色谱分析一般步骤

展开剂(流动相) 展开剂(流动相)
同吸附柱色谱 极性强的溶剂洗脱能力强 常用溶剂的极性强弱顺序： 水＞酸＞吡啶＞甲醇＞乙醇＞正丙醇＞ 丙酮＞乙酸乙酯＞乙醚＞氯仿＞二氯甲烷＞ 甲苯＞苯＞三氯乙烷＞四氯化碳>环己烷>石 油醚。
展开剂
选择原则：根据被分 离物质的极性 Stahl简图：极性物质 —活度低（活性级 大）的吸附剂--极 性展开剂
展开
展开方式：上行展开 展开过程： 展开缸预先用展开剂饱和，平衡系统，薄层板浸入 展开剂展开（距边缘0.5-1cm），挥干展开剂
检测
物理方法——紫外光下显示荧光或荧光淬灭 物理方法——紫外光下显示荧光或荧光淬灭 —— 化学方法——加化学试剂显色，要求显色稳定、 化学方法——加化学试剂显色，要求显色稳定、 ——加化学试剂显色 持久、专属、灵敏。 持久、专属、灵敏。
被测物s b 原点
×
a
(b)
分配系数
K= Cs /Cm
在分离达到平衡时，组分在固定相的浓度Cs 和流动相的浓度Cm之比。
分离度
两个斑点中心距离与其平均宽度之比。 两个斑点中心距离与其平均宽度之比。
薄层色谱法操作流程
吸附剂或载体的选 择及薄层的制备 样品的制备 色谱前衍生化 展 开 点 样 薄层板预平衡 薄层板的 预 处 理
色谱分析的一般步骤
色谱法分离的基本原理
色谱法分离的基本原理是基于组分通过互不相溶的 两相而达到分离的。即样品溶解在流动相(Mobile Phase)中，从装填在柱子中或涂渍在载体表面的固 定相(Stationary Phase)上通过，依据组分与固定 相之间的相互作用力的不同，经过充分的运行时间， 它们即可被分离。 色谱法是一种分离技术，这种分离技术应用于分 析化学中，就是色谱分析。
展开剂
先用单一溶剂展开， 若Rf值太小， 则加入一定量极性强的溶剂，如乙醇、丙酮等， 如果Rf值太大， 则加入适量极性弱的溶剂(如环己烷、石油醚等)， 以降低极性。 可加入一定比例的酸或碱,使斑点集中。
薄层板制备
载板—— 5cm×20cm、10cm×20cm、 20×20cm的2mm厚的玻璃板 放在饱和碳酸钠溶液中浸泡数小时，除去玻 璃表面的油污。然后充分漂洗干净，干燥， 置干燥器中备用。 要求光滑、平整、洗净后不附水珠。
Rf =b/a b为原点至斑点中心的距离 a为原点至溶剂前沿的距离
与组分及色谱条件有关
相对比移值(relative 相对比移值(relative Rf；Ri,s)
Ri,s= b/a
与组分、色谱条件、参 考物质有关。
前沿
参比物i
Ri,s值
Ri,s值可以大于1，也可
以小于1。 重现性和可比性均比Rf 值好，能消除系统误差 （参考物质与组分在完 全相同的条件下展开）
氧化铝
碱性氧化铝(pH9.0) 碱性氧化铝(pH9.0)： (pH9.0) 分离中性或碱性化合物，如生物碱、脂溶性维 生素等； 中性氧化铝(pH7.5)： 中性氧化铝(pH7.5)： (pH7.5) 分离酸性及对碱不稳定的化合物； 酸性氧化铝(pH4.0)： 酸性氧化铝(pH4.0)： (pH4.0) 酸性化合物的分离，活度也与含水量有关。
薄层板涂铺要求： 薄层板涂铺要求： 均匀、平整、无气泡引起的凹坑和裂纹。 例： 硅胶板（粒度10 ～40um）
硅胶G——将硅胶置研钵中，加入少量水，研磨 均匀，至无结块和气泡，再加入比例量的水(一 般为1份固定相与3份水)，迅速研磨均匀，立即 涂铺。 硅胶或硅胶G ——以CMC为黏合剂。配制 0.3% ～ 0.8%CMC水溶液,放置过夜,使悬浮的纤 维沉降,取上层用来配制吸附剂匀浆。
色谱法的分类
依据展开后色谱图的类型，可将其分为: 内色谱法 外色谱法 内色谱即样品中的各组分在相同的时间内有不同的迁移 距离。但最终的分离仍在柱床上，并可检测。这种类型的色 谱法称为平板色谱，如纸色谱和薄层色谱 薄层色谱。固定相涂敷在平 薄层色谱 板上，流动相通过毛细管力而移动或通过重力的影响而通过 固定相。 外色谱法即柱色谱法(Column Chromatography),即是说， 在气相色谱、高效液相色谱或液体色谱中，所有的组分在相 同的流动相推动下通过柱床，由于组分与固定相之间特殊的 作用力，各个组分在柱后显示了不同的保留时间，并可用外 部连接的检测器检测。
