Dicer1转基因小鼠模型的建立
基因治疗实验动物模型的建立方法与技巧
基因治疗实验动物模型的建立方法与技巧基因治疗是一种潜在的治疗方法，可以针对遗传性或获得性疾病进行基因修复或基因调控。
在研发这些治疗方法时，建立适合的实验动物模型非常重要。
实验动物模型能够模拟人类疾病的发展过程，为研究者提供了评估治疗效果和理解治疗机制的平台。
下面将介绍一些基因治疗实验动物模型的建立方法和技巧，希望能对您的研究工作有所帮助。
1.选择适当的动物模型在选择实验动物模型时，需要考虑疾病的发展机制和目标治疗的具体需求。
常用的实验动物包括小鼠、大鼠、猪和猴子等。
小鼠是最常用的实验动物，因为其遗传工具和疾病模型都非常丰富。
然而，对于某些疾病，如果小鼠模型无法很好地模拟人类疾病的特征，可以考虑使用其他更相似的动物模型。
2.选择合适的基因转导载体基因治疗通常涉及将期望的基因引入患者的细胞中。
在动物模型的建立过程中，选择合适的基因转导载体非常重要。
具体的选择因素包括负载量、转导效率和转导特异性等。
常见的基因转导载体包括腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）和质粒等。
3.优化基因治疗向量的表达为了使基因能够在目标器官或组织中稳定表达，需要对基因治疗向量进行优化。
其中的关键因素包括启动子选择、副本数和转移效率等。
启动子的选择应考虑目标组织的特征和需求，而副本数的调控则可以通过调整基因治疗载体的浓度等方法实现。
此外，也可以通过改变基因治疗向量的结构来提高转移效率。
4.验证动物模型的可靠性在建立基因治疗实验动物模型之后，需要进行充分的验证以确保其可靠性。
验证的内容可以包括疾病模型的真实性、基因治疗载体的转导效率和基因表达的稳定性等。
通过这些验证步骤，可以确保使用的动物模型足够可靠并符合研究的目的。
5.监测治疗效果和安全性在进行基因治疗研究时，需要定期监测治疗效果和安全性。
治疗效果可以通过基因表达水平、病理学和生物学指标等进行评估。
而对治疗的安全性评估则包括体重变化、脏器组织损伤等方面。
Dicer1转基因小鼠模型的建立
维普资讯
２０ ０ ８年 ８月 第 ｌ ６卷 第 ４期
中 国实 验 动 物 学 报
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转基因小鼠制备方法
转基因小鼠制备方法一、引言转基因小鼠是指通过基因工程技术将外源基因导入小鼠基因组中，使其表达或缺乏特定基因，从而研究基因功能、疾病模型等方面的动物模型。
转基因小鼠制备方法是实现转基因小鼠研究的重要步骤之一，本文将详细介绍转基因小鼠制备的一般步骤和常用技术。
二、转基因小鼠制备的一般步骤1. 选择目标基因和载体转基因小鼠制备的第一步是选择目标基因和适当的载体。
目标基因可以是外源基因、特定基因的突变体或基因敲除。
载体通常是带有选择标记（如抗生素抗性基因）和目标基因的质粒。
2. DNA构建在DNA构建过程中，首先需要将目标基因和选择标记基因插入到载体的适当位点上。
这可以通过限制性内切酶切割和连接、PCR扩增等方法实现。
构建完成后，需要进行酶切鉴定和测序确认。
3. 体外培养胚胎干细胞（ES细胞）转基因小鼠制备中常用的方法是利用ES细胞技术。
首先，从小鼠胚胎中获得内源性干细胞（ES细胞），并进行体外培养。
然后，将构建好的转基因载体导入ES细胞中，通过抗生素筛选获得带有目标基因的转基因ES细胞克隆。
4. 转基因小鼠制备转基因ES细胞的制备完成后，可以进行转基因小鼠的制备。
这一步骤通常有两种方法：内源性重组和外源性重组。
内源性重组是将转基因ES细胞注射到小鼠早期胚胎中，使其整合到小鼠的生殖细胞中，从而获得转基因小鼠。
外源性重组是将转基因ES细胞直接注射到小鼠的细胞团中，形成转基因胚胎，再将转基因胚胎移植到雌性小鼠子宫中，使其发育成为转基因小鼠。
5. 转基因小鼠鉴定转基因小鼠制备完成后，需要对其进行鉴定。
通常采用PCR、Southern blotting、Western blotting等分子生物学方法，检测转基因小鼠是否成功表达目标基因。
