利用CRISPRCas9系统构建FGF21基因敲除小鼠模型
CRISPRCas9技术构建小鼠模型
CRISPRCas9技术构建小鼠模型CRISPR小鼠实验随着CRISPR在2013年的出现，一切都发生了变化（Cong et al., 2013）！Haoyi第一次接触CRISPR是在他使用这项新技术设计小鼠模型时（Wang et al., 2013, Y ang etal., 2013）。
和其他人一样，Wenning也着迷于CRISPR，并马上加以应用。
他发现在实验中有75%的老鼠显示出了突变！本来很困难的实验居然一次成功了，这是不可思议的，但是也体现了CRISPR技术的“简单易操作”。
后来，他的经历被全世界许多人分享。
最终，这项被命名为CRISPR，以其概念简单，使用简单，性能稳定而被熟知。
在自然环境中，CRISPR-Cas9是细菌和古细菌中的获得性免疫系统。
它已被重新用于真核生物的基因组编辑，使用最广泛的CRISPR基因组编辑系统来自S. pyogenes。
而Streptococcus aureus中的另一种Cas9在编辑小鼠胚胎方面S. pyogenes的Cas9一样有效，并且由于其更小，所以更具优势（Zhang et al., 2016）。
为了编辑基因组，CRISPR/Cas系统使用了3种成分，一种约125 nt的guideRNA（gRNA）用于指定靶点；一种在靶点位置产生DNA双链断裂（DSB）的Cas9核酸内切酶以及一种供体寡核苷酸或质粒修复模板（用于敲入模型）。
用CRISPR建立小鼠模型的基础为了建立小鼠模型，将gRNA、Cas9和供体寡核苷酸或质粒组分聚集在一起，并显微注射到小鼠受精卵的细胞核或细胞质中。
或者为了避免体外处理胚胎，可以将这些成分电穿孔到怀孕雌鼠的输卵管中，这项技术称为通过输卵管核酸传递或GONAD（Gurumurty et al., 2016）。
当然，AAV也可用作载体，通过注射到卵母细胞或怀孕雌鼠的输卵管中递送CRISPR/Cas9系统（Y oon et al., 2018, Mizuno et al., 2018）。
基于CRISPRCas9技术的TRPS1基因敲除小鼠模型的构建
38基于CRISPR/Cas9技术的TRPS1基因敲除小鼠模型的构建李腾雁，刘文杰，赵宏，蔡建强*（国家癌症中心/ 国家肿瘤临床医学研究中心/ 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肝胆外科，北京 100021）李腾雁 博士研究生中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肝胆外科目的:基于CRISPR/Cas9技术构建敲除TRPS1基因的杂合子小鼠，并进行鉴定。
方法: C57BL/6N小鼠自行交配后，使用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法构建基因敲除小鼠，对可遗传的小鼠基因型进行鼠尾检测，TRPS1杂合子敲除小鼠分别与野生型小鼠交配，获得具有稳定基因型的小鼠。
结果:本实验通过使用Cas9/sgRNA注射受精卵的方法，所有繁殖小鼠经鼠尾基因型鉴定，证实成功构建了18只TRPS1基因敲除的杂合子小鼠。
结论:基于CRISPR/Cas9技术成功构建了敲除TRPS1基因的杂合子小鼠。
关键词：CRISPR/Cas9；TRPS1；结直肠癌；基因敲除小鼠摘要基金支持：国家自然科学基金(81672461) ；国家自然科学基金(81972311) ；深圳市“医疗卫生三名工程”（SZSM202011010）首都卫生发展科研专项项目(2018-1-4021)；中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2016-I2M-1-001,2017-12M-4-002) *通信作者：蔡建强************************Generation of TRPS1 knockout mice by CRISPR/Cas9-mediated gene targetingAbstractObjectives: This study aimed to construct and identify heterozygous mice knocked out of TRPS1 gene based on CRISPR/ Cas9 technology.Methods: After self-mating of C57BL/6N mice, TRPS1 knockout mice were constructed by injecting fertilized eggs with Cas9/sgRNA, and the mouse genotypes of heritable mice were detected by tail. TRPS1 heterozygous knockout mice were mated with wild-type mice to obtain mice with stable genotypes.Results: In this experiment, the fertilized eggs were injected with cas9 / sgRNA, all breeding mice were identified by tail genotype, 18 TRPS1 knockout heterozygous mice were successfully constructed.Conclusion: In this study, we successfully constructed TRPS1 knockout heterozygous mice based on CRISPR / cas9 technology, which provided a research platform for further research on the role of TRPS1 in the occurrence, development and possible liver metastasis of colorectal cancer at the animal level.Keywords: CRISPR/Cas9; TRPS1; Colorectal cancer; Gene knockout mouseLi Tengyan, Liu Wenjie, Zhao Hong, Cai Jianqiang*(National Department of Hepatobiliary Surgery, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/ Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100021, China)我国结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发病率和死亡率均保持上升趋势。
crispr-cas9基因敲除小鼠原理
CRISPR—CAS9基因敲除原理
CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。
CRISPR 是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。
在这一系统中,crRNA（CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA）结合形成双链RNA，此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的。
Cas9结合gRNA，gRNA 的长度约为80个核苷酸,包含两个区域:gRNA 5' 端前20个核苷酸对应于靶标DNA，能结合在靶DNA 上的约60个核苷酸（gRNA 长度取决于表达gRNA 的质粒）形成一个发夹结构，这个结构能帮助gRNA 与Cas9结合,并由此指导与DNA 的结合.
