基因功能研究与相关技术-
PNS载体
完全基因敲除
（Complete Knockout）
1 2 neo IREs lac Z
3
tk
靶基因 中靶等位基因
1
2
3
G418, GANC
1 2 neo IREs lac Z
3
Lim1 is Required for Head-organizer Function
Shawlot W & Behringer RR: Nature, 1995, 374:425
Bind antibodies specific to the DNA-binding protein to isolate the complex by precipitation. Reverse the cross-linking to release the DNA and digest the protein.
克隆和转化
1
2
3
4
5
6
7
利用RACE-PCR获得全长cDNA克隆
5‘ RACE-PCR 5‘
5‘
5‘ 3‘AAAA
AAAAAA……An 3’ RT with internal Antisense primer
AAAAAA……An 3’ terminal transferase and dATP
AAAAAA……An 3’ denature, anneal anchor primer and extend
Use PCR to amplify specific DNA sequences to see if they were precipitated with the antibody.
利用转基因和基因打靶技术 在生物整体水平上研究基因在 发育和疾病发生过程中的功能及其机制
模式生物的概念
A model organism is a species that is extensively
reporter gene
染色质免疫沉淀（ChIP）用于筛选在体内 与特定蛋白质相互作用的DNA序列
DNA-binding proteins are crosslinked to DNA with formaldehyde in vivo.
Isolate the chromatin. Shear DNA along with bound proteins into small fragments.
原位杂交
lim 1
E8.5
利用转基因动物 研究基因表达 的时空模式
Tie2 P lacZ polyA
利用转基因动物研究miRNA 表达的时空模式
Mansfield et al: Nature Genetics, 2004, 36:1079
利用cDNA array进行基因表达差异分析
+/+
HBsAg/HBsAg
模式生物的应用已有 100多年的历史，在生物学研究中具有不可 替代的重要作用。大多数生物学过程在长期的进化过程中是高度 保守的，因此，许多生物学过程在大多数或所有的模式生物中都 是类似的，模式生物也因此成为研究人类生物学过程和疾病发生 的重要工具。
模式生物的基本特征
发育迅速、世代周期短，利用这些模式生物很 容易在相对较短的时间内研究基因在许多世代 间的遗传 。 成年动物个体小。 繁育能力强，后代数量大，易于在实验室条件 下维持。 可操作性强。
TTTTTT AAAAAAAA
denature, anneal internal primer and extend
TTTTTT AAAAAA
PCR with internal and Anchor primers
5‘
TTTTTT
3‘
3‘
AAAAAA
5‘
TTTTTT 3‘AAAAAA
基因结构和转录起始位点研究
without Nuclear extract
with Nuclear extract
利用培养细胞在蛋白质水平研究 基因的表达和功能
利用抗体检测基因的表达模式。 蛋白质工程是研究基因功能的有效手段。 利用免疫共沉淀、噬菌体表面呈现技术、 酵母双杂交系统研究蛋白质-蛋白质间的 相互作用。 利用染色质免疫沉淀研究蛋白质与DNA 的相互作用。 蛋白质组学研究。
利用无启动子报告基因表达载体 鉴定基因的调控序列
1
2 3
P
4
reporter pA
连接并转染特定细胞
reporter pA
reporter pA
P reporter pA
检测报告基因的活性
reporter pA
利用DNase I 足迹分析研究DNA上 的蛋白质结合位点
Partial DNase I
在体细胞中实现基因敲除
( Gene Knockout in Somatic Cells )
Lasker Fundation Press release
基因打靶（gene targeting）：在基因组水平上定位改变细胞或生物 个体基因结构的实验技术。 条件基因打靶（conditional gene targeting）：通过同源重组和位点 特异性重组技术在特定细胞类型或者特定发育阶段对基因进行定位 修饰的实验技术。 基因敲除（gene knockout）：又称基因剔除。通过同源重组或位点 特异性重组在基因组水平上改变特定基因结构， 使其功能完全丧失 的实验技术。 条件基因敲除（conditional gene knockout）：又称“条件基因剔除”。 通过同源重组技术和位点特异性重组在特定细胞类型或者特定发育 阶段使基因功能完全丧失的实验技术。 组织特异性基因敲除（tissue specific gene knockout）：又称“组织 特异性基因剔除”。 在特定组织细胞类型中使基因功能完全丧失的 实验技术。 基因敲入（gene knockin）： 通过同源重组或位点特异性重组在基 因组特定位置引入外源基因的实验技术。