三、常用技术1. CRISPR/Cas9技术CRISPR/Cas9是一种新兴的基因编辑技术，可以实现高效、精确地对基因组进行编辑。
通过CRISPR/Cas9技术，可以直接在小鼠胚胎中进行基因编辑，从而制备转基因小鼠。
转基因小鼠的构建
转基因小鼠的构建
转基因小鼠的构建主要涉及到显微注射法或利用DNA转座子系统提高转基因的表达阳性率。
以下是具体的步骤：
1.准备阶段：选择适合构建转基因小鼠的受体小鼠，如7~8周龄雌性小鼠，并进行相应的生理调整，
如注射PMSG和HCG。
2.受精卵的获取：通过手术从供体小鼠的输卵管中取出受精卵，并在适当的培养条件下进行培养。
3.转基因操作：在显微镜下，将线性化的外源DNA片段或构建到转座子质粒中的外源待表达的DNA
片段，通过显微注射法直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到小鼠基因组中。
4.受体小鼠的准备：将受体小鼠麻醉后，进行受精卵的移植。
5.转基因小鼠的筛选和鉴定：通过PCR等方法对转基因小鼠进行筛选和鉴定，确认外源基因已经成
功整合到小鼠基因组中，并且能够过量表达。
需要注意的是，转基因小鼠的构建过程需要高度的专业知识和技术，同时还需要遵守相关的伦理和法规。
因此，在进行转基因小鼠的构建前，需要充分了解相关的知识和技术，并遵循相关的规定和指导原则。
转基因小鼠制备实验方法
转基因小鼠制备实验方法1.计划设计：首先确定研究目的和研究对象基因的功能。
根据目的，选择适合的转基因策略。
2.构建转基因载体：根据研究对象基因的序列，设计合成含目标基因的转基因载体。
一般可选择质粒、病毒载体或者合成RNA/DNA方式构建转基因载体。
3.构建胚胎干细胞（ES）或受精卵DNA库：通过开展反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方式，从小鼠胚胎组织中制备出RNA，然后利用逆转录酶将RNA转化成cDNA；之后，利用特定引物扩增目标基因的cDNA片段，将其克隆到适当的表达载体中，最终构建ES细胞库或者受精卵DNA库。
4.转染、筛选和克隆：将所构建的转基因载体导入到ES细胞或者受精卵中，使其整合到其基因组中。
然后，采用药物筛选、DNA分子标记、PCR和Southern blot等方法对转染后的细胞进行筛选和鉴定，获得含有目标基因的ES细胞克隆或者转基因小鼠胚胎。
5.基因敲除或添加：6.培养和培育：将获得的转基因ES细胞或者受精卵注入到养殖母鼠子宫中进行妊娠，然后等待幼鼠出生。
根据需要，可将转基因小鼠进行进一步培养、繁殖和鉴定。
为了进行转基因小鼠的后代繁殖，需要对转基因小鼠进行基因型鉴定和表型分析。
7.基因鉴定和表型分析：通过PCR、Southern blot、Western blot、RT-PCR或者其他的基因鉴定技术，对转基因小鼠的基因型进行鉴定。
同时，可以通过行为学、生理学和病理学等方法对转基因小鼠进行表型分析。
8.数据分析与结果解读：对表型数据进行统计分析，绘制图表或者进行统计学分析。
根据实验设计和方法，对实验结果进行解读，并得出相关结论。
总结起来，转基因小鼠制备是一个复杂而严谨的实验过程。
通过设计转基因载体、构建DNA库、转染和克隆、培养和培育小鼠以及基因鉴定和表型分析，可以成功制备目标基因转基因小鼠，并用于研究其功能、调控机制以及在疾病中的作用。
制备转基因小鼠的原理
制备转基因小鼠的原理
制备转基因小鼠的原理是通过基因工程技术将外源基因导入小鼠的基因组中。
具体步骤如下：
1. 选择目标基因：根据研究需求选择要导入小鼠基因组的外源基因。
这个外源基因可以来自其他物种，也可以是已存在于小鼠中但表达量较低的基因。
2. 构建质粒：将选择的目标基因与载体DNA（如质粒）连接。
质粒通常含有特定的启动子、终止子和选择性标记基因（如抗生素抗性基因），以便检测和筛选成功导入外源基因的小鼠。
