凝胶过滤层析的分类
凝胶过滤层析
C. Sephadex G-150（分级范围， 5,000-400,000 D）
凝胶粒度的影响
凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱 流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒 凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐 等。 在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μ m左右较合适。对于在水中 保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μ m左右。凝胶颗粒大小 要均匀，这样流速稳定，效果较好
层析柱 （ a ）自制简易层祈柱（ 1 ．玻璃 管；2.橡皮塞；3．尼龙网）； （b）普通商品柱； （c）双底板层析柱（1.洗脱液进 出口； 2. 多孔底板； 3 ．柱床； 4 ．恒温水进口； 5 ．恒温水出口； 6．可调节的塞子）
4、样品的准备
样品的粘度：粘度大产生介质吸附， 一般要求样品粘度小于0.01Pa· s
选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小 分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd=0， 小分子的Kd＝1。这样能取得最好的分离效果。
例题：从某蛋白质溶液（MW=5500D）中除去无机盐，应选择下 列哪种凝胶最合适？
A. Sephadex G-15（分级范围， <1,500 D） B. Sephadex G-25（分级范围，1000-5000 D）
凝胶过滤层析
定义
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种。 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离，也被称为体积排阻层 析（size exclusion chromatography）、分子筛层 析（Molecular Sieve Chromatography）、凝胶渗 透层析（Gel Permeation Chromatography）
凝胶过滤层析简介
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
柱的选择 柱的装填
同样直径的层析柱 同样长度的层析柱 同样体积的层析柱 理想的层析柱
长层析柱比短的分辨率高； 直径大的比小的分辨率高； 层析柱长的比短的分辨率高。 直径与长度之比是1：25-1：100
常用的支持物有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃等。 空柱中应留约1/5的水或溶剂。 不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。
测定分子量
当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。 当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。
0＜Kd＜1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。
|分类与性质
凝胶
分类性质
凝 胶 含大量液体的具三维网状开孔弹性结构的多聚体结构，
一般制成球状颗粒。
性
能 多孔、亲水、惰性、稳定、色谱性能好
凝胶过滤层析技术
凝胶过滤层析技术 content
凝胶过滤的基本原理
凝胶分类与性质 凝胶过滤的基本操作
凝胶过滤层析的应用
|基本原理
原理
分子
洗脱体积
分配系数
凝胶过滤法又称为分子筛层析、凝胶 层析或排阻层析,是利用凝胶 的网状结构根据分子大小进 行分离的一种方法。凝胶过
Services 滤所用的介质是由交联葡萄
| 基本操作
凝胶
层析柱
加样洗脱
再生保存
凝胶再生 凝胶保存
仅使用过一次的凝胶柱，通常进行更新平衡后 即可再次使用； 湿法：洗净的凝胶悬浮于蒸馏水和缓冲液中，应加入 适量的防腐剂如氯仿、0.05％NaN3或20％乙醇等，不 先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲液进行 然微生物将生长。 平衡，平衡毕，即可重复使用 干法：用浓度逐步升高的乙醇洗净凝胶，使其脱水收 把凝胶倒出，用低浓度的酸或碱按其预处理 缩，再抽干乙醇，用60-80℃的暖风吹干，在室温下 方法进行，处理后重新装柱即可再行使用 保存。 半缩法：是过度法，用60%-70%的乙醇使凝胶部分脱 水，然后封口，4 ℃保存。
层析技术分离生物大分子(凝胶过滤)
4、标准曲线的制作 （1）用洗脱液配制标准蛋白溶液供全班使用，溶液中 二种蛋白的浓度各为：牛血清清蛋白（10mg/mL）、溶 菌酶蛋白（10mg/mL）。 按（3）的操作方法加入上述标准蛋白溶液0.5mL，以 3-5mL/10min的速度洗脱并收集洗脱液。 同时用核酸蛋白检测仪测定A280，并确定各种蛋白的 洗脱峰最高点，然后计算出两种标准蛋白的洗脱体积 Ve。 5、以A280为纵坐标，Ve为横坐标画出标准蛋白的洗脱 曲线。（电脑画出） 6、以Kav为横坐标，LogMr为纵坐标作标准曲线。 在标准曲线上查出未知蛋白的LogMr，其反对数便是待 测定蛋白质的分子质量。 注意：实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次 实验使用，严禁将凝胶丢弃或倒入水池中。
图例：
凝胶过滤曲线 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5 4.4 4.3 4.2 4.1 0 0.2 0.4 （Kav) 0.6 0.8 y = -0.9961x + 4.9165 R 2 = 0.9985
思考：SDS-PAGE和凝胶过滤分离蛋白质及测定分子量有 何不同？
