鹅微卫星_TG_n基序的克隆及序列比较分析
1 4 不同等位基因片段的克隆和测序 12% 的非变性聚 丙烯酰 胺凝 胶电 泳检 测 PCR 产物 , 柱 式 DNA 胶回收 试剂 盒 快速 回收 不 同等 位 基 因片 段 , 与 pGEM T Easy vector连接 , 转化到大肠杆菌 J M 109上 , 酶切鉴定后 送至 上海 Inv itrogen 公司进行测序。
3 讨论
DNA 标记是物种 资源监 测和 遗传多 样性 研究 中不 可缺 少 的工具。许多研 究表明 , 一个 数量 性状 的 QT L 并 不多 , 存 在 主效基因
[ 7]
。这些 QTL 的一 个或两 个主 效基因 就能 反映 一个
数量性状表型 变异 的 10% ~ 50% 以上。 因此 , 我 们可 以利 用 基因的重组 交 换原 理筛 选 出与 QTL 有紧 密 相关 的分 子 标记 , 从而可通过分 子标 记来 选择 和定 位数 量性 状基 因座
畜牧与兽医
2005 年
第 37 卷
第 12 期
% 1%
试验 研究
鹅微卫星 ( TG) n 基序的克隆及 序列比较分析
虞德兵, 汪 峰, 洪坤月, 杜文兴
*
(南京农业大学动物科技学院 , 江苏 南京
210095 )
摘要 : 以 ( TG ) 10重复基序设计引物对鹅基因组 DNA 进行 PCR 扩增 , PCR 产物经 12 % 的非变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳后 银染检测 , 共获得 了 7 种
L- 1 Taq 酶 , 10 m o l % L- 1引物各 0 3 L ,
% 2% L 模板 DNA ( 50 ng% 件: 94 72 5 m in; 94 10 m in。 循环 ; L- 1 ), 30 s , 58
A ni m a lH usbandry & V ete rinary M ed ic ine 6 0 L ddH 2 O。 PCR 反 应 条 30 s , 72 1 m in, 35 个
2005 V o l 37 N o 12
2 2 部分微卫星 DNA 片段的克隆和测序 转化后的大 肠杆 菌 J M 109 经蓝 白斑 筛选 后 , 挑 取阳 性 克 隆提取质粒 , 用酶切法对阳性质粒进一步鉴定。阳性质粒插 入 位点两侧的多克隆位 点的双酶 切得 到一 条 150 bp 左右 的插 入 片段和一条载体带 , 而没有插入片段的阴性对照经双酶切只 有 载体带 ( 图 2) 。
2 结果与分析
2 1 微卫星引物 PCR 检测 12% 的非变性聚 丙烯 酰胺凝 胶电 泳检 测 PCR 产物 , 结 果 如图 1 所示。从图 1 可以看出 , 该微卫星座位在所有鹅种 中共 检测到 7 种基因型、 4 种等位基因 , 提示 该微卫星 座位多 态性 较丰富 , 今后可作为鹅遗传多 样性评估的分子依据。
收稿日期 : 2005 06 10 基金项目 : 国家科技攻关项目 ( 2002BA 514A 9 2 6) ; 江苏省农业 三项工程项目 ( SX [ 2003] 046 )。 作者简介 : 虞德兵 ( 1979 ) , 男 , 博士研究生。 * 通讯作者。
置 ; Eppendorf5810R 高速冷冻离心机。 1 3 微卫星引物设计及 PCR 扩增 微卫星引物设计方 法见 文 献 [ 6], 其序 列如 下 : 上 游 引 物 F : 5# ATGGATGCTAA CAAACA CTC3# ; 下游引物 R: 5# GTA C 1 0 L 10 ∃ PCR 1 0 0 3 L 10 mm ol% L - 1 dNT P , AAAGGTCATGGAGAAG 3# 。 PCR 扩 增 体 系 : buffer , 1 0 L 25 mm ol M gC l2, 0 1 L 5 U%
[ 4]
1 材料和方法
1 1 DNA样品来 源 翅静脉采集皖西白鹅、溆浦鹅、浙东白鹅、四川白鹅 、豁 眼鹅、太湖鹅、东北仔鹅和莱茵 鹅全血 2 mL, 另加 A CD 抗 凝 ( 1 5), 冰块保存带回实验室 , - 20 冷藏备 用。血样中基 因 组 DNA 的提取 , 采用酚 氯仿法 , 具体操作步 骤参照 !分子 克 隆实验指南 ∀ ( 第二版 ) , 略加改良 [ 5] 。 1 2 主要试剂和仪器 T aqDNA 聚合 酶 , 美 国 R oche 公 司 产 品 ; 4 种 单 核苷 酸 : M B I公司产品 ; 丙烯酰胺为进 口分装 产品 ; N, N 甲 叉双丙 烯 酰胺 : 瑞士 FLUKA 公司产品 ; PBR332 DNA /M SP IM a rkers: 华 美生物工程公司产品 ; 蛋白酶 K: M ERCK 公司产品。 UV 754 型紫外可见 分光光 度计 ; 仪 ; EPS604 型稳压稳流电 泳仪 ; PTC 100T M 型 PCR 扩 增 DYC 24A 型 垂直 板电 泳槽 装
, 而关 于鹅 分
子标记的应用报道 则很少。众 多研 究表明 , 微卫星 DNA 标记 能有效反映群体的遗 传变异 , 是分析畜禽遗传多样性、品系间 亲缘关系及遗传距离理想的分 子标记。本文选取一个微卫星基 序在 8 个鹅种中进行了验证 , 以探讨该基序的多态性是否 适用 于鹅品种遗传多样性 的研究。
K ey w ord s : m icrosa tellite; goose; c lon ing
我国鹅品种资源 极为丰富 , 不同地区由于地理隔离、人工 选择以及引种等原因 , 形成了一些形态 特征和生产性能等方面 都有一定差异的不同 鹅种群。因此 , 对 鹅品种的遗传多样性进 行研究 , 弄清鹅品种 种群的 遗传结 构和起源 分化 , 对 其保种、 选育及 合 理 的 开 发 利 用十 分 必 要。 生物 的 遗 传 变 异 主 要 是 DNA 在复制过程 中产生 的差 别而造 成的 , 这 种差 别主 要表 现 在碱基排列顺 序的不 同。 DNA 序 列上 的差异 反映 了物 种亲 缘 关系的远近程度 [ 1] 。微 卫星 标 记作 为遗 传 标记 的一 种 , 多 年 来被用作基因定位和 连锁分析 [ 2, 3] 。微卫星 变异主 要是其 核心 重复序列的不 同而 形成 高度 的多 态 性位 点。在水 禽育 种研 究 中 , 一般是通过表型 性 状选 育及 杂 交等 方式
[ 8]
。微 卫
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不同开填体重朗德鹅产肝性能的比较试验
李齐发 , 辜自荣 , 刘振山 , 黄治国 , 苏胜彦 , 狄
( 1. 南京农业大学动物科技学院 , 江苏 南京
1 1 1 1 1
雷 , 吴松青
222200)
2
2
210095; 2. 江苏兴云集团 , 江苏 灌云
1、 2、 5 、6 、7 : 重组质粒的双酶切 ; 3: 阴性质粒的双酶切 ; 4: pBR 322 /H ae III
图 2 重组质粒的酶切鉴定 图 1 微卫星位点的 PCR 产物电泳
图 3 微卫星的序列 比较结果 图 3 中 , 分别克隆微卫星 位点的 A、 B 2 个等 位基因 后利 用 DNA STAR 进行序列比较 , 序列的 前后 20 个碱基 分别为上、 下游引 物序 列。从 图 3 可以 看出 , 其 中包 含的 ( AC /TG ) 重 复数都大于 10 个 , A 等位基因为 11 个重复 , B 等位基 因为 14 个重复 ; 二 者 除了 相差 3 个 ( A C /TG ) 串联 重复 以外 , 还 存 在位于重复序 列上 游有一 个 T /G 突变。 结果 提示 , 在 鹅的 基 因组中存在大量的 ( TG ) n 重复序列 。 星由于基序在每个位点的重复数量不同而表现出 大量的长度多 态性 , 而且是特异扩增 , 具有良 好的 稳定性 , 且所 需 DNA 的 数量少、质量要求低 , 试验过程不需要标记探针和转膜等繁 琐 的过程 , 可以快速、简便、有效地对供试材料进行鉴定。本 试 验首 次 将 微 卫 星 标 记 用 于 鹅 的 遗 传 分 类 研 究 中 , 通 过 用 ( TG ) n 引物 对 8 个 鹅种的 微卫星 DNA 直接 进行扩 增 , 并对 反 应体系的多次优化 , 最终获得了多态性条带 , 并通过回收扩 增 产物克隆测序 , 证明获得的多态性条带不是假阳性的。微卫 星 DNA 的核心序列中 , 以 ( CA /GT ) n 或 ( A C /TG ) n 双碱基核 苷 酸重复最为常见 , 猪基因估 计共 有 6 5 万 ~ 10 万个平 均约 30 ~ 50 kb 分布一个这样的重 复序列 [ 9] 。本研究中 , BLAST 结 果 显示 , 在 G enBank 中未能找到该序列的 同源序列 , 说明该序列 是一新的鹅微卫星 DNA 序列。通 过试 验结果 可看 出 , 该微 卫 星基序在鹅上存在着多态性 , 说明了微卫星分子 标记是可以 用 于鹅的遗传分类研究的。本试验是在鹅上建立微卫星分子 标记
摘要 : 对不同开填体重的朗德鹅产肝性能进行了比较分析。结果发现 : 4 2 kg 体重组 的平均肝重最大 , 为 827 50 g, 极显著高于 3 8 kg 、 3 0 kg
体重组 (P < 0 01) ; 4 7 kg 体重组的肝重明显低于 4 2 kg 体重组 , 但没有达到显著 水平 (P = 0 20) ; 相 关分析发现开填 体重与肝重 之间呈极 显 著的正相关 ; 通过建立回归曲线得出国内朗德鹅 12周龄的最佳开填体重为 4 5 kg。对肥肝重与腹脂重、皮脂厚等指标进行了相关性分析 , 发 现肝 重与腹脂重呈正相关且达到显著水平 (P < 0 05 ) , 说明脂肪组织的脂肪沉积与肝脏的脂肪沉积有密切的关系。
基因型 , 4种等位基因 ; 并且在各供试鹅品种上表现出多态性 , 可以实现遗传 分类研究。对回收的 不同条带进行 纯化、克隆测序 ; 测 序结果显 示 各品种都有 ( TG ) n基序存在 , 并且各个条带中重复数大于 10。