3. 体外培养：将构建好的质粒导入细胞培养物中，利用细胞的自身复制和修复机制，使质粒与小鼠细胞的染色体发生重组，将外源基因导入到小鼠的基因组内。
4. 选择性筛选：为了筛选成功导入外源基因的细胞，可以添加抗生素等选择性标记物质，只有带有外源基因的细胞能够存活下来。
5. 胚胎干细胞注射：将筛选出的带有外源基因的细胞注射到小鼠的早期胚胎中。
这些细胞会参与胚胎发育，在小鼠的成体组织中形成细胞系，继续表达外源基因。
6. 交配和繁殖：将带有外源基因的小鼠进行交配和繁殖，使外源基因在小鼠种群中得以传递和稳定遗传。
通过以上步骤，外源基因成功导入小鼠基因组，并表达在小鼠的细胞和组织中，从而达到制备转基因小鼠的目的。
小鼠转基因技术流程
小鼠转基因技术流程ES细胞打靶在小鼠ES细胞中，利用同源重组原理（也就是核苷酸序列在两个相似或相同的DNA 分子之间交换的基因重组），获得带有研究者预先设计的遗传修饰的中靶ES细胞。
经过遗传修饰的ES细胞仍然保持分化的全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞，使得经过修饰的遗传信息经生殖系遗传，最终获得基因修饰小鼠模型。
发展至今，仍是最为经典、可靠的小鼠基因修饰或编辑技术。
目前南模生物可提供3种遗传背景的小鼠ES细胞：C57BL/6，129/S6，B6;129。
可用于获得以下类型小鼠模型：•基因敲除•条件性基因敲除•KO first•基因敲入•点突变•条件性点突变•定点基因过表达•人源化南模生物会对每个项目进行分析与评估，综合时间与风险因素从而选用最合适的技术（ES 细胞打靶或CRISPR基因编辑）。
联系我们，与南模生物的技术顾问讨论如何应用ES细胞打靶技术获得您的动物模型吧！利用ES细胞打靶技术获得小鼠模型的一般流程1.设计并构建同源重组载体2.将同源重组载体转入小鼠ES细胞中3.筛选并验证中靶的阳性ES细胞克隆4.将阳性ES细胞注射到小鼠囊胚腔中5.将注射后的小鼠囊胚移植到假孕母鼠子宫内6.获得并筛选验证阳性嵌合体小鼠F07.阳性F0通过与野生型小鼠或FLP小鼠交配获得F1代杂合子小鼠CRISPR基因编辑CRISPR / Cas9核酸酶系统需要两个组分：用于切割靶序列的Cas酶和与20个碱基对（bp）的靶序列结合指导RNA（sgRNA）。
利用靶点特异性的sgRNA 指导 Cas9 核酸酶在基因组上的特定靶点进行DNA双链剪切。
通过非同源末端连接（NHEJ）可导致移码突变，实现基因敲除（KO）；通过同源重组修复（HR）可将外源片段整合到基因组指定位点（KI）。
CRISPR基因编辑技术的优势•与传统的基因打靶方法相比，大大缩短了研发周期。
•打破对小鼠遗传品系的限制，实现不同遗传背景或在已有基因修饰小鼠模型基础上的基因编辑。
转基因小鼠的原理
转基因小鼠的原理转基因小鼠是指在小鼠的基因组中加入外源基因，使其表达外源基因或改变原有基因的表达方式和水平。
转基因技术是现代生物技术的重要研究工具之一，也被广泛应用于基础生物学和疾病研究中。
转基因小鼠的原理主要包括以下几个步骤：基因选择、基因构建、胚胎干细胞筛选和基因引入。
首先，在进行转基因小鼠研究之前，必须明确所需研究的基因以及其功能。
研究者可以选择与所研究功能相关的已知基因，或是通过基因信息库筛选潜在的新基因。
基因选择的关键在于确定所选择的基因与研究目标之间存在关联性，以确保研究的准确性和可靠性。
然后，将选定的目标基因构建成基因表达载体。
这一步骤包括将目标基因与适当的启动子、终止子和其他调控元件连接，以实现该基因的稳定和可控表达。
其中，启动子是指调控基因表达的启动信号来源，而终止子是标志基因表达终止的信号。
此外，还需要添加标记基因如荧光蛋白等，以便对转基因小鼠进行鉴定和筛选。
接下来，利用胚胎干细胞技术将构建好的基因表达载体导入小鼠胚胎干细胞中。
胚胎干细胞是具有自我更新和多向分化能力的干细胞。
将载体导入到胚胎干细胞中后，通过适当的培养条件和筛选标记基因，可以得到含有目标基因构建的转基因胚胎干细胞群。
最后，将转基因胚胎干细胞群经过特定的胚胎移植技术引入母体小鼠中，使其发育成为转基因小鼠。