利用培养细胞在核酸水平研究 基因的表达和调控
利用Northern杂交、原位杂交、RT-PCR、 mRNA表达差异显示技术研究基因的表达 模式。 利用报告基因和缺失突变分析鉴定基因的 调控序列。 用 Gel retardation、DNase 足迹分析研究 DNA上的蛋白质结合位点。
Northern-blot
基因功能研究与相关技术
滕艳
生物工程研究所 发育和疾病遗传学研究室
结构基因组学 功能基因组学
基因组分析的初级阶段，主 要任务是系统产生及分析基 因及基因组结构信息。
以DNA序列测定为主要手段。
以获得高精度的遗传图谱、 物理图谱、转录图谱为最终 目的。
生物信息学侧重于数据组织 和管理。
基因组分析的新阶段，主 要任务是系统产生及分析 基因功能相关的信息。
A
5.0 kb
1
2
3
4
B
1 2 3 4 5 67 8
5.0 kb 4.4 kb
Smad3基因在小鼠不同胚胎期及成体各组织器官中的表达。 A、Northern杂交结果显示Smad3基因在小鼠胚胎期 E7(lane 1)、E11(lane 2)、E15(lane 3)、E17(lane 4)表达。B、 Northern杂交显示Smad3基因表达在小鼠各成体组织器官。 1、睾丸；2、肾脏；3、骨骼肌；4、肝脏；5、肺；6、脾 脏；7、脑；8、心脏
基因打靶技术—源于1987年
基因打靶是一种改变细胞或者生物个体基因 结构的体内诱变方法，是在胚胎干细胞技术和同 源重组技术基础之上发展起来的。
Lasker Award 2001
Mario Capecchi
Martin Evans
Oliver Smithies
“…… Capecchi, Evans and Smithies have revolutionized the study of human health and diseases.”
studied to understand particular biological phenomena, with the expectation that discoveries made in the model organism will provide insight into the workings of other organisms.
基因打靶技术的基本流程
中靶ES细胞经显微 注射引入受体囊胚
体外对ES 细胞遗传 物质进行定向修饰
携带中靶ES的囊胚 经胚胎移植引入假 孕鼠子宫
种系嵌合体的鉴定 以及基因打靶小鼠 的表型分析
基因打靶的策略
基因敲除（ES细胞，体细胞） 精细突变的引入 染色体组大片段的删除 基因敲除的时空调控 大规模随机基因敲除-基因诱捕 大规模随机诱变研究-ENU诱导的点突变 在小鼠以外的模式生物中进行基因打靶
用核酸酶S1保护实验和引物延伸实验确定 基因转录起始位点 确定外显子和内含子结构图谱 生物信息学研究基因结构、功能和进化
用核酸酶S1保护实验和引物延伸实验 确定基因转录起始位点
5‘ 3‘
-32P(•)
3‘ 5‘
3‘ 5‘
3‘ 5‘ Ploynucleotide kinase
Hybridize with total RNA 5‘ AAAAA 3’
小鼠是研究哺乳动物的主要模式生物
具有较短世代周期的 哺乳动物。 组织细胞的结构和功 能与人类相似。
全基因组序列已被 测定。
小鼠基因组规模（2.5 Gb）及基因排列次序 与人类（2.9 Gb）相似。
利用转基因技术和 基因打靶技术可对 小鼠遗传物质进行 活体修饰。
拥有众多近交系。 繁育能力强。
Producing Transgenic Mice by Micro PBS
基因组学的研究方法和技术
基因组学的研究方法和技术随着科技的进步和人类对基因的深入研究，基因组学成为一个重要的领域。
基因组学是研究基因组结构、组成、功能和变异等方面的科学。
由于基因组学研究领域的广阔和复杂性，需要大量高效的技术和方法来支持研究。
本文将简单介绍一些基因组学研究中广泛使用的技术和方法。
1.高通量测序（high-throughput sequencing）高通量测序是基因组学研究中最为基础的技术,也是最为重要的技术之一。
它是指用高效的DNA测序技术，对大量的DNA样本进行快速高效的测序。
应用高通量测序技术可以对整个基因组进行测序，后续对基因的研究将变得更加深入细致。
高通量测序的优点在于可以同时测定蛋白质、转录组、表观基因组和基因组等多个生物数据，这为生物学家的研究提供了很大的便利。
2.功能组学（functional genomics）功能组学研究的是基因组中的基因如何进行编码，以及这些编码后的基因如何协同作用，及在生物过程中发挥的作用，等等。
功能组学的研究方法多样，往往使用高通量技术，如RNA测序技术，用于在大规模样本中确定基因表达的情况，以及功能组学中独特的技术方法，如基因敲除和基因驱动技术等。
3.转录组学（transcriptomics）转录组学研究的是基因转录的过程和基因的表达情况。
对于不同物种和不同生态环境，单细胞的转录组可以呈现出多样性。
目前主要使用RNA测序方法来研究转录组，这种技术不仅可以确定细胞中各个基因的表达情况，还可以测定转录起始位点和RNA剪接形式。
4.表观基因组学（epigenomics）表观基因组学是指研究基因表达的调控机制与遗传信息相关性的学科。
表观遗传学研究的是孟德尔遗传学无法解释的表观性状的遗传学机制。
表观遗传机制主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等。