2株鹅细小病毒的主要结构蛋白VP2基因的克隆和序列分析
２株鹅细小病毒的主要结构蛋白ＶＰ２基因的克隆和序列分析摘要将鹅细小病毒PJ分离株和XJ分离株接种于13日龄非免疫鸭胚，收集接毒后24～72h死亡的鸭胚尿囊液。
根据Genbank已发表的鹅细小病毒B株基因组核苷酸序列设计1对引物，对2株鹅细小病毒毒株主要结构蛋白VP2基因进行PCR扩增，将扩增产物与pMD18-T载体连接并测序。
结果表明：PJ株和XJ株VP2的核苷酸序列全长分别为2 044bp和2 050bp，PJ株与B株、XJ株、台湾株的同源性均为93.5%～96.7%，与YG株、哈尔滨株、广东株的同源性为88.7%左右，与匈牙利株的同源性仅为80.7%，而与番鸭细小病毒的同源性为74.8%～80.7%。
XJ株与匈牙利株的同源性为83.5%，与番鸭细小病毒的同源性为76.8%～80.0%，与其他毒株的同源性为91.6%～98.3%。
关键词鹅细小病毒；VP2基因；克隆；序列分析鹅细小病毒（Goose Parvovirus，GPV）是感染禽类的主要自主性细小病毒，传播迅速，以4～20日龄雏鹅的消化道，尤其以小肠部位的纤维素性、栓塞性病变为主要特征[1，2]。
由于该病病程短促、传染性强、传播快、死亡率高，造成了严重的经济损失[3，4]。
1956年，我国学者方定一在扬州地区发现本病，并进行了首次报道[5]。
自1965年开始，匈牙利、法国、德国、苏联等欧洲一些国家相继报到了该病。
GPV除能致雏鹅发病外，还能引起雏番鸭发病。
自20世纪90年代起，亚洲一些番鸭养殖业发达的国家，如泰国、日本等亦在番鸭群中发现了小鹅瘟[6]。
1995年Brown[7]等人克隆了GPV基因组的部分序列，后由Zadorid 等[8]研究发表了GPV全基因组序列，并与番鸭细小病毒（MDPV）进行了比较分析，发现2种病毒的基因同源性为81.9%。
GPV属于细小病毒科细小病毒属，基因组为单链、线性DNA，大小约为5kb。
含有正投DNA的病毒粒子和含有负股DNA链的病毒粒子数目相等。
鹅类胰岛素样生长因子-Ⅰ基因的克隆与序列分析
本 研 究克 隆 了鹅
Ｉ的部 分 基 因组 序列 ， 前人 对
得 出的 序列 进行 了补 充并 首 次 获得 了 内含 子序 列 ，
为鹅 ， Ｉ 因的进一 步研 究提 供依 据 。 Ｇ 基 １ 材 料 与方 法
１１ 材 ． 料
１１１ 实验 动 物 于 江苏 高 邮扬 州鹅 繁 育基 地 ， ．． 随
目前 关 于鹅
【 隆 了鹅 ８ Ｊ 克
Ｉ基 因 的研 究很 少 ， 肖翠 红 等
Ｉ 因的 ｍＲ Ａ序列 并研 究 了其 在 基 Ｎ
鹅 （ 录 号 ：Ｑ ８９２ Ｅ ４０５ ） 登 Ｄ ９ ８ ３ ， Ｆ ６ ８ ０ 与鸡
Ｉ 因 基
组 织 中 的表达 情 况 ； 雷等 【 隆 了鹅 ， Ｉ基 因 王 ９ Ｊ 克 Ｇ
的 ５ 调控 区 ， 发现 与鸭 、 的 同源性 分别 为 ９ ．％和 鸡 ８１ ９ ．％。 它大 部分 非 编码 区 的研究 仍 为空 白。 ３０ 其 因此
收稿 日期 ：０ ７ ０ —１ ； 回 日期 ：０ ８ Ｏ 一 ８ ２０—９ ６修 ２ ０ 一 １ Ｏ
相 当保 守 ，０个 氨 基 酸成 熟肽 中 的 ６ ７ ０个 在 鸡 、 鼠 大
和人 之间完 全 一致 。
抗凝 后 用酚 ， 氯仿 抽提 法提 取 基 因组 Ｄ Ａ。用 全波 Ｎ 长 紫外 ， 见光 扫 描 分光 光度 计 Ｎ ｎＤ ｏ Ｄ １０ 可 ａｏ ｒ Ｎ 一 ０ ０ ｐ
检测 Ｄ Ａ的浓度 和纯 度 ，２ ￣ 保存 备用 。 Ｎ 一 ０Ｃ １ ． 引 物 设 计 与合 成 参 考 Ｇ ｎ ａｋ上 发 表 的 ．２ ２ ｅＢ ｎ
氨基 酸 的 Ｉ Ｆ 成 熟 多肽 ，而外 显 子 １和外显 子 ４ Ｇ —Ｉ 分别 编码 Ｎ端 和 Ｃ端 肽 以及一 些 非 翻译 序列 ［ ６ ］ 。不
广西鹅γ干扰素基因的克隆与序列分析
Ｋｅ ｒ ｓ ｇ ｏ ｅ ｉ ｔ ｒ ｒ ｎ ； ｌｎ ｎ ；ｓ ｑ ｅ ｃ ｎ ｌ ｓｓ Ｇｕ ｎ ｘ ｙ ｗｏ ｄ ： ｏ ｓ ； ｎｅ ｅ ｏ 一 ｃｏ ｉｇ ｅ ｕ ｎ ｅ ａ ａｙ ｉ； ａ ｇ ｉ ｆ
ｍｅｈｎｓ ｆ ｏｓ ｔｒ ｒｎ （ Ｎ ＾． ｏａ Ｒ Ａｗ ｓ ｘ ａｔｄｆ ｍ ｐｒ ｈｒｌ ｌ ｄｌ ｈｃｔｓ ｆ ｏｓ ｉ ｄｗｔ ｃａ ｉ ｏ ｇｏｅｉ ｅ ｅｏ一 Ｉ 一ｙ Ｔ ｔ Ｎ ａ ｔ ｃｅ ｏ ｅｉ ｅａ ｂ ｏ ｍｐｏｙｅ ｏｅｒ ｓ ｉ ｍ ｎｆ Ｆ ） ｌ ｅｒ ｒ ｐ ｏ ｙ ｏｇ ａｅ ｈ Ｃ ｎ ． ｈ ｏｓ ｔ ｅｏ 一 ＩＮ一 ｃ Ｎ ａ ｍ ｌｉ ｓ ｇＲ － Ｃ ， ｌｎｄｔ ｐ ｏＡ Ｔ ｅｇｏｅｉ ｅ ｒｎ （ ｎｒ ｆ Ｆ Ｄ Ａ Ｗ Ｓａ ｐｉｅ ｕｉ Ｔ Ｐ Ｒ ｃ ｅ ＭＤ１一 ｎ ｅｕｎ ｅ． ｈ ｎ ｆｄ ｎ ｏ ｏ Ｔａ ｄｓｑ ｅ ｃｄ Ｔ ｅｆ — ８ ｉ
干 扰 素 （Ｆ 是 体 内一 种 重 要 的 干扰 病 毒 繁殖 ＩＮ） 的免疫 活 性 细胞 因子 ， ｓａｓ ［ 研 究鸡 胚 绒 毛 由Ｉ ｃ等 １ ａ ］ 在 尿囊 膜 中 禽流 感病 毒 时 首次 发 现 。 Ｆ 分 为Ｉ 和 Ⅱ ＩＮ 型 型 ， ＩＮ主 要 由病 毒 和 微 生 物 诱 导 产 生 ， Ｉ Ｆ 型 目前 发
（ １广西动物疫病预 防控制 中心 ，南宁 ５ ０ ０ ；２广西大学动物科 学技术学院 ，南宁 ３０ １ ５００） ３ ０ ５
摘要 ： 为进 一步研究鹅干扰素 （Ｆ 的分子生物学特性及 抗病毒作用机理 ， ＩＮ） 提取经刀豆素 （ ｏＡ） Ｃ ｎ 刺激培养 的鹅
利用微卫星标记分析我国13个地方灰羽鹅品种的遗传多样性
生物多样性 2006, 14 (2): 152-158 doi: 10.1360/biodiv.050214Biodiversity Science http: //——————————————————收稿日期: 2005-10-13; 接受日期: 2006-01-08基金项目: 国家农业部重大资源保护项目(2001AA243081)和江苏省公益性研究与服务专项资金项目(MB2005708) * 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: tyj3030@利用微卫星标记分析我国13个地方灰羽鹅品种的遗传多样性屠云洁1 陈宽维1* 汤青萍1 王金玉2 高玉时1 顾 荣1 葛庆联11 (中国农业科学院家禽研究所, 扬州 225003)2 (扬州大学动物科学与技术学院, 扬州 225001)摘要: 我国地方鹅品种具有很多优良性状, 但长期以来由于没有形成科学的选育制度和培育方法, 品种的遗传多样性没有得到完整保存。
为了深入了解我国地方鹅品种的遗传结构, 使之得到更好的保护和利用, 作者选用31个多态性较高的微卫星标记(其中19个是首次用磁珠富集法从AFLP 片段中分离), 检测了我国13个地方灰羽鹅 (An-ser cygnnoides ) 品种的遗传多样性。
利用等位基因频率计算出各群体的平均遗传杂合度(H )、多态信息含量(PIC )和群体间的遗传距离(D A )。
结果表明: 13个地方灰羽鹅品种中, 平均多态信息含量为0.323–0.398，平均杂合度为0.4985–0.6727, 各品种的杂合度都较高, 最高的是狮头鹅(0.6727), 最低的是雁鹅(0.4985)。
用UPGMA 法进行聚类分析的结果显示, 13个品种被聚为4类: 丰城灰鹅、武冈铜鹅、兴国灰鹅、狮头鹅、乌棕鹅、阳江鹅、马冈鹅、钢鹅、雁鹅聚为第1类; 伊犁鹅自聚为第2类; 长乐鹅、右江鹅聚为第3类; 永康灰鹅自聚为第4类。
鹅TSH_基因序列的克隆与分析
鹅TSH-β基因序列的克隆与分析于金成,王志跃,杨海明,宋成义(扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州225009) 摘要:促甲状腺激素(TS H)在调控甲状腺功能及维持体内甲状腺激素水平稳定等方面具有重要作用。
本研究以扬州鹅为试验动物,用PCR方法从鹅基因组DNA中分别扩增出TSH-β基因的外显子1、2、3和内含子1、2序列,产物克隆并测序共得到2019bp;比对发现,与鸡、鸭、朱鹭、鹌鹑等禽类相应外显子序列同源性在95%以上,内含子序列与鸡、朱鹭同源性在74%以上。
关键词:促甲状腺激素β亚基;序列分析;鹅;基因克隆;同源性 中图分类号:Q785 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2009)02-0020-03 在脊椎动物中,腺垂体分泌的促甲状腺激素(thyr oid-sti m ulating hor mone,TSH)通过调节甲状腺内T3/T4的分泌量来调控机体的生长和代谢。
促甲状腺激素与促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)一样,均是异源二聚体糖蛋白激素,由非特异性的α亚基和特异性的β亚基以非共价键连接而成,其中β亚基对TS H的生物学活性起着决定性作用[1]。
迄今为止,许多学者主要对禽类TSH-β基因的c DNA进行了研究,例如鸡(Gallus gallus)[2]、鸭(A nas anas)[3]、鹌鹑(Coturnix cotur2 nix)4]和朱鹭(N ipponia nippon)[5]。
多数品种鹅具有非常明显的季节性繁殖特性,调控种鹅的繁殖活动不受季节影响或延长鹅的产蛋周期,不仅会产生可观的经济效益,给养殖者带来丰厚收益,而且也是育种工作者努力的方向。
据报道,TSH通过引发光周期反应来控制禽类的繁殖性能[6],目前国内外关于鹅TSH-β基因的研究尚未见报道。
鉴于TSH-β基因的重要作用,本研究依据前人的研究结果,以扬州鹅为试验动物,首次在基因组水平上克隆了鹅TSH-β基因外显子-内含子结构几乎全部的序列。