转基因小鼠可以通过筛选基因进行鉴定和识别，如PCR或Southern blot等技术。
通过这种方式，研究者可以获得含有目标基因的转基因小鼠，并通过对其进行相关研究，进一步了解该基因的功能以及其在生物学和疾病研究中的潜在应用。
总的来说，转基因小鼠的原理是通过将外源基因导入小鼠基因组中，改变其基因表达方式和水平，从而实现对目标基因功能的研究。
这一技术的应用广泛，既可以用于探索基础生物学问题，也可以帮助我们更好地理解和治疗人类疾病。
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2008年8月第16卷 第4期中国实验动物学报ACT A LABORAT ORIUM ANI M A LIS SCIE NTIA SINICA August ,2008V ol.16 N o.4研究报告Dicer 1转基因小鼠模型的建立郑志红1,高峰2,杨葳1,汪瑛1,于洋1,周生来1,李兆阳1,吕相川1,张梅英1,王禄增1(1.中国医科大学实验动物部,沈阳 110001;2.中国医科大学附属第一医院,沈阳 110001) 【摘要】 目的 建立Dicer 1转基因小鼠模型。
方法 构建pcDNA3112Dicer1转基因构件,经酶切、纯化后通过显微注射方法导入BDF1小鼠受精卵原核并移植到同期受孕的ICR 受体母鼠输卵管内。
出生后仔鼠用PCR 和S outhern 方法检测鼠尾DNA 鉴定基因型,通过免疫组化检测Dicer 1基因表达。
结果 显微注射172枚卵,移植119枚卵于3只受体输卵管中,2只怀孕,共产仔15只,经PCR 检测获得6只阳性鼠,S outhern 检测6只均为阳性。
对S outhern 检测阳性转基因小鼠子代进行RT 2PCR 检测和免疫组化分析证明Dicer1基因在肝脏、肾脏、肺内均有表达。
对腹腔肿胀的转基因阳性1号鼠解剖发现肝脏、脾脏明显增大,胚胎发育异常。
结论 成功建立Dicer 1基因表达的转基因小鼠模型,该模型为进一步研究DICER 1基因功能及miRNA 的表达及功能等奠定基础。
【关键词】 Dicer 1;显微注射法;转基因小鼠【中图分类号】R -33 【文献标识码】A 【文章编号】100524847(2008)0420258203Establishment of a Dicer 1Transgenic Mouse ModelZHE NG Zhi 2hong 1,G AO Feng 2,Y ANG Wei 1,W ANG Y ing 1,Y U Y ang 1,ZH OU Sheng 2lai 1,LI Zhao 2yang 1,LU X iang 2chuan 1,ZH ANG Mei 2ying 1,W ANGLu 2zeng 1(boratory Animal Center ,China Medical University ,Shenyang 110001,China ;21The First A ffiliated H ospital of China Medical University ,Shenyang 110001,China )【Abstract 】 Objective T o establish a Dicer 1transgenic m ouse m odel.Methods pcDNA3112Dicer1construct was constructed ,linearized ,purified and then injected into superovulated pronuclear zyg otes to produce transgenic mice.The injected zyg otes were transplanted into the oviduct of pseudopregnant mice.The genotype of transgenic founders were identified by PCR and S outhern