个颗粒犹如一个筛子。
带网孔的 葡聚糖珠
对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将 分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类 分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的物质加 以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后 者对实验条件和操作要求都比较高。
类分离
目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组”和“较小分子组” 两类物质，并不要求分离分子量相近的组分
特点：与被分离物质分子的大 小和凝胶颗粒孔隙的大小有关
Байду номын сангаас
Kd=0 0＜Kd<1 Kd=1
大分子量 小分子量
洗脱体积
典型的凝胶类型
交联葡聚糖凝胶：Sephadex������ 丙烯葡聚糖凝胶：Sephacryl ������ 琼脂糖凝胶：Sepharose和Bio-Gel������ 其它：有机凝胶Sepharon，交联聚醚 Toyopeal，纤维素凝胶，改性刚性填料等
凝胶过滤层析实验技术
1、凝胶的选择
2、凝胶的预处理 3、装柱
4、样品的准备
5、上样
6、洗脱和收集
7、凝胶的再生及保存
凝胶过滤层析实验技术
1、凝胶的选择
选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取 何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括 凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）、理化稳定性、强度、 非特异吸附性质等。
同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱的洗脱效果
2、凝胶的预处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24 小时以上或将干胶加入水里，边加边搅，然后放到 沸水浴中加热接近100℃，保持数个小时。根据干 凝胶的填充体积计算所需的干凝胶量 平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起 始缓冲液相同（使凝胶溶胀状态稳定）
3、装柱
一般选用细长的层析柱作凝胶过滤。进行类分离（如脱盐）时，柱高 50cm比较合适；分级分离时，100cm较为合适 具体步骤为： 将层析柱垂直固定，一般是先在柱内装入约1/3高度的水或缓冲液排走空 气； 将平衡好的凝胶搅匀，连续倾入柱中，待其自然沉降至1/4-1/3高时打开 下端出口，让溶剂慢慢流出，继续倒入凝胶至沉降到所需高度。 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液走柱，使凝胶介质充分平衡，柱床稳定 （若第一步采用起始缓冲液排空气则该步骤略）。
小分子进入 葡聚糖珠内
当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子 质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔 隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；
相对分子质量较小的物质可自由地进 出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移 动速率慢而最后流出层析柱。 中等大小的分子在大分子物质与小分 子物质之间被洗脱。 这样，经过层析柱，混合物中的各物 质按其分子大小不同而被分离。
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
固定相（凝胶）
三维空间网状结构
小分子
样品
分子筛效应： 按分子大小不同,在凝胶受到的阻滞 作用有差异,从而造成各组分在凝胶柱 中的迁移速度不同得到分离。
小分子 被延滯
固 定 相
流 动 相 大分子
较快流出
基本概念
外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒 间液体流动相的体积。
Ve=Vo+KdVi
(1)Ve = Vo，Kd = 0 分子完全被排阻于凝胶颗粒之外 全部分布于流动相里 最先流出 (2)Ve = Vo + Vi，Kd = 1 分子完全不被排阻 完全向凝胶颗粒内部扩散 在两相分配的比值为1,最后流出 (3) 0 <Kd <1，Ve = Vo +ViKd 为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩 散