一株鹅呼肠孤病毒的分离鉴定及全基因组序列分析的开题报告
一株鹅呼肠孤病毒的分离鉴定及全基因组序列分析的开题报告一、研究背景鹅呼肠孤病毒（Goose astrovirus，GoAstV）是属于天然矮星病毒科（Astroviridae）的一种RNA病毒，它能够引起鹅的消化道疾病，包括呕吐、腹泻等。
这种病毒在全球范围内都有分布，已经成为鹅养殖业的一个重要问题。
目前，针对鹅呼肠孤病毒的研究还比较有限，主要集中在病毒的分离、鉴定、分子特征、病毒学结构、流行病学等方面，尚未对其全基因组进行系统性的分析。
因此，开展一项关于鹅呼肠孤病毒分离鉴定及全基因组序列分析的研究具有重要意义和广阔的应用前景。
二、研究目的1.对一株鹅呼肠孤病毒进行分离鉴定，并对其进行基础的生物学特性研究；2.通过测序和分析，得到该鹅呼肠孤病毒的全基因组序列，并对其进行系统性的遗传学和进化学分析；3.探究该病毒的种系进化关系，并分析其与其他已知鹅呼肠孤病毒的相似性和差异性；4.为进一步深入研究鹅呼肠孤病毒的基础病原学与流行病学特征以及防控技术的研发提供技术支持。
三、研究方法1.样品采集及鉴定：从鹅粪便样品中，通过筛选、纯化、传代等方法，筛选出一株鹅呼肠孤病毒，并进行鉴定；2.病毒RNA提取：对提取的病毒RNA进行反转录，得到其对应的cDNA片段；3.PCR扩增及双向测序：将cDNA片段进行PCR扩增，随后通过高通量测序得到该鹅呼肠孤病毒的全基因组序列；4.序列分析及进化分析：对该鹅呼肠孤病毒的全基因组序列进行分析，包括GC含量、核苷酸序列的一致性、氨基酸序列的一致性、基因的数量和排列特点、启动子和编码序列等。
另外，还对其进行系统发育学分析、计算进化树、相似性度量和重组分析，探究其种系进化关系。
四、预期结果1.成功分离鉴定出一株鹅呼肠孤病毒，并初步分析了其基础生物学特性；2.得到该病毒的全基因组序列，并对其进行深入分析；3.研究其种系进化关系，探究其与其他已知鹅呼肠孤病毒的相似性和差异性；4.为防控鹅呼肠孤病毒的流行提供重要技术支撑。
鹅细小病毒基因组结构研究进展
鹅细小病毒基因组结构研究进展作者：曹楠杨舒展黄冠雄郭思璇曾依翎李冰心田允波许丹宁来源：《乡村科技》2018年第10期[摘要] 鹅细小病毒（Goose Parvovirus Virus，GPV）是小鹅瘟疫病的病原体，基因全长组约5 kb，编码左右2个开放阅读框（Open Reading Frame，ORF），分别为LORF（Left ORF）和RORF（Right ORF）。
LORF编码非结构蛋白（Nonstructural Protein，NS）NS1和NS2，RORF编码3种结构蛋白（Structural Protein）VP1、VP2和VP3。
本文从病原学、基因和蛋白分子结构方面对GPV基因组结构特征的研究进展进行综述，并对GPV基因工程疫苗的开发进行展望，为我国防控GPV提供参考。
[关键词] 鹅细小病毒病毒；非结构蛋白；结构蛋白；末端回文序列[中图分类号] S855.3 [文献标识码] A [文章编号] 1674-7909（2018）10-90-4鹅细小病毒（Goose Parvovirus Virus，GPV）可侵染3～20日龄雏鹅和雏番鸭小鹅，造成出血性、纤维素性和渗出性肠炎，是雏鹅和雏番鸭的一种严重传染病[1]。
扬州大学的方定一教授于1956年首次发现了GPV并对其做了详细的研究[2]。
此后，日本[3]、英国[4]、匈牙利[5]、瑞典[6]、法国[7]和美国[8]等许多国家陆续报道了该病。
与此同时，该病在我国福建[9]、江苏[10]、四川[11]、山东[12]等主要的水禽养殖地区广泛流行，给水禽养殖行业造成了严重的经济损失。
国内外很多学者都对其展开了研究，经过几十年的不断探索，GPV的分子结构及相应的生物学特点逐渐被研究透彻。
1 鹅细小病毒病原学GPV属于细小病毒科细小病毒属，病毒粒子呈圆形或六角形，外直径为20～25 nm，内直径约为15 nm，外壳厚约5 nm，可以形成二十面体对称的空间结构[13]。
鹅细小病毒不同毒株VP13基因的克隆与序列分析
１ ２ １ 病毒 增 殖及鉴 定 ．．
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材料 ．
类 的主要 自主 性 细小 病 毒 ， 由它 引起 的鹅 细 小 病 毒
病 又名 小 鹅 瘟 ， 重 危 害 养 鹅 业 ［ ］ 严 １ 。ＧＰ 属 细 小 Ｖ
１１ １ 病 毒 ． ．
５株鹅 细小 病毒 分别 为 Ｓ ｈ株 （ Ｃ 四川
病 毒科 浓核 病毒 属［ ， 基 因组 ＤＮＡ 为 单 链 、 性 ４其 ］ 线 ＤＮＡ， 大小 约为 ５ ０ｋ ； ． ｂ 含有 正链 Ｄ ＮＡ 和含 有负链 ＤＮＡ 的病毒 粒 子 数 目基 本 相 等 ， 占 ５ 。ＧＰ 各 Ｏ Ｖ
将病 毒适 当稀 释后 ， 经尿
囊腔 接种 ９日龄 的非 免 疫 鸭胚 ， 收集 接 种 后 ７ ～ ２ｈ
ＧＰ 的主要 结 构 蛋 白 ， 病 毒 核 衣 壳 的 主 要 成 分 ， Ｖ 是 约 占 总 蛋 白 含 量 的 ８ ， 暴 露 于 病 毒 粒 子 表 Ｏ 且
面 ， ］ 是病 毒刺激 机 体 产 生保 护 性 抗 体 的重 要 抗 原
２ ０ｈ死 亡 的 鸭 胚 尿 囊 液 ， Ｐ Ｒ 检 测 阳 性 者 置 ４ 经 Ｃ
一
２ Ｏ℃冻存 备用 。
１ ２ ２ 引物 设计 与合 成 根 据 已发表 的 Ｇ Ｖ Ｂ株 ．． Ｐ
蛋 白 。在 自然 感 染 条 件 下 ，Ｇ Ｖ 诱 导 产 生 抗 ＶＰ Ｐ ３
鹅VDR基因克隆及其多克隆抗体制备与鉴定
中国畜牧兽医 2024,51(3):1194-1202C h i n aA n i m a lH u s ba n dr y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 鹅V D R 基因克隆及其多克隆抗体制备与鉴定秦逸飞1,陈 蓉2,施振旦2(1.仲恺农业工程学院动物科技学院,广州510225;2.江苏省农业科学院畜牧研究所,农业农村部种养结合重点实验室,南京210014)摘 要:ʌ目的ɔ维生素D 3(v i t a m i nD 3,V D 3)是一类重要的类固醇激素,参与调控动物体内多种生理活动,具有生物活性的V D 3代谢物1,25(O H )2D 3通过与维生素D 受体(v i t a m i nDr e c e p t o r ,V D R )结合发挥生物学功能㊂试验旨在克隆鹅V D R 基因C D S 序列并制备鹅V D R 多克隆抗体,为后续开展V D R 介导V D 3调控鹅体内多种生理活动的分子机制研究提供基础支撑㊂ʌ方法ɔ通过基因克隆方法获得鹅V D R 基因C D S 序列,并采用生物信息学方法对其编码蛋白进行结构和功能预测分析㊂通过基因合成和亚克隆方法构建鹅V D R 基因重组表达质粒,转化大肠杆菌B L 21(D E 3)感受态细胞,经I P T G 诱导表达和镍柱纯化后获得鹅V D R 重组蛋白㊂以纯化的鹅V D R 重组蛋白作为免疫原,制备兔抗鹅V D R 多克隆抗体,采用间接E L I S A 法检测抗体效价,采用W e s t e r nb l o t t i n g 检测抗体特异性㊂ʌ结果ɔ试验成功克隆了鹅V D R 基因编码区序列,长度为1356b p,编码451个氨基酸残基㊂该编码蛋白与鸡V D R 蛋白的相似性高达91.4%,无信号肽和跨膜结构域,N -端含有核定位序列,且含有D N A 结合域和配体结合域2个保守结构域,属于类固醇/甲状腺激素受体超家族成员㊂试验成功构建了p E T -30a (+)-V D R 重组质粒,并诱导表达鹅V D R 重组蛋白㊂纯化后的重组蛋白纯度高达90%以上,且大小符合预期(52k u )㊂试验制备了兔抗鹅V D R 多克隆抗体,其抗体效价>1ʒ1093500;除肝脏组织外,该多克隆抗体在产蛋鹅肾脏㊁十二指肠㊁空肠和回肠组织中均能够识别天然V D R 蛋白的2种亚型㊂ʌ结论ɔ试验成功克隆了鹅V D R 基因C D S 序列,并制备了兔抗鹅V D R 多克隆抗体,该多克隆抗体特异性高,可用于后续鹅体内V D R 介导的生物学功能研究㊂关键词:鹅;V D R 基因;克隆;多克隆抗体中图分类号:S 835文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2024.03.031 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-08-28基金项目:国家自然科学基金项目(32102551);现代农业产业技术体系建设专项资金(C A R S -40-20)联系方式:秦逸飞,E -m a i l :554432638@q q .c o m ㊂通信作者陈蓉,E -m a i l :c h e n r o n g _b i g @163.c o m ;施振旦,E -m a i l :z d s h i @ja a s .a c .c n C l o n i n g o f V D R G e n e a n dP r e pa r a t i o na n d I d e n t i f i c a t i o no f I t s P o l yc l o n a l A n t i b od yi nG e e s e Q I N Y i f e i 1,C H E N R o n g 2,SH I Z h e n d a n 2(1.C o l l e g e o f A n i m a lS c i e n c e&T e c h n o l o g y ,Z h o n g k a i U n i v e r s i t y o f A g r i c u l t u r e a n d E n g i n e e r i n g ,G u a n g z h o u 