(lgMR)
层析技术分离生物大分子
一、原理
分配系数
Ve – Vo Kav=
Vt - Vo Vt——层析床总体积 Ve——洗脱液体积 Vo——外水体积 分子量大，全排出 分子量中 分子量小，进入内部
Ve= Vo Ve= Vo+ KavVi Ve= Vo+ Vi
Kav=0 0< Kav<1 Kav=1
凝胶柱总体积（Vt）的测定： 在最后走样品后,距离胶柱上端作一个记号， 回收凝胶，关闭柱出水口，加入去离子水，打开 出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后 用量筒接受柱中去离子水（水面降至层析柱玻璃 筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt。
第七章 凝胶层析
一、凝胶的选择和处理 二、凝胶层析柱的设计和制备 三、凝胶层析操作 四、主要参数测算 五、凝胶层析的扩展
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一、凝胶的选择和处理
（一）凝胶的选择 (1).将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋
白质与盐类，称作类分离。
(2).将分子量相差不大的大分子物质加以分离， 如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分 离。
避免硼酸缓冲液
（二）架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL）
架桥琼脂糖凝胶为琼脂 线性分子经1，3-二溴丙 醇交联的凝胶。
它的凝胶孔径均匀，机 械强度明显加大。
对热和化学物质的稳定 性 大 大 增 加 , 在 pH3~14
范围内稳定。
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（三）超胶（Utro-gel ACA）
所谓超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。 商品名称后面的编号为两位数，各表示混合胶中聚
例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分 子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗 脱出来。
4. 分级分离范围
分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分 子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好 的线性分离。
例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为 3,000－70,000，它表示分子量在这个范围内的球形 蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。
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一、葡聚糖凝胶 (Sephadex)
1.结构
商品名为Sephadex G类 . 交联葡聚糖的基本骨架是葡
聚糖。 再经3-氯-1，2-环氧丙烷为
交联剂，形成三维网状结构 的高分子化合物。 其交联度是通过交联剂的加 量及反应条件来控制的。
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2 规格型号：
凝胶过滤和亲和层析
（二）、层析原理 1.以共价键将配位体与不溶性基质连接，制成层析床。 2.将欲分离样品加到柱上，与配位体有亲和性的大分子被保 留，其它直接流过。
3.改变洗脱剂组成，使吸附大分子解离和洗脱。
（三）、亲和层析的吸附剂 1、基质 1）、理想基质的性质 (1)不溶性基质应具备松散的多孔网络，大分子可以均匀和不 受阻碍地进出，并具有良好的流动性。 (2)凝胶颗粒应为规则球形，并具刚性，有利于流动和耐受静 压。 (3)基质的化学性质必须是惰性的，基质骨架与蛋白质等的反 应必须极弱以降低非特异 性结合吸附作用。 (4)凝胶的理化性质必须稳定，不因偶联配位体和吸附、洗脱 互补大分子所应用的条件而发生变化。 (5)基质必须有能活化或修饰的功能基，并且数量充足，以便 能偶联较多的配位体。
（七）、洗脱的流速
当洗脱的流速增加时，色谱的分辨率降低。 可根据不同的目的选择适合的流速。要求得到好分 辨率时，要采用长层析柱和慢流速。要得到快速分离，可 采用短层析柱和快流速。好分辨率与快速分离不可兼得。
（八）、优化
有时不是一次就可以得到很理想的分离条件，可通过优 化来选到。例如：
A : IgG, B: transferrine, C: α-chymotrypsinogen IgG与transferrin已无法在 保持好分辨率的情况下加 快洗脱速度。 Transferrine 和αchymotrypsinogen的分离可 以加快流速，分辨率仍可 为2.25。 如改变柱长，使分辨率为1， 柱长约为17cm，分离时间 由30小时变为35分钟。
亲和层析(affinity chromatography)
一、介绍
（一）、概念：亲和层析是利用配位体和大分子相互作用时 所固有的独特的生物学特性建立的一种吸附层析.
凝胶过滤层析原理
凝胶过滤层析原理凝胶过滤层析原理是一种生物化学技术，常用于对蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
它基于凝胶的选择性，通过分子大小和形状的差异来实现生物大分子的分离。
凝胶是一种多孔结构的凝胶体，通常由聚丙烯酰胺或琼脂糖等高分子物质组成。
凝胶过滤层析的原理就是将待分离样品加入到一层固定在糖凝胶基质上的膜中，再通过注入缓冲液使其在凝胶中进行迁移。
不同大小和形状的分子会在凝胶中通过不同的速度、途径和距离进行移动和分离。
在凝胶层析中，分子的迁移受到凝胶孔隙大小的限制。