blot.The expressions of human Dicer 1protein in the tissues of the transgenic mice were detected by immunohistochemistry.R esults 172zyg otes were injected and 119zyg ote cells were transplanted into oviducts of 3recipients.15viable offsprings were born from 2of the 3recipients.G enomic DNA from baby tails was extracted.PCR and S outhern blot were used to identify transgenic founders of Dicer 1,and showed 6of the 15offsprings were positive transgenic mice of Dicer 11Dicer 1was expressed in the liver ,kidney and lung.Conclusion Dicer 1transgenic mice have been established success fully.The m odels will contribute to the research of Dicer gene function and the expression of miRNA.【K ey w ords 】 Dicer1;M icroinjection ;T ransgenic mice[基金项目]国家自然科学基金:30571836;辽宁省重点实验室专项资金:辽科发[2005]36号。
[作者简介]郑志红(1969-),女,研究方向:实验动物转基因与基因敲除。
E -mail :zhihongzheng @1631com[通讯作者]王禄增。
E 2mail :wanglz @1631com DICER 1基因与表观遗传调控密切相关,是2000年被克隆的,定位于人染色体14q32113,编码蛋白属于RNA 酶Ⅲ家族[1],在许多组织中广泛表达。
其功能是将具有颈环结构的RNA 或双链RNA剪切成长约21个碱基的成熟miRNA (或siRNA )[1]。
DICER 1蛋白是成熟miRNA 产生所必需的酶,DICER 1基因异常可导致不同组织、不同发育阶段miRNA 表达异常,DICER 1基因敲除的小鼠在胚胎发育过程中就发生死亡[2],无法通过敲除来详细研究该基因的功能。
由于DICER 1基因是发育过程中重要的调控基因,建立DICER 1转基因小鼠模型对研究该基因的功能具有重要的意义。
1 材料方法111 Dicer 1基因克隆及转基因构件制备按Dicer 1mRNA 序列设计正、反向引物,以MK N45(胃癌细胞系)细胞cDNA为模板,利用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增,PCR产物纯化后连接到pMD182T载体上,将连接产物转化感受态E.coli DH5α后进行质粒扩增并测序。
测序结果正确的pMD182T2Dicer用HindⅢ和K pnⅠ酶切回收目的片段并连接到pEG FP2C3载体的HindⅢ和K pnⅠ位点,转化、筛选并测序鉴定。
所得阳性克隆pEG FP2Dicer质粒用HindⅢ和ApaL Ⅰ酶切,回收目的片段与HindⅢ和ApaLⅠ酶切后的pcDNA311连接,经转化、筛选、测序鉴定阳性克隆。
所得到的阳性克隆,用PVUⅠ酶切,1%琼脂糖凝胶电泳,用QI Aquick G el extraction K it试剂盒纯化回收约6100bp长的目的片段。
纯化后DNA溶于microinjection bu ffer(pH714)中,注射浓度为3ngΠμL。