510225,C h i n a ;2.K e y L a b o r a t o r yf o rC r o p a n dA n i m a l I n t e g r a t e dF a r m i n g ,M i n i s t r y o f A g r i c u l t u r e a n dR u r a lA f f a i r s ,I n s t i t u t e o f An i m a l S c i e n c e ,J i a n g s uA c a d e m y o f A g r i c u l t u r a lS c i e n c e ,N a n j i n g 210014,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔV i t a m i n D 3(V D 3)i s a ni m p o r t a n ts t e r o i d h o r m o n ei n v o l v e di n t h e r e g u l a t i o no f v a r i o u s p h y s i o l o g i c a l a c t i v i t i e s i na n i m a l s .I t sb i o a c t i v e m e t a b o l i t e1,25(O H )2D 3p e r f o r m s t h eb i o l o g i c a l f u n c t i o nb y b i n d i n g t ov i t a m i nDr e c e p t o r (V D R ).C l o n i n g o f g o o s e V D R g e n eC D Sa n d p r e p a r a t i o no f i t s p o l y c l o n a l a n t i b o d y w o u l d p r o v i d e t h eb a s i c s u p po r t f o r f u r t h e r r e s e a r c ho nt h em o l e c u l a rm e c h a n i s m o fV D R -m e d i a t e d V D 3re g u l a t i o no fv a r i o u s p h y s i o l o g i c a l a c t i v i t i e s i n g e e s e .ʌM e t h o d ɔT h eC D Ss e q u e n c eof V D Rg e n e i n g e e s ew a so b t a i n e db y th e g e n e c l o ni n g m e t h o d ,a n d t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o ft h e e n c o d e d p r o t e i n w e r e p r e d i c t e d b y3期秦逸飞等:鹅V D R基因克隆及其多克隆抗体制备与鉴定b i o i n f o r m a t i cm e t h o d s.T h e r ec o m b i n a n t p l a s m i do f V D R g e n e i n g e e s ew a s c o n s t r u c t e db yg e n e s y n t h e s i s a n ds u b-c l o n i n g m e t h od s,a n dt he nw a s t r a n sf o r m e d i n t o E s c h e r i c h i a c o l i B L21(D E3) c o m p e t e n t c e l l s.T h e r e c o m b i n a n tV D R p r o t e i n i ng e e s ew a s o b t a i n e d b y i n d u c t i o nw i th I P T Ga n d p u ri f i c a t i o nw i t han i c k e l c o l u m n.T h er a b b i t a n t i-g o o s eV D R p o l y c l o n a l a n t i b o d y w a s p r e p a r e d w i t h t h e p u r i f i e d r e c o m b i n a n tV D R p r o t e i n a s a n i m m u n o g e n.T h e a n t i b o d y t i t e rw a s d e t e c t e db y i n d i r e c tE L I S A,a n d t h e a n t i b o d y s p e c i f i c i t y w a s d e t e c t e db y W e s t e r nb l o t t i n g.ʌR e s u l tɔT h eC D S s e q u e n c eo f V D R g e n ei n g e e s e w a ss u c c e s s f u l l y c l o n e d w i t hal e n g t h o f1356b p a n d w a s p r e d i c t e dt oe n c o d e451a m i n oa c i dr e s i d u e s.T h ec o d i n gp r o t e i ns h a r e dah i g hi d e n t i t y w i t h c h i c k e nV D R p r o t e i n(91.4%),a n dn o s i g n a l p e p t i d e a n d t r a n s m e m b r a n e d o m a i nw e r e o b s e r v e d. T h ec o d i n g p r o t e i nc o n t a i n e da n N-t e r m i n a ln u c l e a rl o c a l i z a t i o ns e q u e n c ea n dt w oc o n s e r v e d d o m a i n s o fD N A b i n d i n g d o m a i na n dl i g a n db i n d i n g d o m a i n,s u g g e s t i n g t h a t i tb e l o n g e dt ot h e s t e r o i d/t h y r o i dh o r m o n e r e c e p t o r s u p e r f a m i l y.T h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d p E T-30a(+)-V D R w a s s u c c e s s f u l l y c o n s t r u c t e d a n d t h e r e c o m b i n a n tV D R p r o t e i n i n g e e s ew a s e x p r e s s e d.T h e p u r i t y o f t h e p u r i f i e dr e c o m b i n a n t p r o t e i n w a s m o r et h a n90%a n di t ss i z e w a s52k ua se x p e c t e d.T h e r a b b i t a n t i-g o o s eV D R p o l y c l o n a l a n t i b o d y w a ss u c c e s s f u l l yp r e p a r e d,a n dt h et i t e rw a s g r e a t e r t h a n1ʒ1093500.E x c e p t f o r t h e l i v e r t i s s u e,t h e p o l y c l o n a l a n t i b o d y w a s a b l e t o r e c o g n i z e t w o i s o f o r m so f n a t i v e V D R p r o t e i ni n k i d n e y,d u o d e n u m,j e j u n u m a n di l e u m i nl a y i n g g e e s e.