CaMK_Cre转基因小鼠模型的建立
转基因小鼠制备实验方法
转基因小鼠制备实验方法1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。
2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。
3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。
受体笼拿出作好隔离措施。
4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。
显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。
5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。
6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。
7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。
DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。
8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。
将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。
9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。
手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。
吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。
除较长的那段液体，其余的液体大致1cm 左右，气泡0.2cm左右。
将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。
角质细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立-毛春明
皮肤是人体最大的器官, 它将人体内部与外界 隔开, 阻挡异物和细菌侵入, 防止体液丢失, 保持人 体内部环境稳定, 不受外界干扰, 是机体保护内部组 织免受外来伤害的第一道屏障。同时, 它还兼具调
节体温、感受外界刺激以及排泄等功能, 是机体重要 的器官之一。
在皮肤组织中特别是表皮层中的主要细胞成分 是角质细胞。由于所担负的功能不同, 角质细胞衍
角质素 5 是皮肤表皮层的角质细胞表达的一种 角质素, 它的缺失会导致皮肤基底细胞与旧基底膜 分离, 形成大疱[4] 。有研究证明, 角质素 5 具有在角 质细胞中特异表达的性质[ 5] , 是角质细胞的分子标 记物[ 6] , 在其他类型的组织和细胞中不表达。本研 究选用角质素 5( K5 ) 基因启动 子[ 7] , 用它指导 Cre 重组酶基因在角质细胞中表达, 并通过显微注射的 方法获得皮肤角质细胞特异性表达 Cre 重组酶的转 基因小鼠, 为应用 CrePloxP 系统研究目的基 因在皮 肤的发生、发育等生理和病理过程的功能创造条件。
PCR 产物的回收、DNA 的连接、转化、感受态大 肠杆菌的制备、质粒 DNA 的提取、DNA 片段的回收 等操作均按参考文献[ 10] 进行。
1. 3 受精卵的显微注射
回收并纯化注射片段, 按常规进行显微注射和 受精卵移植[ 11] 。实验 用昆明白小鼠由军事医学科 学院实验动物中心提供。
1. 4 转基因小鼠的基因型鉴定
( Genetic Laboratory of Devel opment and Diseases, Institute of Biotechnology , Academy of Military Medical Sci ences , Beijing 100071, China)
CaMKⅡα(基因启动子的克隆和神经细胞特异性Cre表达载体的构建
Ｃ ａ ｇ— ｅ ，删 ｈｎ ｗｎ
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Cre小鼠模型构建策略及方法特点
Cre小鼠模型构建策略及方法特点目前有四种常见Cre小鼠模型构建策略及方法，虽然每种方法都有其优势与不足，也很难说哪种策略方法，能够适合或满足所有研究目的。
所以，最终选择哪种方法，还是要根据研究目的具体情况决定。
1. 质粒表达载体的转基因Cre小鼠模型：认为是Cre小鼠构建的传统方法，因为最初的Cre小鼠模型，多是应用特定启动子加Cre基因cDNA的质粒载体，通过受精卵原核注射法，获得Cre随机插入基因组的转基因小鼠。
由于启动子大小的限制，只选择了一定范围的表达调控元件序列，构建Cre表达载体，加上转基因随机插入基因组的位置效应影响、拷贝数的差异、以及内源基因可能破坏等因素，使每个Cre首建鼠存在个体差异，且需要通过对每个首建鼠特征进行筛选与鉴定，获得特定理想的Cre转基因小鼠模型。
因此，通过传统转基因技术构建的Cre 小鼠模型，出现所谓Cre作用的“脱靶（off-target）” 活性，也就不奇怪了。
2. 定点敲入Cre小鼠模型：将Cre基因定点敲入相关内源基因位点，借助内源性基因调控序列确定Cre表达特征，已成为传统转基因Cre小鼠构建的替代选择，也增加了Cre基因表达活性的精确性。
应用CRISPR/Cas技术方法，将单拷贝Cre定点敲入相关内源基因位点，按以下几种策略方式敲入：（1）特定内源基因翻译启始位点; （2）借助IRES序列连接，将Cre基因敲入内源基因的3’ UTR区域；（3）借助2A“自切割”肽连接，将Cre基因替换并敲入内源基因的终止密码处。
一般而言，直接将Cre敲入特定内源基因的翻译启始位点的策略，往往会同时破坏了该基因的表达。
有研究发现，因Cre敲入到生长发育或疾病通路等至关重要相关基因中，导致相应Cre小鼠，出现影响基因功能的潜在非特异性表型。
比如，Foxg1-Cre敲入小鼠模型，杂合Cre小鼠即出现小鼠前脑发育障碍。
所以，该策略只适合于哪些杂合缺失无表型的相关基因。
而应用IRES和2A敲入策略，避免了由Cre 特定位点敲入，可能引起的杂合缺失表型的不足。
使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案
使用 CRISPR-Cas9 创建转基因小鼠的方案虽然近年来已经开发了几种基因组编辑工具，包括锌指结构和 TALENs（转录激活物样效应物核酸酶），但没有一种能像CRISPR/Cas9系统那样高效，该系统由一个RNA引导的DNA内切酶 (Cas9) 和对应的引导RNA(CRISPR) 组成。
利用该系统，研究人员能够实现一步敲除多个基因的等位基因的突变小鼠1。
只需两三周的时间，即可创造出子携带条件性等位基因和报告基因的小鼠2，并且该方案。
特别要注意的是，该过程不需要创建修改的小鼠ES细胞过程，该过程有时会十分困难3。
随着 Cas9 敲入和敲除小鼠的发展，预计越来越多的实验室将选择 CRISPR/Cas9 系统来生成转基因小鼠模型。
使用CRISPR-Cas9创建转基因小鼠的方案动物学研究。
2016 年 7 月 18 日；37(4): 205–213.利用 CRISPR/Cas9 和单倍体胚胎干细胞系统产生基因修饰的小鼠。
图 1.在小鼠胚胎上使用 CRISPR/Cas9 基因组编辑创建转基因小鼠的示意图。