通过gRNA上的靶点序列，在目标基因组上找到靶点序列，并揭开双螺旋，Cas9将剪切DNA双链，造成DNA双链断裂。
Cas9使用简单，可满足多个靶点同时操作。
Insertion /deletion NHEJ HDR
gRNA
Cas9
Donor vector
基因敲除小鼠流程：。
使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案
使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案虽然近年来已经开发了几种基因组编辑工具，包括锌指结构和 TALENs（转录激活物样效应物核酸酶），但没有一种能像CRISPR/Cas9系统那样高效，该系统由一个RNA引导的DNA内切酶 (Cas9) 和对应的引导RNA(CRISPR) 组成。
利用该系统，研究人员能够实现一步敲除多个基因的等位基因的突变小鼠1。
只需两三周的时间，即可创造出子携带条件性等位基因和报告基因的小鼠2，并且该方案。
特别要注意的是，该过程不需要创建修改的小鼠ES细胞过程，该过程有时会十分困难3。
随着 Cas9 敲入和敲除小鼠的发展，预计越来越多的实验室将选择 CRISPR/Cas9 系统来生成转基因小鼠模型。
使用CRISPR-Cas9创建转基因小鼠的方案动物学研究。
2016 年 7 月 18 日；37(4): 205–213.利用 CRISPR/Cas9 和单倍体胚胎干细胞系统产生基因修饰的小鼠。
图 1.在小鼠胚胎上使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑创建转基因小鼠的示意图。
通过共注射 Cas9 mRNA 和向指导 RNA，多个基因靶标可以在小鼠胚胎中一次敲除。
（改编自Yang H，Wang H 和 Jaenisch R. Nat Protoc。
2014 年 8 月；9(8):1956-68.）Sigma-Aldrich 是为基因组编辑提供工具和定制服务的领导者，包括 ZFN 和CRISPR/cas9。
默克还提供了广泛的小鼠胚胎验证培养基和试剂组合，用于储存、转移和扩增用于在EmbryoMAX™名下创建转基因小鼠模型的小鼠胚胎。
浏览所有的基因组编辑产品浏览所有经小鼠胚胎验证的试剂小鼠胚胎和ES细胞培养基小鼠ES细胞培养基实验方案和过程成功的小鼠模型项目的提示1.了解实验目的并开展研究。
生成正确的小鼠需要完全理解被测试依据的假设。
例如，研究者可能希望验证这样的假设：突变肝脏中的转运蛋白可能会减轻特定药物的肝毒性作用。
基于CRISPR Cas9技术基因敲除小鼠(Cas9-KO)的制作方法-2018-2-28
基于CRISPR Cas9技术基因敲除小鼠（Cas9-KO）的制作方法一、CRISPR/Cas9靶向基因敲除小鼠制作的基本技术原理：通过CRISPR/Cas9基因敲除技术，crRNA通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合，形成双链RNA。
这一tracrRNA:crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶标的特定位点剪切双链DNA。
在与crRNA引导序列互补的位点，Cas9蛋白的HNH核酸酶结构域剪切互补链而Cas9 RuvC-like 结构域剪切非互补链，实现敲除目的基因的功能，制备基因敲除小鼠模型。
二、具体步骤如下：一）模型制作策略制作：利用生物信息学手段(NCBI&IMPC&MGI)，分别仔细分析目的基因敲除后小鼠的生存能力及繁育能力，并结合邻近基因的影响，最终选择合适的敲除区域进行敲除方案的设计，出具相应的制作策略。