ʌC o n c l u s i o nɔT h eC D S r e g i o no f V D R g e n e i n g e e s ew a s s u c c e s s f u l l y c l o n e d,a n d t h e r a b b i t a n t i-g o o s eV D R p o l y c l o n a l a n t i b o d y w a s p r e p a r e d.T h e p o l y c l o n a l a n t i b o d y h a dah i g hs p e c i f i c i t y a n d c o u l db eu s e d f o r f u r t h e r s t u d y o fV D R-m e d i a t e db i o l o g i c a l f u n c t i o n i n g e e s e.K e y w o r d s:g o o s e;V D R g e n e;c l o n i n g;p o l y c l o n a l a n t i b o d y维生素D3(v i t a m i nD3,V D3)是一类重要的类固醇激素,参与调控动物体内多种生理活动,包括钙-磷代谢㊁免疫调控和繁殖活动等[1-3]㊂V D3主要通过饮食摄入或由皮肤内7-脱氢胆固醇经紫外线照射而生成,其经肝脏25-羟化酶和肾脏1α-羟化酶分别介导的羟基化过程转化为具有生物活性的1,25-二羟基V D3(1,25(O H)2D3)㊂1,25(O H)2D3进入血液循环后通过与靶组织内的维生素D受体(v i t a m i nDr e c e p t o r,V D R)结合发挥生物学功能[4]㊂V D R是一种核转录因子,属于类固醇/甲状腺激素受体超家族成员[5]㊂人V D R基因编码427个氨基酸残基,包含3个结构域:N-端的D N A结合域(D N Ab i n d i n g d o m a i n,D B D)㊁C-端的配体结合域(l i g a n db i n d i n g d o m a i n,L B D)以及两者之间的链接区[6]㊂与人㊁小鼠和大鼠等哺乳动物相比,禽类(鸡和鹌鹑)V D R基因编码2种长度V D R蛋白,分别包含451和437个氨基酸残基,这是由于单一V D R转录本中存在2个翻译起始位点造成的[7]㊂研究发现,鸡V D R基因主要在肾脏和小肠组织中表达,介导V D3参与体内钙-磷代谢调控[7];同时,V D R基因在产蛋鸡输卵管的子宫部(蛋壳腺)高丰度表达[8-9]㊂研究表明,V D3在肉鹅胫骨发育㊁钙-磷代谢和免疫调控等方面发挥重要作用[10-14]㊂此外,饲粮中V D3缺乏可导致种鹅的产蛋性能㊁血清生殖激素水平和蛋壳强度降低[15-17]㊂当前,V D3在禽类生产中的调控作用研究主要集中在生产性能和生理生化指标变化等方面,涉及分子调控机制的研究较少,这与禽类V D3代谢及V D R等相关基因的表达研究缺乏有关㊂本研究以产蛋扬州鹅为研究对象,克隆V D R 基因C D S序列并制备鹅V D R多克隆抗体,以期为后续开展V D R介导V D3调控鹅体内多种生理活动的分子机制研究提供基础支撑㊂1材料与方法1.1样本采集选择相同日龄产蛋高峰期的扬州鹅母鹅3只(来自江苏省农业科学院六合试验禽场),分别采集肝脏㊁肾脏㊁十二指肠㊁空肠㊁回肠等组织,置于液氮中速冻后,转移至―80ħ保存备用㊂1.2主要试剂R N AI s o l a t e rT o t a l R N AE x t r a c t i o nR e a g e n t㊁大肠杆菌B L21(D E3)感受态细胞和H i S c r i p tⅡQ R TS u p e r M i x f o r q P C R(+g D N A w i p e r)均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;P r i m e S T A R5911中国畜牧兽医51卷M a xD N AP o l y m e r a s e㊁N d eⅠ和X h oⅠ限制性内切酶均购自宝日医生物技术(北京)有限公司;R I P A L y s i sB u f f e r㊁B C A蛋白浓度测定试剂盒㊁辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔I g G和T M B显色液均购自上海碧云天生物技术有限公司;P e a s y -B l u n t S i m p l eC l o n i n g K i t㊁抗H i s标签鼠单克隆抗体和E a s y S e e W e s t e r nb l o t t i n g K i t发光液均购自北京全式金生物技术股份有限公司;N i-I D A R e s i n购自N o v a g e n公司;S e p h a r o s e4B琼脂糖购自G E公司;弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均购自S i g m a-A l d r i c h公司;p E T-30a(+)原核表达载体由江苏省农业科学院动物品种改良与繁育重点实验室保存㊂1.3P C R扩增及克隆按照R N A I s o l a t e r T o t a l R N A E x t r a c t i o n R e a g e n t说明书提取鹅肾脏组织总R N A后,按照H i S c r i p tⅡQ R T S u p e r M i xf o r q P C R(+g D N A w i p e r)说明书反转录成c D N A,―20ħ保存备用㊂根据G e n B a n k数据库中预测的鹅V D R基因m R N A序列(登录号:X M_048055997.1)设计4条引物,组成3对基因特异性引物,其中,引物对F1/ R2扩增N-端C D S区序列;引物对F2/R1扩增C-端C D S区序列;引物对F2/R2扩增中间重叠区域序列,引物序列见表1㊂以鹅肾脏c D N A为模板,按照P r i m e S T A R M a xD N A P o l y m e r a s e说明书分别扩增鹅V D R基因C D S区部分序列㊂P C R反应体系50μL:P r i m e S T A R M a x P r e m i x(2ˑ) 25μL,上㊁下游引物(10μm o l/L)各1μL,c D N A 1μL,灭菌水22μL㊂P C R反应程序:95ħ预变性5m i n;98ħ变性10s,68ħ退火延伸1m i n,共30个循环;72ħ延伸5m i n;4ħ保存㊂P C R扩增产物分别按照p E A S Y -B l u n t S i m p l eC l o n i n g K i t说明书进行平末端克隆,经菌液P C R鉴定后,挑选阳性菌液送南京擎科生物公司测序㊂利用D N A S t a r软件的S e q M a n程序进行序列拼接后,获得鹅V D R基因C D S全长序列㊂表1引物信息T a b l e1P r i m e r i n f o r m a t i o n引物P r i m e r s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')V D R-F1A T G T C C C A G C T C C A G A G C T CV D R-F2C C A C G T A C T C C G A C T T C A C CV D R-R1T C A G G A G A T C T C G T T G C C G AV D R-R2T C A A G C C G A C C T G G A A T T T C A C G A 1.4生物信息学分析利用D N A S t a r软件的E d i t S e q程序将鹅V D R 基因C D S核苷酸序列推导为氨基酸序列;利用M e g A l i g n程序分析不同物种(鸭(登录号:X P_ 027301301.1)㊁鸡(登录号:N P_990429.2)㊁人(登录号:N P_000367.1))间V D R蛋白序列的相似性;利用E x P A S y软件P r o t P a r a m在线程序(h t t p s:ʊw w w.e x p a s y.o r g/r e s o u r c e s/p r o t p a r a m)分析鹅V D R蛋白的理化性质;利用S c a n P r o s i t e在线程序(h t t p s:ʊw w w.e x p a s y.o r g/r e s o u r c e s/s c a n p r o s i t e)预测鹅V D R蛋白的结构域;利用P r o t S c a l e在线程序(h t t p s:ʊw w w.e x p a s y.o r g/r e s o u r c e s/ p r o t s c a l e)预测鹅V D R蛋白的亲/疏水性;利用S i g n a l P在线程序(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/se r v i c e s/S i g n a l P-6.0/)预测鹅V D R蛋白潜在的信号肽剪切位点;利用T MHMM在线程序(h t t p s:ʊs e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e s/ T MHMM-2.0/)预测鹅V D R蛋白的跨膜螺旋结构;利用P S O R T软件(h t t p s:ʊp s o r t.h g c.j p/)预测鹅V D R蛋白的亚细胞定位㊂1.5重组蛋白原核表达按照原核蛋白表达体系进行密码子优化后,通过基因合成方法获得鹅V D R基因C D S序列(5'和3'末端分别添加N d eⅠ和X h oⅠ限制性酶切位点),连接至p E T-30a(+)原核表达载体中,其中C-端融合表达H i s标签㊂重组质粒经N d eⅠ和X h oⅠ双酶切鉴定和测序验证正确后,命名为p E T-30a(+)-V D R㊂重组质粒p E T-30a(+)-V D R 转化大肠杆菌B L21(D E3)感受态细胞进行重组蛋白诱导表达,当菌液D600n m值达到0.6~0.8时,加入终浓度为0.2m m o l/L的I P T G15ħ诱导过夜㊂次日上午收集菌体,按照N i-I D A R e s i n说明进行重组蛋白纯化,获得鹅V D R重组蛋白㊂按照B C A蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度㊂重组蛋白经S