通过共注射 Cas9 mRNA 和向指导 RNA，多个基因靶标可以在小鼠胚胎中一次敲除。
（改编自Yang H，Wang H 和 Jaenisch R. Nat Protoc。
2014 年 8 月；9(8):1956-68.）Sigma-Aldrich 是为基因组编辑提供工具和定制服务的领导者，包括 ZFN 和CRISPR/cas9。
默克还提供了广泛的小鼠胚胎验证培养基和试剂组合，用于储存、转移和扩增用于在EmbryoMAX™名下创建转基因小鼠模型的小鼠胚胎。
浏览所有的基因组编辑产品浏览所有经小鼠胚胎验证的试剂小鼠胚胎和ES细胞培养基小鼠ES细胞培养基实验方案和过程成功的小鼠模型项目的提示1.了解实验目的并开展研究。
生成正确的小鼠需要完全理解被测试依据的假设。
例如，研究者可能希望验证这样的假设：突变肝脏中的转运蛋白可能会减轻特定药物的肝毒性作用。
转基因小鼠技术
---转基因小鼠的构建
李懿萍
2010.05.20
2019/1/6
1
基因打靶的简易程序
2019/1/6
2
胚胎干细胞（ES细胞）法
优点： 外源基因整合情况的可控性高 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、 表达的水平及插入的稳定性 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛 选方便 缺点： ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体
细菌-动物细胞-转基因动物
2019/1/6 38
转基因动物生物反应器研制
乳腺生物反应器具有以下特点： ⑴乳腺是自我封闭系统，乳腺表达的蛋白质不回流到血液循 环系统，避免外源基因表达的蛋白质对动物本身的影响； ⑵乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器； 一头奶牛一年可生产乳蛋白250—300Kg，一只绵羊或山羊 一年可生产乳蛋白25—30Kg。如果有百分之一的乳蛋白代 换成医用蛋白，产量十分可观。 ⑶乳腺分泌的基因产物不但产量高，而且易提纯。表达的蛋 白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。生物活性 接近天然产品； ⑷在动物乳腺表达的外源基因可以遗传，可用常规技术繁殖 生产群体。
17. 1996年 -- “百慕大法则”
公共基因组序列数据
18. 1998年 -- 克隆鼠
1997年克隆羊“多莉”诞生之后，夏威夷的一个小组培育出 了第一批克隆鼠——“Cumulina”和她的姐妹们。
2019/1/6
32
小鼠的历史
19. 1999年 -- 小鼠基因组测序协会
人类基因组三个主要测序中心（The Wellcome Trust Sanger Institute, The Whitehead Center for Genome Research 和 Washington University Genome Sequencing Center）成立了一个相互协作的小鼠基因 组测序机构，取名为小鼠基因组测序协会（Mouse Genome Sequencing Consortium ,MGSC)
人心肌肌钙蛋白C两种突变转基因小鼠模型建立与对比分析
人心肌肌钙蛋白C两种突变转基因小鼠模型建立与对比分析高珊;陈伟;刘宁;葛文萍;高翔;吕丹;张连峰;董伟【摘要】Objective To established cardiac-specific transgenic mice of the cTnC D145E and cTnCG159D and compare the HCM and theDCM.Methods The cTnCD145E and cTnCG159D were generated by site-directed mutagenesis and the transgenic plasmids were constructed by insertion of the mutant genes under the control of α-MHC, which is a myocardium specific promoter.The transgenic mice were generated by microinjection and were all maintained on a C57BL/6J genetic backgroud .The cardiac structure and function of the transgenic mice were compared and analysized by echocardiographic and pathological observation at different ages .Results The cTnCD145E and cTnCG159D transgenic mice were established and developed to HCM and DCM, respectively, with aging.The left ventricular end-systolic volume (ESV) and left ventricular end-diastolic volume ( EDV) decreased and ejection fraction ( EF) and left ventricular end-systolic posterior wall thickness (ESPWT) increased in the cTnCD145E transgenic mice, while EDV and ESV increased and EF and ESPWT decreased in the cTnCG159D transgenic mice at 12 months of age.Conclusions Cardiac-specific human cTnCD145E transgenic mice showed HCM phenotypes , and cardiac-specific human cTnC G159D transgenic mice showed DCM phenotypes , which can be used as different models for comparative study of the pathogenesis of cardiomyopathy .%目的：为建立心肌组织特异性表达人cTnCD145E和cTnCG159D突变基因转基因小鼠，为对比分析两种不同心肌病的发生发展建立模型。
转基因鼠构建原理与流程
转基因鼠构建原理与流程
1、原核显微注射导入的目的基因是将目的基因随机整合到小鼠或者大鼠的基因组，因此首代转基因鼠（F0）将会有不同的整合位点。
整合基因的拷贝数可能在不同的首代转基因鼠中也不同。
因此，每只F0代鼠需要作为一个独立的谱系研究，并且与其它F0代鼠分开进行繁殖。
由于外源基因一般只整合在二倍体动物的其中一条染色体上，属于半合子，其后代只有一部分个体带有整合的基因，需要进行筛选鉴定。
2、原核显微注射获得PCR阳性F0代杂合子鼠。
3、F0代鼠达到性成熟后（8周）与野生型鼠进行交配，获得F1代鼠。
4、对交配获得的F1代鼠进行基因型鉴定，理论上，F1代鼠中有50%为转基因杂合子鼠，50%为野生型鼠。