特点
快，需十至几十分钟，同时展开多个试 样。 试样预处理简单，对试样限制少。 仪器简单，操作方便。 分离能力较强。 灵敏度较高
分类
吸附薄层色谱法 分配薄层色谱法 分子排阻薄层色谱法 离子交换薄层色谱法
主要技术参数
比移值 相对比移值 分配系数 分离度
比移值( 比移值(Rf值)
溶质移动距离与流动相移动 距离之比。 距离之比。
来自百度文库性和定量分析
定性分析 比较Rf值或Rr值 、斑点颜色或荧光 常采用已知标准物质对照（同一板上展开） 多种展开系统的Rf值与对照品一致。 定量分析 洗脱法 直接定量法 1.目视比较法（如杂质限度检查方法） 2.薄层扫描法
参考文献
杜斌、张振中，现代色谱技术，河南医科大学出版社，第 108—151页（2001）. A.Elatkis著，洪筱坤、王智华、曾一译，《层析理论与应用 》，上海科学技术出版社，第122—126页（1981）. Camag Catalogue ,“Instrumental Thin Later Chromatography”, TL-9-E(1981). D. Nurok, R. M. Becker, K. A. Sassic, Anal. Chem., 54, 1955(1982). E.Stahl,“Thin Layer Chromatography”, 1st Ed., Springer Verlag/Academic Press(1965), 2nd Ed.(1969).
原理： 原理： 硅醇基(吸附中心)与极性基团形成氢键（吸 附性）。组分与硅醇基形成氢键（被吸附） 的能力不同而分离。 应用： 应用： 酸性和中性物质的分离，如有机酸酚类、醛 类等
活度与含水量的关系： 活度与含水量的关系： 含水量高，活性级高，活度低。 活化： 活化： 加热至110℃左右，除去吸附水提高活度。 分离效率： 分离效率： 与其粒度、孔径及表面积等有关。
最早的色谱分析法是俄 罗斯植物学家MichailTswett在1906年，将碳 酸钙装填在玻璃管(也称 为色谱柱，Column)内， 石油醚洗脱，用于分离 植物叶子中的叶绿素， 植物叶子的提取液在通 过柱子后，在柱床上出 现了不同颜色的色带， 因此他将这种方法命名 为色谱法 (Chromatography)。这 就是最早使用的柱色谱 法。
定 定 性
位 定 量
最基本材料及设备
滤纸及薄层板 涂布器 点样器 展开室 显色器 薄层扫描仪
吸附剂的选择
根据分离物的性质选择固定相。 常规吸附剂：硅胶 氧化铝 硅胶、氧化铝 硅胶 氧化铝、硅藻 土、纤维素、聚酰胺、离子交换纤 维素、葡萄糖凝胶等。
硅胶
化学分子式为mSiO2·nH2O,多孔性微粒，表面 带有硅醇基，呈弱酸性。
薄层色谱法
，
薄层色谱法基本原理
TLC是20世纪50年代从经典色谱法及纸 色谱法的基础上发展起来的一种微量分 离分析方法。 TLC法具有设备简单，分析速度快，分 离效率高，结果直观等优点。
定义
固定相（吸附剂或载体）涂布成一均匀 薄层，点样，在装有流动相的密闭 密闭的容 密闭 器中展开，斑点显色，与对照物质比较 进行定性定量分析。
薄层板活化
涂布后的薄层先在室温下阴干，在使用前 置适当温度烘烤一定时间进行活化，然后 置干燥器中备用。 不同薄层活化条件略有不同。 如： 硅胶 110℃ 0.5- 1h 氧化铝 110℃ 30min
点样(关键点) 点样(关键点)
要求配制样品的溶剂高度挥发性和尽可能非 极性，否则易使斑点扩展。 采用多次点加法，第二次点加时应待前一次 点加的溶剂挥发后再进行。 点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离 度变差，以最小检测量的几倍～几十倍为宜。 手工点样工具：定容玻璃毛细管（1 –5ul）， 微量注射器。