二）载体的设计和构建：使用麻省理工学院的CRISPR Design工具（/），依据中靶Score的高低及脱靶Score的高低设计一对长度为20bp的针对靶标DNA的寡聚核苷酸链序列用于制备sgRNA，并在该靶区域设计引物用于后续阳性小鼠的基因鉴定。
1、制备sgRNA的实验方法步骤：1）线性化pUC57-GDNA-T7载体中提pUC57-GDNA-T7载体，用BsaI线性化过夜。
胶回收保存备用。
2）引物退火及加磷酸将上下游引物（干粉）稀释，再进行引物退火及加磷酸。
3）连接&阳性菌落筛选取步骤二中的加磷酸产物与线性化载体pUC57-GDNA-T7进行连接，该连接反应在干式恒温器中进行。
对连接产物进行转化，涂板，37°C培养箱过夜培养。
再用PCR&测序的方法筛选阳性克隆，再将测序正确的克隆进行甘油菌保种，-80°C保存备用4）制备转录模板以构建好的sgRNA载体为模板进行PCR扩增，将PCR产物切胶回收，回收产物离心后倒掉上清留DNA沉淀，再溶解DNA。
使用CRISPR-CAS系统构建可遗传的基因敲除小鼠和大鼠
使用CRISPR-CAS系统构建可遗传的基因敲除小鼠和大鼠致编辑：CRISPR-CAS系统已经成为一种细胞和模式生物中有效的基因编辑技术。
我们使用CRISPR-CAS系统，通过同时注入两种单导向RNA靶向Uhrf2,同时带入Cas9 mRNA来诱导小鼠的DNA片段缺失。
此外，我们通过一种单一的显微注射方法得到了敲除Mc3R和Mc4R两种基因的大鼠。
在小鼠和大鼠中均观察到较高的种系转移效率（突变可遗传）。
成簇有序间隔短回文重复关联蛋白系统（CRISPR-CAS系统）是一种在细菌和古细菌中演变的针对病毒和质粒入侵的基于RNA的后天免疫系统。
【Bamboo注：该系统由一段Cas基因（双链DNA核酸酶）加一段特异序列组成，Cas作用为结合导向RNA,切割目的基因，导向RNA为CRISPR序列转录而成，有二级结构】根据作用机制不同，CRISPR-CAS系统目前有三种类型。
在第二类型（下文称该系统）中，CRISPR序列转录RNA（crRNA）和反式激活RNA(TraceRNA)结合后有能力引导Cas9核酸内切酶到特定的序列，从而导致目标DNA双链缺失。
【Bamboo注：机理：摄取了病毒DNA后，CRISPR 序列在转录产物tracrRNA,表达产物CAS蛋白，RNA酶共同作用下产生导向RNA,导向RNA含有病毒DNA序列，可遗传给下一代，再遇到病毒DNA时将其剪切】之前的研究表明在哺乳动物中有多种基因工程使用RNA介导的Cas9核酸酶系统。
最近，使用该系统进行高效基因编辑已经在斑马鱼、小鼠和细菌中实现。
几个小组也证明通过该系统介导的在细胞和斑马鱼中基因靶向效率与ZFNs（锌指核酸酶）和TALENs（转录活化因子效应核酸酶）【Bamboo注：另外两种常见DNA编辑方式】相似或较高。
虽然已经有报道在单个小鼠胚胎中可使用该系统打乱多个基因，但是在动物体中尚未见该系统介导的突变种系转移。
此外，长的特异的基因组DNA片段能否被该系统敲除也是未知的。
基因敲除小鼠
基因敲除小鼠摘要基因敲除小鼠是一种常用的实验动物模型，可以帮助科学家研究基因在生物体发育和功能中的作用。
本文将介绍基因敲除小鼠的定义、用途以及常用的敲除方法，帮助读者了解基因敲除小鼠在生物学研究中的重要性和应用。
引言基因敲除小鼠是指通过干扰或删除特定基因，使小鼠体内该基因表达受到抑制或消失的实验模型。
这种模型被广泛应用于基因功能研究、疾病机制研究以及药物开发等领域。