D S-P A G E分离后,采用考马斯亮蓝染色法检测其纯度,采用W e s t e r nb l o t t i n g方法检测其特异性(利用抗H i s标签鼠单克隆抗体作为一抗)㊂纯化的鹅V D R重组蛋白小量分装后,―20ħ保存备用㊂1.6多克隆抗体制备以鹅V D R重组蛋白作为抗原,与弗氏完全佐剂混合后,免疫2只2~2.5k g新西兰白兔(江苏省农业科学院六合实验兔场),2~3周用弗氏不完全佐剂加强免疫1次,400μg/次㊂每天饲喂2次全价配合饲粮,自由采食和饮水㊂日常卫生防疫工作按69113期秦逸飞等:鹅V D R基因克隆及其多克隆抗体制备与鉴定照家兔饲养管理基本要求进行㊂动物实验经江苏省农业科学院实验动物伦理委员会批准,按照‘实验动物管理条例“进行㊂采用间接E L I S A法检测抗血清效价,待效价> 1ʒ50000时进行采血,混合纯化;将鹅V D R重组蛋白与S e p h a r o s e4B琼脂糖偶联制备成抗原亲和纯化层析柱,抗血清与P B S等量混合后缓慢上样,待抗体结合后用100m m o l/L甘氨酸溶液(p H2.7)洗脱,获得抗原亲和纯化抗体;纯化抗体置于10m m o l/LP B S溶液(p H7.4)中4ħ透析过夜,次日收集抗体;按照B C A蛋白浓度测定试剂盒说明书测定抗体浓度㊂纯化的兔抗鹅V D R多克隆抗体小量分装后,―20ħ保存备用㊂1.7抗体效价检测采用间接E L I S A法检测抗体效价,主要操作为:将鹅V D R重组蛋白用P B S溶液稀释至5μg/m L,加入酶标板中,100μL/孔,4ħ孵育过夜;次日,弃去包被液,P B S T溶液(含0.05%T w e e n-20)洗板3次后,加入5%牛血清白蛋白(B S A),200μL/孔,37ħ孵育1h;P B S T溶液洗板1次后,加入倍比稀释后的多克隆抗体溶液(3倍稀释,起始稀释比1ʒ500),每孔100μL,37ħ孵育1h㊂P B S T溶液洗板3次后,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔I g G, 100μL/孔,37ħ孵育1h;P B S T溶液洗板3次后,加入T M B显色液,100μL/孔,37ħ孵育15m i n;加入1m o l/L H C l溶液,100μL/孔,终止反应,即刻在酶标仪上读取450n m吸光度㊂将D450n m值大于阴性对照D450n m值2.1倍的孔所对应的稀释度定为该抗体的效价㊂1.8鹅V D R蛋白组织特异性表达检测按照R I P AL y s i sB u f f e r说明书提取鹅肝脏㊁肾脏㊁十二指肠㊁空肠㊁回肠等组织总蛋白,按照B C A 蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度,―20ħ保存备用㊂以兔抗鹅V D R多克隆抗体作为一抗,通过W e s t e r nb l o t t i n g方法检测V D R蛋白在产蛋鹅不同组织(肝脏㊁肾脏㊁十二指肠㊁空肠和回肠)中的特异性表达㊂总蛋白经S D S-P A G E分离后转印至P V D F膜上,置于5%脱脂奶粉中室温封闭2h;加入兔抗鹅V D R多克隆抗体或抗H i s标签鼠单克隆抗体,4ħ孵育过夜;次日用T B S T溶液(含0.05%T w e e n-20)洗膜3次,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔I g G,室温孵育2h;用T B S T溶液洗膜3次,加入E a s y S e e W e s t e r n b l o t t i n g K i t发光液,置于I m a g e Q u a n tL A S4000化学发光成像仪中曝光㊁拍照㊂2结果2.1鹅V D R基因克隆与生物信息学分析以鹅肾脏c D N A为模板,使用3对特异性引物(F1/R2㊁F2/R1㊁F2/R2)扩增出3段V D R基因C D S序列,长度分别为1033㊁821和531b p(图1)㊂经克隆测序和序列拼接后,获得鹅V D R基因C D S 全长序列㊂该序列长度为1356b p,编码451个氨基酸,与N C B I数据库中预测的鹅V D R基因C D S 序列(登录号:X M_048055997.1)相一致㊂由表2可知,该编码蛋白与鸭㊁鸡和人V D R基因编码蛋白的相似性分别为99.3%㊁91.4%和81.2%㊂M,D L5000D N A M a r k e r;1~3,引物对F1/R2㊁F2/R1㊁F2/ R2的P C R扩增产物M,D L5000D N A M a r k e r;1-3,P C Ra m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s o f p r i m e r p a i rF1/R2,F2/R1a n dF2/R2,r e s p e c t i v e l y图1鹅V D R基因C D S区P C R扩增结果F i g.1P C Ra m p l i f i c a t i o n r e s u l t s o f V D R g e n eC D S i n g e e s e表2不同物种V D R基因编码蛋白相似性比对T a b l e2S i m i l a r i t y a l i g n m e n t o f p r o t e i n e n c o d e d b y V D R g e n e a m o n g d i f f e r e n t s p e c i e s%物种S p e c i e s鸭A n a sp l a t y r h y n c h o s鸡G a l l u sg a l l u s人H o m os a p i e n s 鹅G o o s e99.391.481.2鸭A n a s p l a t y r h y n c h o s91.181.5鸡G a l l u s g a l l u s80.37911中 国 畜 牧 兽 医51卷生物信息学分析显示,V D R 蛋白分子质量为51255.59u ,等电点为5.78;呈亲水性,无信号肽,无跨膜结构域(图2A~2C );N -端含有核定位序列(第47―73位氨基酸),同时包含N -端D B D (第44―119位氨基酸)和C -端L B D (第150―447位氨基酸)2个保守结构域(图2D ),表明V D R 蛋白属于类固醇/甲状腺激素受体超家族成员㊂A~D ,亲/疏水性㊁信号肽㊁跨膜区及结构域预测A -D ,P r e d i c t i o no f h y d r o p h i l i c i t y /h y d r o p h o b i c i t y ,s i g n a l p e p t i d e ,t r a n s m e m b r a n e a n d s t r u c t u r a l d o m a i n s ,r e s p e c t i v e l y 图2 鹅V D R 蛋白生物信息学分析F i g .2 B i o i n f o r m a t i c s a n a l ys i s o fV D R p r o t e i n i n g e e s e 2.2 鹅V D R 基因重组表达载体构建与鉴定本试验通过基因合成方法获得经密码子优化后的鹅V D R 基因C D S 序列,连接至p E T -30a (+)原核表达载体中,重组质粒经N d e Ⅰ和X h o Ⅰ双酶切后,电泳检测到2条带:一条为线性化的p E T -30a (+)载体,一条为V D R 基因(图3),片段大小均符合预期㊂2.3 鹅V D R 重组蛋白原核表达、纯化与鉴定将鹅V D R 重组质粒转化大肠杆菌B L 21(D E 3)表达菌株后,I P T G 低温诱导重组蛋白表达,结果显示,重组蛋白在菌体破碎后的上清液中表达,经镍柱纯化处理后,获得的重组蛋白大小为52k u (图4A ),与预期目的蛋白长度基本相符;与B S A 蛋白(66k u )相比,重组蛋白纯度较高(90%以上,图4B ),且大小符合预期;H i s 标签抗体检测到单一蛋白印迹条带(图4C ),大小符合预期,表明纯化的重组蛋白即为鹅V D R 重组蛋白㊂89113期秦逸飞等:鹅V D R基因克隆及其多克隆抗体制备与鉴定M ,D L 5000D N A M a r k e r ;1㊁2,p E T -30a (+)-V D R 重组质粒双酶切产物M ,D L 5000D N A M a r k e r ;1a n d2,E n z y m e d i g e s t i o n p r o d u c t s o f t h e r e c o m b i n a n t p E T -30a (+)-V D R p l a s m i d 图3 鹅V D R 基因重组质粒双酶切产物检测F i g .3 E n z y m e d i ge s t i o n p r o d u c t s of t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i do f V D Rg e n e i n g e e se M ,蛋白质分子质量标准;1,菌体破碎后上清液;2,流出液;3㊁4㊁洗脱液;5,B S A 蛋白;6,鹅V D R 重组蛋白;7,鹅V D R 重组蛋白(抗H i s 标签鼠单克隆抗体)M ,P r o t e i n M a r k e r ;1,S u p e r n a t a n ta f t e rb a c t e r i a lf r a g m e n t a t i o n ;2,E f f l u e n t ;3a n d 4,E l u e n t ;5,B S A p r o t e i n ;6,P u r i f i e d r e c o m b i n a n t g o o s eV D R p r o t e i n ;7,P u r i f i e d r e c o m b i n a n t g o o s eV D R p r o t e i n (a n t i -H i sm o u s em o n o c l o n a l a n t i b o d y )图4 鹅V D R 重组蛋白原核表达㊁纯化与鉴定F i g .4 P r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n ,pu r i f i c a t i o na n d i d e n t i f i c a t i o no f t h e r e c o m b i n a n tV D R p r o t e i n i n g e e s e 2.4 鹅V D R 多克隆抗体的效价检测以鹅V D R 重组蛋白作为抗原,通过抗原亲和层析方法制备并获得兔抗鹅V D R 多克隆抗体,间接E L I S A 法检测显示,兔抗鹅V D R 多克隆抗体的效价>1ʒ1093500(图5)㊂2.5 鹅V D R 多克隆抗体的特异性鉴定由图6可知,V D R 多克隆抗体在产蛋鹅不同组织中检测到多个蛋白印迹条带,除肝脏组织外,该V D R 多克隆抗体在肾脏㊁十二指肠㊁空肠和回肠组织中均检测到2条目的条带,表明兔抗鹅V D R 多克隆抗体能够特异性识别天然V D R 蛋白㊂图5 鹅V D R 多克隆抗体的效价检测F i g .5 T i t e r d e t e r m i n a t i o n o fV D R p o l y c l o n a l a n t i b o d yi n g e e s e 9911中国畜牧兽医51卷①M,蛋白质分子质量标准;1~5,肝脏㊁肾脏㊁十二指肠㊁空肠㊁回肠㊂②黑色箭头处为目的蛋白①M,P r o t e i n M a r k e r;1-5,L i v e r,k i d n e y,d u o d e n u m,j e j u n u ma n di l e u m,r e s p e c t i v e l y.②B l a c k a r r o w sr e p r e s e n tt a r g e t p r o t e i n s图6鹅V D R蛋白多克隆抗体特异性鉴定F i g.6S p e c i f i c i d e n t i f i c a t i o no f p o l y c l o n a l a n t i b o d y o fV D R p r o t e i n i n g e e s e3讨论V D3除了在维持动物机体内钙-磷稳态方面发挥重要作用外,还参与多种靶组织中细胞增殖㊁分化和成熟过程[18-21]㊂具有生物活性的V D3代谢物1,25(O H)2D3通过与其细胞核内受体V D R结合发挥生物学功能㊂因此,V D R基因克隆及其特异性抗体制备对于研究V D R介导V D3调控机体内多种生理活动的分子机制具有重要意义㊂3.1鹅V D R基因克隆在禽类中,鸡和鹌鹑V D R基因序列已被成功克隆[8]㊂但鹅和鸭V D R基因序列尚未被克隆㊂大量研究发现,V D3及其代谢物在调控肉鹅生长和种鹅繁殖方面具有重要作用[10-17],但缺乏相关的分子机制研究㊂鉴于此,本研究通过基因克隆方法成功获得了鹅V D R基因C D S区序列㊂其中,本研究根据参考序列设计了3对扩增区域重叠的鹅V D R基因特异性引物,与1对基因特异性引物相比,该方法进行P C R扩增的准确率更高,且避免发生片段缺失㊂该序列编码蛋白与鸡V D R蛋白的相似性较高,且N-端含有核定位序列,同时包含N-端D B D 和C-端L B D2个保守结构域,表明鹅V D R蛋白属于类固醇/甲状腺激素受体超家族成员㊂鹅V D R基因克隆为后续通过过表达和R N A干扰等方法调控基因表达以及鹅V D R多克隆抗体制备提供了材料㊂3.2鹅V D R重组蛋白表达目前,重组蛋白可以选择原核系统(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)或真核系统(酵母㊁昆虫细胞和哺乳动物细胞)进行表达,其中,大肠杆菌是重组蛋白表达的首选宿主,主要因其易于操作㊁培养成本低㊁生长迅速,且蛋白产量高[22]㊂本研究选择原核表达系统(大肠杆菌)进行鹅V D R重组蛋白的表达,其中,鉴于原核生物与真核生物的密码子使用偏好性不同,本研究将鹅V D R基因C D S区的核苷酸序列按照原核蛋白表达体系进行了密码子优化,以提高重组蛋白翻译和表达效率㊂此外,本研究采用I P T G 低温诱导方法,使鹅V D R重组蛋白在菌体破碎后的上清液中表达,便于后续在非变形条件下进行镍柱纯化㊂低温诱导可使蛋白缓慢合成,利于蛋白正确折叠形成可溶性蛋白;反之,蛋白表达速度过快,来不及正确折叠形成不溶性蛋白(包涵体)㊂与以包涵体形式表达的重组蛋白相比[23],本研究中的重组蛋白无需进行变性-复性处理,得率更高,且具有生物学活性的可能性更高㊂纯化后的重组蛋白能够被抗H i s标签抗体特异性识别,且大小符合预期,表明本研究成功获得了鹅V D R重组蛋白㊂3.3鹅V D R多克隆抗体制备为了检测靶组织中V D R蛋白的定位与表达,本研究利用纯化的鹅V D R重组蛋白作为免疫原,制备了兔抗鹅V D R多克隆抗体㊂根据H u i等[9]在鸡上关于V D R基因和蛋白表达的研究结果,本研究选择产蛋鹅肾脏和小肠(十二指肠㊁空肠㊁回肠)作为阳性样本,肝脏作为阴性样本,使用兔抗鹅V D R 多克隆抗体检测V D R蛋白的表达情况,结果表明,该多克隆抗体在鹅肾脏和小肠中能够特异性识别2条V D R蛋白条带㊂根据L u等[7]研究报道的鸡V D R基因编码2种V D R蛋白亚型,本研究推测这2种V D R蛋白亚型也是由单一鹅V D R转录本中存在2个翻译起始位点造成的㊂H u i等[9]使用商业化的大鼠抗鸡V D R单克隆在产蛋鸡肾脏和小肠中仅识别到1条V D R蛋白条带,表明本研究制备的鹅V D R多克隆抗体特异性更高㊂与单克隆抗体识别单一抗原表位相比,多克隆抗体能够识别多个抗原表位,可以提高检测的灵敏度,也更容易检出丰度偏低的蛋白㊂另外,本研究获得的鹅V D R重组蛋白可能更接近鹅体内天然的V D R蛋白,因此该多克隆抗体能够识别天然V D R蛋白的不同亚型㊂何赛等[24]研究表明,将鸡生长激素基因编码区序列克隆至p E T-30a(+)载体中并转化大肠杆菌B L21 (D E3)感受态细胞后,经I P T G低温诱导表达,获得的鸡生长激素重组蛋白具有生物学活性㊂但是,该00213期秦逸飞等:鹅V D R基因克隆及其多克隆抗体制备与鉴定多克隆抗体在产蛋鹅肝脏中没有检测到V D R蛋白条带,表明肝脏仅是V D3代谢的重要组织,而不是发挥其生物学功能的靶组织㊂4结论本研究成功克隆了鹅V D R基因编码区序列,并制备了兔抗鹅V D R多克隆抗体,该多克隆抗体特异性高,能够识别天然V D R蛋白的2种亚型㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] MO R A J R,I WA T A M,V O N A N D R I A N U H.V i t a m i ne f f e c t so nt h ei m m u n es y s t e m:V i t a m i n s Aa n d D t a k e c e n t r e s t a g e[J].N a t u r e R e v i e w sI m m u n o l o g 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鸽蛔虫ITS rDNA的克隆与序列分析
鸽蛔虫ITS rDNA的克隆与序列分析摘要:以采自广东省佛山市的鸽蛔虫(Ascaridia columbae)为研究对象,利用保守引物BD1和BD2扩增鸽蛔虫基因组DNA的ITS rDNA片段,对扩增产物进行克隆和序列测定｡结果成功扩增出大小为1 045 bp的ITS rDNA序列｡获得的鸽蛔虫的ITS rDNA序列(AC001､AC002)的5.8 S rDNA与GenBank收录的鸡蛔虫5.8 S rDNA序列(GenBank登录号为AJ001508)相似性分别为95.5%和94.3%,而与澳大利亚鸽蛔虫5.8 S rDNA序列(GenBank登录号为AJ001509)相似性分别为96.8%和95.5%｡将获得的序列与蛔目不同科的代表性蛔虫的5.8 S rDNA序列进行比对和系统进化分析,结果表明鸽蛔虫与鸡蛔虫处于同一进化分支上,也表明ITS rDNA是蛔虫分子鉴定的有效遗传标记,这对蛔虫分子分类学及分子流行病学的进一步研究打下了基础｡