南京农业大学生物化学课件31

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DNA Footprinting
2.转录过程-转录启动
二. 原核生物转录
由全酶在启动子附近将DNA局部解链，约解开 17个碱基对。（酶与启动子结合的部位是AT富集 区，有利于解链） 第一个核苷三磷酸(常常是GTP或ATP)结合到全
酶上，形成“启动子-全酶-核苷三磷酸”三元起
始复合物。 第二个核苷酸参入，连结到第一个核苷酸的3' 羟基上，形成了第一个磷酸二酯键。 s因子从全酶上掉下，又去结合其它的核心酶。
resulting siRNA as part of a multiprotein RNA-
inducing silencing complex (RISC) is targeted
to the complementary RNA species which is then cleaved.
siRNA: Small interfering RNA
specificity and efficiency.
What is the outcome, indeed ?
• Introduction into cells of a double-stranded RNA corresponding to an expressed gene leads to down-regulation of that gene
链，有的区段用作反义链。所以，具有相对意义。
1.转录的酶 —— RNA聚合酶
二. 原核生物转录
亚基组成：a2bb'ws = a2bb'w + s 全酶 核心酶
a亚基 —— 解开前方的DNA双螺旋、恢复 后面的DNA双螺旋
b亚基 —— 催化磷酸二酯键的形成
b'亚基 —— 与DNA的非模板链结合
1.转录的酶
En. Elem.
-180
Ap1
远距离控制，无方向性
促进转录复合体
基本转录复合体
GC CAAT TATA
ห้องสมุดไป่ตู้
+1
mRNA
4.基因沉默-iRNA
三. 真核生物转录
What is RNA interference (RNAi)
• RNA interference (RNAi) represents a mechanism invented by nature to protect the genome. In the past few years the field has emerged at a surprisingly high pace.
• The whole story started when Fire et al. (1998) identified double stranded RNA (dsRNA) as the mediator of gene silencing in C. elegans and referred to the term RNAi.
3.真核细胞的增强子
三. 真核生物转录
• 增强子、及其对转录的影响
a 增强子是指能使和它连锁的基因转录频率明显增加 的DNA序列；
b 增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加 10-200倍； c 增强效应与其位子和取向无关；
d 大多为重复序列，一般长度为50 bp，其内部常含有 一个核心序列(G)TGGA/TA/TA/T(G)；
TATA序列(TATA box)：-25 -35 TATA box的作用：使转录精确地起始； TATA序列也叫核心启动元件 (core promoter element)
CCAAT序列(CAAT box) ：-70 -80
CAAT区主要控制转录起始频率。 (GC box) GCCACACCC或GGGCGGG序： -80 -110; GC区主要控制转录起始频率。
DNA-binding domain activation domain
Dimerization domain (in some dimer factor)
DNA-binding domain
activation domain
• Transcription activation domain
have a very high proportion of acidic amino acid
What is RNA interference (RNAi)
• The underlying molecular mechanism of gene
silencing provides us with short interfering RNAs
(siRNAs) which allows to target any gene with high
二. 原核生物转录
亚基组成：a2bb'ws = a2bb'w + s 全酶 核心酶
s亚基：识别DNA上转录的起始部位，从而引 导全酶结合上去 核心酶：解开前方的DNA双螺旋、RNA链的延 伸、恢复后面的DNA双螺旋
此外，每个RNA聚合酶还含有2个Zn离子。
2.转录过程-转录启动
二. 原核生物转录
DNA上存在着转录的起始信号，它是特殊的核 苷酸序列，称为启动子（promoter）。转录是由 RNA聚合酶全酶结合于启动子而被启动的。
这些通用转录因子在启动子区同RNA聚合酶
一起组装成转录起始复合物;
特异性调控蛋白因子种类繁多，但含量即非常 之少，它们通过其DNA结合域识别特定的DNA序列， 这种特性决定了特异性开或关。
Specific Trans-factor characteristics
l 多为变构蛋白，具有两个功能结构域（domain）
1.真核细胞的聚合酶
三. 真核生物转录
真核细胞的转录比较复杂。真核基因的顺式作
用元件（cis-acting element），即DNA上对基因表
达有调节活性的特定序列，按其功能可分为启动子
、增强子（enhancer）和沉默子（silencer）等。真 核生物的转录，是由RNA聚合酶与这些元件相互作 用，在蛋白质辅助因子ρ的协同下完成的。
specifically knock down corresponding
mRNA in the cell
An enzyme complex (Dicer), was discovered in Drosophila (Bernstein et al., 2001) as part of a conserved Dicer family expressed in organisms undergoing RNAi. Dicer contains domains for dsRNA binding, RNA unwinding, and ribonuclease activity, and is associated with additional proteins to drive the cleavage of dsRNA in an ATPdependent manner. The
2.转录过程-转录启动
二. 原核生物转录
The nucleotide sequences of representative E. coli promoters
2.转录过程-转录启动
二. 原核生物转录
聚合酶全酶上的s因子能识别启动 子，并识别有义链，从而使全酶定位 到启动子部位。
如何确定
启动子部位
2. 启动子特异性转录激活蛋白
(promoter-specific transcriptional activators)
它们通过与启动了附近或远离启动子的DNA分 子上调控区(增强子)相结合，作用于转录起始复合
体组装过程，具有DNA结合域和激活转录所需要的
激活结构域。
一般情况，细胞中通用转录因子的种类同基因 转录的调控蛋白因子(包括转录激活蛋白、辅助激 活蛋白、负调控蛋白因子等)相比，数量较少，但 在细胞中的含量是丰富的；
2.转录过程-终止
二. 原核生物转录
DNA分子上有终止转录的特殊信号，也是特定
的核苷酸序列，称为终止子。 核心酶能识别终止子，停止转录。 这一过程有时需要一种蛋白质 —— 因子的
帮助（当终止信号较弱时）；有时不需要（当 终止信号较强时）。
核心酶释放出RNA，自己也离开DNA。 DNA上的解链区重新形成双螺旋。
e 增强效应有严密的组织和细胞特异性；
f 没有基因专一性； g 许多增强子还受外部信号的调控。
Enhancer 的结构与功能
双方向性，组织特异性，位点非专一性 ----Enhancer 由两个以上的增强子成分(Enhancer Element)组成
----Enhancer Element 必需由两个紧密相连, 具有间距效应的
through degradation of its mRNA
How does the siRNA work ?
• Introduction of synthetic small double-
strand oligonucleotide (21-23 nt length)
corresponding to specific gene into cell will
2.转录过程-链的延伸
二. 原核生物转录
DNA上的解螺旋区：在RNA链延伸的同时， RNA聚合酶继续解开它前方的DNA双螺旋，暴 露出新的模板链，而后面被解开的两条DNA单 链又重新形成双螺旋，DNA上的解螺旋区保持 约17个碱基对的长度。
2.转录过程-链的延伸
二. 原核生物转录
RNA-DNA杂交区：刚合成出来的RNA链与解开 的DNA模板链之间可形成一小段RNA-DNA杂交区。 随着核心酶的移动，RNA链不断地延伸，杂交区也往 前延伸，但后面的杂交区随着DNA双螺旋的回复， RNA链逐渐被置换出来，因此，杂交区也保持着固定 一小段。