基因敲除方法基因敲除小鼠的制备有多种方法，其中最常用的是胚胎干细胞敲除和CRISPR/Cas9系统。
胚胎干细胞敲除胚胎干细胞敲除是一种传统的基因敲除方法。
首先，从小鼠胚胎中获得胚胎干细胞，然后通过基因转染或基因突变等方式，使目标基因发生敲除突变。
最后，将敲除的胚胎干细胞注入到早期小鼠胚胎中，形成敲除小鼠。
CRISPR/Cas9系统CRISPR/Cas9系统是一种新兴的基因编辑技术，已经在基因敲除小鼠制备中得到广泛应用。
该系统利用Cas9核酸酶和特定的引导RNA来定向切割目标基因的DNA链，从而导致基因发生敲除或突变。
基因敲除小鼠的应用基因敲除小鼠在生物学研究中有着广泛的应用，以下是其中几个重要的应用领域：基因功能研究通过敲除特定基因，科学家可以观察与该基因相关的表型变化，从而揭示该基因在生物体发育和功能中的作用。
这对于揭示基因调控网络、疾病机制的研究具有重要意义。
疾病模型研究基因敲除小鼠常被用来构建各种疾病模型，如癌症、心血管疾病等。
这些模型可以模拟人类疾病的发生和发展过程，为相关疾病的研究提供了有力的工具。
药物开发基因敲除小鼠在药物开发中也起着重要的作用。
通过敲除特定基因可以观察药物对目标基因的影响，从而评估药物的疗效和安全性。
结论基因敲除小鼠是一种重要的实验动物模型，被广泛应用于基因功能研究、疾病模型研究以及药物开发等领域。
不同的敲除方法可根据具体实验需求选择使用。
基因敲除小鼠在解析基因功能、揭示疾病机制和评估药物疗效方面发挥着重要的作用，为生物学研究提供了强大的工具。
基因敲除小鼠研究方案
基因敲除小鼠研究方案基因敲除小鼠研究方案一、研究目标：通过基因敲除小鼠研究，探究目标基因在小鼠发育、生长、免疫系统等方面的功能和调控机制。
二、实验设计：1. 基因敲除小鼠模型的构建：选择合适的基因敲除技术，如CRISPR/Cas9系统，通过设计合适的sgRNA（single guide RNA）序列，引导Cas9核酸酶定点切割目标基因的DNA序列。
进而引发DNA修复机制，导致目标基因的插入、缺失或突变。
将CRISPR/Cas9系统构建为可表达载体，转染入小鼠胚胎干细胞中，克隆筛选敲除成功的细胞系。
2. 小鼠胚胎干细胞培养及注射：将敲除成功的小鼠胚胎干细胞注射到早期胚胎中，制备敲除小鼠模型。
养育敲除成功的小鼠。
3. 小鼠品系和样本采集：选择合适的小鼠品系，如C57BL/6小鼠品系。
在小鼠发育、生长、免疫等关键时期，如出生后不同天数、特定时间点等，采集合适的器官或细胞样本。
4. 小鼠表型分析：对敲除小鼠与野生型小鼠进行比较，通过外观、体重、行为、生理指标等方面的观察和实验测定，分析目标基因在小鼠生长发育等方面的影响。
5. 组织学和免疫组化分析：采集目标器官样本，进行组织学和免疫组化实验。
通过病理学检测、免疫组织化学染色等方法，观察目标基因在组织结构和免疫功能调控方面的作用机制。
6. 分子生物学实验分析：采集样本进行基因表达、蛋白质表达水平和分子机制等方面的实验分析，如实时定量PCR、Western blot等方法，研究目标基因对其他基因和信号通路的影响。
7. 数据分析：对实验获得的生物学数据进行统计学和生物信息学分析，建立基因敲除小鼠模型的相关数据库，以及通过差异分析、基因功能注释等方法，进一步探究目标基因的功能和相关调控网络。
三、预期结果：通过上述研究方案，可以获得目标基因敲除小鼠模型，并通过多个方面的分析来研究该基因对小鼠生长发育、组织结构、免疫系统等方面的功能和调控机制。
预期结果包括但不限于：敲除小鼠的表型差异和诱导的特异性疾病模型；目标基因调控的重要信号通路；基因与其他相关基因间的调控网络等。