关键词:鸽蛔虫(Ascaridia columbae);ITS rDNA;序列分析;系统进化分析Clone and Sequence Analysis of ITS rDNA of Ascaridia columbaeAbstract:The internal transcribed spacer(ITS) rDNA of roundworm(Ascaridia columbae) samples collected from Foshan, Guangdong were amplified by PCR using a pair of conserved primers BD1 and BD2. Then the sequence was cloned, sequenced and analyzed. The results showed that the ITS rDNA sequence of A. columbae was 1 045 bp. The similarity of 5.8 S rDNA sequence of A. columbae (AC001, AC002) to that of A. galli (GenBank Accession number, AJ001508) was 95.5% and 94.3% respectively; and to that of Australian A. columbae (GenBank Accession number, AJ001509) was 96.8% and 95.5% respectively. Alignments and phylogenetic analysis of 5.8S rDNA sequences of A. columbae and representative species in different families of Ascaridida showed that A. galli and A. columbae were in the same evolutionary branch. It was proved that ITS rDNA was effective genetic marker of Ascaridida, which layed the foundation for molecular taxonomic and epidemiological research of Ascaridida.Key words:Ascaridia columbae; ITS rDNA; sequence analysis; phylogenetic analysis鸽蛔虫(Ascaridia columbae)是禽蛔科禽蛔属的一种大型线虫,主要寄生于鸽､孔雀等的小肠,具有较广泛的地理分布｡鸽感染了鸽蛔虫后的主要症状表现为食欲不振､精神沉郁､下痢､消瘦､贫血,直至衰竭死亡｡幼鸽易感,成鸽感染后会导致消瘦､飞行力下降,对养鸽业的危害很大｡传统的蛔虫鉴定方法是依据虫体进行形态学鉴定,此法简单易行,鉴定成虫比较准确,但对于蛔虫的虫卵和幼虫,形态学鉴定往往具有局限性｡近些年来,随着现代分子生物学技术的不断发展,将PCR扩增和序列分析技术相结合,可以从基因水平揭示物种间的差异和系统发生关系[1]｡在开展寄生虫的分子鉴定和分子分类学研究中,选择适当的遗传标记至关重要｡ITS是rDNA中介于18 S和28 S之间的内转录间隔区,包括ITS1､5.8 S rDNA和ITS2,进化速度快且长度不大,加上协同进化使该片段在基因组不同单元间十分一致,种内具有高度保守性,在不同种间又有不同程度的变异,是理想的种间鉴定的遗传标记,这对于寄生虫的分子分类学､分子遗传学､种(株)鉴定等方面的研究有重要意义[2,3]｡目前,尚未见到有关鸽蛔虫鉴定的报道｡为此,本试验通过对鸽蛔虫样品的DNA 提取,ITS rDNA克隆及序列分析,旨在鉴定出鸽蛔虫的种类,为进一步的分子遗传学和分子诊断学研究以及鸽蛔虫病的防治打下基础｡1 材料与方法1.1 材料鸽蛔虫采自广东省佛山市某鸽场,置于体积分数为70%的乙醇中保存,Ex Taq DNA聚合酶､EcoRⅠ､T4 DNA连接酶和pMD18-T载体均购自宝生物工程(大连)有限公司,蛋白酶K购自德国默克医药公司,UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司,DNA抽提试剂盒WizardTM DNA Clean-Up System购自Promega公司,大肠杆菌DH5α为华南农业大学兽医寄生虫学实验室保存｡1.2 方法1.2.1 鸽蛔虫总DNA的提取取单个鸽蛔虫成虫的一小段于1.5 mL离心管中,剪碎并研磨,然后加入275 μL的SDS DNA裂解液,混匀后放入微量恒温器中,于55 ℃作用16~18 h,每隔1~2 h振荡1次｡消化完全后,根据WizardTM DNA Clean-Up System使用说明,对虫体悬液进行提取｡1.2.2 引物的选择与合成参照文献[4-7]选择能扩增大部分线虫ITS rDNA基因的BD1和BD2分别作为上游和下游引物,其中BD1序列为5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3′,BD2序列为5′-ATGCTTAAATTCAGCGGGT-3′｡上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,预期扩增片段大小约1 000 bp｡1.2.3 ITS rDNA的PCR扩增向0.2 mL Eppendorf管中依次加入10×Buffer(不含Mg2+)2.5 μL､8.0 mmol/L dNTPs 2.0 μL､25 mmol/L MgCl2 2.0 μL､25 pmol/μL BD1 0.5 μL､25 pmol/μL BD2 0.5 μL,5 U/μL Ex Taq DNA聚合酶0.5 μL ､模板DNA 2.0 μL,最后补去离子水使PCR反应体系的总体积为25 μL｡PCR反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃､30 s,55 ℃､30 s,72 ℃､1 min,37个循环;72 ℃延伸10 min｡PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳分析｡1.2.4 ITS rDNA的克隆用UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒回收目的片段,将其连接到pMD18-T载体上,将重组质粒转化感受态细胞DH5α,涂布于含氨苄青霉素的LB平板上,于37 ℃培养过夜,挑取阳性菌落进行菌液PCR初步鉴定｡将阳性菌液送上海博尚生物技术有限公司进行核苷酸序列测定｡1.2.5 序列分析将所测定的序列与GenBank中所收录的相关序列进行比对｡使用DNAstar V5.07的EditSeq和Megalign程序进行序列分析,比较其核苷酸序列相似性和遗传关系,并在此基础上建立系统进化分析图｡2 结果2.1 鸽蛔虫ITS rDNA的PCR扩增结果将PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳,可见大小约1 000 bp的条带(图1),与预期目的片段大小一致｡用纯化回收试剂盒回收PCR产物并将之克隆到pMD18-T 载体上,转化至感受态细胞DH5α,取鸽蛔虫样品1､2的白色单菌落进行菌液PCR 鉴定,均得到大小约1 000 bp的条带｡2.2 序列比对结果选取鸽蛔虫样品1､2的阳性克隆样品送上海英俊生物技术有限公司测序,测序结果表明这两份样品的ITS rDNA序列大小均为 1 045 bp｡将获得的序列进行BLAST分析,结果表明,其5.8 S rDNA序列与鸡蛔虫的5.8 S rDNA序列(GenBank 登录号为AJ001508)的相似性分别为95.5%和94.3%,证明此ITS rDNA序列为蛔虫的｡然后利用DNAstar V5.07对2个样品的ITS rDNA序列进行比对,其同源性为98.7%｡2.3 系统进化分析结果用DNAstar V5.07将测序所得的鸽蛔虫的 5.8 S rDNA(AC001､AC002)与GenBank收录的其他蛔虫的相应序列进行比较分析,结果见图2和图3｡从图2和图3可知,从广东省佛山市分离的鸽蛔虫的5.8 S rDNA(AC001､AC002)序列和GenBank中所收录的澳大利亚鸽蛔虫､猪蛔虫､牛新蛔虫､人蛔虫､澳大利亚鸡蛔虫､简单异尖线虫､犬弓首蛔虫､猫弓首蛔虫和狮弓蛔虫的5.8 S rDNA序列存在着不同程度的差异｡其中,从广东省佛山市分离的鸽蛔虫的5.8 S rDNA序列(AC001､AC002)与澳大利亚鸽蛔虫5.8 S rDNA序列(GenBank登录号为AJ001509)处于并列位置,相似性分别为96.8%和95.5%,而与澳大利亚鸡蛔虫5.8 S rDNA序列(GenBank登录号为AJ001508)相似性分别为95.5%和94.3%,因此可以说AC001､AC002与AJ001509同源性较高,所以可以推断鸽蛔虫的5.8 S rDNA序列非常保守,但还是存在着国家或地区上的地理差异｡3 讨论随着生物种群的不断进化和发展,寄生虫的形态学鉴定越来越显出它的局限性,尤其对那些相似种或近缘种来说,从形态上很难进行区分,这时就需要采用其他方法来对寄生虫进行分类和鉴定｡随着分子生物学技术的发展,采用PCR方法对寄生虫某段具有种特异性的DNA进行序列分析成为寄生虫分类和鉴定的必要手段｡ITS是rDNA中介于18 S和28 S之间的内转录间隔区,包括ITS1和ITS2两段序列,在种内具有高度保守性,在不同种间又有不同程度的变异｡而在生物进化过程中18 S､5.8 S和28 S rDNA具有种内高度保守性,在不同种间又有不同程度的变异,是理想的种间鉴定的遗传标记[8-11]｡以ITS为遗传标记进行PCR扩增与序列比较已经成功地应用于多种寄生虫的分子水平的鉴定及分类｡因此试验也采用PCR扩增鸽蛔虫ITS rDNA并进行序列分析,从而对鸽蛔虫的分子鉴定和分子分类进行研究｡由于NCBI数据库对于鸽蛔虫的ITS1和ITS2序列暂时还没有报道,因此本试验未对ITS1和ITS2序列做进化分析｡而将鸽蛔虫的5.8 S rDNA(AC001､AC002)序列与AJ001509序列进行了比较,结果表明,澳大利亚鸽体内的鸽蛔虫的5.8 S rDNA序列和广东省佛山市鸽体内鸽蛔虫的5.8 S rDNA 有较高的同源性(分别为96.8%和95.5%),但还是存在着国家或地区上的地理差异｡该研究为鸽蛔虫分类､鉴定和遗传变异的进一步研究打下了基础｡参考文献: [1] CHILTON N B,GASSER R B,BEVERIDGE I. 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