孔隙越小，分子迁移的速度就越慢，分子会在凝胶中停留更长的时间。
因此，分子的分离程度取决于其分子大小和凝胶孔隙大小之间的差异。
凝胶层析可以分为两种类型：凝胶过滤层析和凝胶渗透层析。
凝胶过滤层析是利用凝胶基质孔隙大小的差异实现不同分子的过滤和分离。
较大的分子被阻挡在凝胶中，而较小的分子可以通过凝胶基质的孔隙，从而实现分离。
凝胶渗透层析则是利用凝胶基质孔隙中水合盖层的形成来实现分离。
分子在凝胶中形成水合物，而较大的分子受到水合盖层的阻挡，不能通过凝胶孔隙，从而停留在凝胶中。
较小的分子则可以通过凝胶孔隙，由于不形成水合物，迅速透过凝胶，实现分离。
凝胶层析可以通过调节凝胶孔隙大小来实现对不同大小分子的选择分离。
通过改变凝胶基质的组成、交联程度和浓度，可以调节凝胶的孔隙结构。
此外，还可以根据分子的分子量进行凝胶层析的选择性分离。
在凝胶层析中，常用的缓冲液是通过控制pH和离子浓度来维持凝胶中分子的稳定迁移。
较小的分子通常迁移速度较快，而较大的分子迁移速度较慢。
根据样品的性质，可以调节缓冲液的pH和离子浓度，以改变分子的迁移速度，实现更好的分离效果。
总之，凝胶层析通过凝胶基质的孔隙大小和水合盖层的形成来实现对生物大分子的分离和纯化。
凝胶过滤层析和凝胶渗透层析是其中两种常用的方法。
通过调节凝胶基质的孔隙结构和缓冲液的组成，可以实现对不同大小分子的选择性分离。
凝胶层析的研究及其应用
凝胶层析的研究及其应用凝胶层析是一种常见的分离和纯化生物大分子的技术方法，广泛应用于生物化学、分子生物学、生物医学等领域。
本文将介绍凝胶层析的研究及其应用。
一、凝胶层析的原理和分类凝胶层析是利用凝胶作为分离介质，根据生物分子在凝胶中的分子大小、形状和电荷差异，通过毛细管效应和几何阻滞效应实现生物大分子的分离和纯化。
凝胶层析可分为凝胶过滤层析、凝胶吸附层析和凝胶电泳层析三种主要方法。
1.凝胶过滤层析：根据生物分子的大小和孔径大小的选择，将较大的生物分子滞留在凝胶中，而较小的生物分子则通过凝胶颗粒。
常用的凝胶过滤介质有琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。
2.凝胶吸附层析：根据生物分子与凝胶吸附剂（如离子交换剂、亲和吸附剂）之间的亲和性差异，实现生物分子的分离纯化。
常用的凝胶吸附介质有离子交换凝胶、亲和性凝胶等。
3.凝胶电泳层析：根据生物分子的电荷差异，在电场作用下，通过凝胶孔隙内的离子迁移实现生物分子的分离。
常用的凝胶电泳介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。
二、凝胶层析的研究进展凝胶层析技术的研究中涉及到凝胶材料的制备与改性、凝胶层析流程的优化和成像技术的发展等方面。
1.凝胶材料的制备与改性：为了提高凝胶分离效果，研究人员常对凝胶材料进行制备和改性。
如调控凝胶孔隙大小、凝胶表面的亲和性等。
同时，还探索了新型的凝胶材料，如纳米凝胶和水凝胶。
2.凝胶层析流程的优化：凝胶层析的分离效果受到多种因素的影响，包括凝胶浓度、缓冲液pH值、离子浓度和柱床尺寸等。
因此，优化凝胶层析流程能够提高分离效率和纯化效果。
3.成像技术的发展：凝胶层析结合成像技术能够实时观察分离过程中的分子分布，提供有关分子大小、形状和电荷的信息。
如蛋白质凝胶电泳的银染色、荧光标记和质谱等技术的应用。
三、凝胶层析的应用凝胶层析在生物化学、分子生物学和生物医学等领域广泛应用于分离和纯化生物大分子。
1.蛋白质纯化：凝胶层析可以根据蛋白质的大小、电荷和亲和性等特性进行分离。
凝胶过滤层析
因此分子的正常Ｋav值0~1之间,这种由小 到大的顺序决定了物质流出的顺序。
排阻极限： 是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部 的最小分子的分子量。
排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分 子量。
第二节 凝胶介质的分类和性质
1） 葡聚糖凝胶 ① G类葡聚糖（Sephadex） ② LH-亲脂型葡聚糖 ③ Sephacryl
凝胶过滤原理示意图
凝胶层析的几个概念
外水体积（Vo）：是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流 动相的体积。 内水体积（Vi）：是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体 积。 基质体积（Vg）：是指凝胶颗粒实际骨架体积。 柱床体积（Vt）：是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积 （Ve）：样品中某组分洗脱下来所需洗脱液的总体积。
（2） 琼脂糖凝胶
商品名 Sepharose（瑞典）
1）2B,4B等型号，数字代表颗粒中琼脂糖的百 分含量，数字越大，分离的范围越小 2）与1，3－二溴异丙醇反应生成交联琼脂糖， 稳定性提高；
Bio－gel A(美国）
一般有A0.5, A1.5等型号，数字×106代表分 离的分子量极限；
与葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶相比，琼脂糖凝 胶机械强度和筛孔稳定性好，洗脱速度可以快些
对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水 体积和在外水体积中的浓度分配关系。
Ｋav＝（Ｖｅ－Ｖｏ）／(Ｖt － Vo)
它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔 隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无 关，也就是说它对每一物质为常数与柱的 物理条件无关。
（1）Ｋav = 0时,Ve = Vo,意味着该分子完全被排 阻于凝胶颗粒之外,全部分布于流动相里,在固定相 分布为0,而最先流出。
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