112 供体小鼠的准备及显微注射11211 超排小鼠:选用SPF级BDF1小鼠,于第一天下午15:00腹腔注射PMSG5I UΠkg,46～48h后(第3天)下午14:00腹腔注射HCG5I UΠkg,当日与正常雄鼠1∶1同笼交配,第4天早晨检查阴道栓,见栓的母鼠做为供体鼠。
11212 采集受精卵:将阴道见栓的雌性BDF1小鼠采用颈椎脱位法处死,收集输卵管,在显微镜下将其用镊子撕开使卵团滑出,并加入适量的透明质酸酶消化受精卵周围的颗粒细胞,快速的用M2洗3～5次后在显微镜下记录受精卵数量,随即将其转入隔夜预孵育的M16培养液中,将受精卵置于C O2培养箱待注射。
11213 显微注射:按文献[3]介绍的方法进行显微注射,将注射后状态良好的胚胎在C O2培养箱内孵育30min后移植。
113 胚胎移植用1%戊巴比妥钠0145m LΠ100g腹腔注射将假孕ICR小鼠麻醉,酒精消毒后剪背肾部毛,切开皮肤、皮下组织,取出卵巢、输卵管、子宫,用脂肪镊固定卵巢脂肪垫。
靠近输卵管小弯处剪口,将移卵管从剪口处插入输卵管,将受精卵吹进壶腹部,略停片刻再拔出。
将卵巢、输卵管、子宫复位,缝合创口。
做好移植记录卡片。
114 转基因小鼠PCR检测剪取出生后15d的仔鼠鼠尾015～1cm,用酚、氯仿提取DNA方法提取鼠尾DNA。
引物序列为: F5′2GG C ATGGG AAG AAAT C AG CC23′,R5′2ATTG A TG TG T CC AATGG CCG23′,扩增片段长487bp,PCR 反应条件为:95℃5min;94℃50s→60℃50s→72℃50s,30循环;72℃延伸10min。
用1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。
115 转基因小鼠Southern blot检测PCR检测阳性转基因小鼠及阴性对照鼠基因组DNA(约20μg)用HindⅢ过夜酶切,1%琼脂糖凝胶电泳,经凝胶处理后采用毛吸印迹法使DNA转移到尼龙膜上,用紫外交联的方法使DNA固定于膜上。
用PCR扩增Dicer1基因片段作为探针,32P标记后,纯化探针,进行杂交,洗膜,放射自显影。
116 免疫组化法检测Dicer1基因的表达取转基因阳性1号鼠和C57BLΠ6小鼠心脏、肝、脾、肺、肾脏组织,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,制备石蜡切片。
使用免疫组化SP试剂盒(迈新公司),进行基因表达检测。
一抗anti2human Dicer (I MGE NEX公司)。
DAB试剂显色,苏木素复染,梯度脱水,中性树胶封片,显微镜下观察。
117 转基因小鼠传代转基因阳性原代鼠与C57BLΠ6小鼠交配繁殖,产生的子代通过PCR检测鉴定,建立转基因阳性小鼠系。
2 结果211 显微注射、移植、产仔情况共注射172枚卵,移植119枚卵,3只受体,其中2(2Π3,66167%)只怀孕,共产仔15只。
212 移植后出生小鼠PCR检测结果PCR检测阳性的子鼠共6只,出生阳性率4010%(6Π15),移植阳性率3102%(6Π119)。
部分结果见图1。
注:M:D L2000marker;+阳性对照(pcDNA3112Dicer1);-空白对照;N:正常BDF1小鼠;1、3、6:转基因阳性鼠;2、4、5、7、8:转基因阴性鼠 图1 部分鼠尾DNA PCR检测结果 N ote:M:D L2000marker;+positive control(pcDNA3112Dicer1plasm id);-control;N:negative control BDF1m ouse,1,3,6:transgenic m ice;2,4,5,7,8:non2transgenic m ice Fig.1 E lectrophoretic results of PCR products of thetransgenic mice213 Dicer1转基因小鼠Southern检测结果对6只PCR检测阳性的Dicer1转基因小鼠S outhern检测均有特异整合目的条带。