表观基因组学研究的方法主要包括基因组范围的酵素切割技术，用来检测甲基化水平，和染色质免疫沉淀（ChIP）方法，用来检测组蛋白修饰水平。
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术
编辑ppt
TAL 靶点识别模块
X2
FokI
32
TALEN介导的同源重组
HR
基因敲入
Donor plasmid
片段删除 Left arm Right arm
Donor plasmid
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
同源重组发生率编辑升pp高t 几个数量级
33
TALEN的最前沿
27
TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases，类转录因子效应物核酸酶)的靶向基因敲除技术是一 种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大 鼠等各类研究对象。
技术原理：
表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别 靶点核酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基 因敲除的过程。
编辑ppt
16
（三）诱导型基因敲除
• 诱导型基因敲除法也是利用Cre/Loxp系统 为基础，利用控制Cre表达的启动子的活性 或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点， 通过对诱导剂给予时间的控制从而在动物 的一定发育阶段和组织细胞中实现对特定 基因的敲除。
编辑ppt
17
• 由Cre/Loxp系统和诱导系统两个部分组成。Loxp 转基因动物是用常规基因打靶技术构建成的，基因 组中待修饰区域两端各携带1个Loxp位点的转基因 动物。诱导系统是指所携带的Cre基因的表达或所 表达的Cre的酶活性具有可诱导性的转基因动物。 人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计来对动 物基因敲除的时空特异性进行人为控制，以避免出 现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。
功能基因组学及其研究方法
第22页，幻灯Βιβλιοθήκη 共51页（三）实验性研究基因功能
基因克隆 基因敲除（knock-out） 转座子插入突变 基因的超表达 反义RNA技术 RNAi
第23页，幻灯片共51时代
第15页，幻灯片共51页
（一）鉴定DNA序列中的基因 计算机对基因组序列(DNA序列)进行分析，
包括鉴定和描述推测的基因、非基因序列及 其功能。
第16页，幻灯片共51页
根据序列分析搜寻基因
☺ 查找开放阅读框（open reading frame, ORF）
☺ 开放阅读框都有一个起始密码子，ATG，还 要有终止密码子。
研究内容两大类：DNA 数据分析； 蛋白质数据分析。
第20页，幻灯片共51页
DNA序列分析
基因结构域分析，包括启动子、转录因子 结合序列、内含子、外显子、重复序列、 开放读码框架等。
同源分析和检索，包括DNA数据库、EST 数据库、STS数据库、Unigene数据库、 Swissprot数据库等。
A dot indicates the promoter for each gene or operon. Arrows and color indicate the direction of transcribtion: dark blue genes are transcribed left to right, light blue are transcribed right to left.Overlapping gene are shown in green.
• 结构基因组学(structural genomics)是通过人类基因组计 划(Human Genome Project, HGP) 的实施来完成的。
基因功能的研究方法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
➢ 至于高等生物，因其某些表型具有难以捉摸的综 种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族的不同成员，其共同的祖先基因可能
存在于物种形成之后，也可能出现于物种形成之前。 将Ac因子转座酶的编码基因与组成型启动子如35S构建成嵌合基因表达载体，由于除去了转座因子两侧的反向重复顺序，转座酶的编
植物体细胞全能性； 已经建立了一套成熟的转基因系统，使外
源基因在转基因植株中成功表达。
➢植物中有许多转座子系统，它们的转座机
制已经清楚，通过转座子的随机插入可获 得大量的突变型，根据插入的转座子序列 合成探针，可分离被破坏的位点，并分析 它们的组成。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-
的贡献，也可列出很长的一串名单。 Bait protein。
基因组学研究进展
基因组学研究进展基因组学是研究生命体遗传信息组成和功能的学科，近年来取得了许多重要的进展。
本文将介绍一些基因组学研究的最新进展，包括技术发展、疾病研究和生物进化等方面。
一、技术发展1. 单细胞测序技术单细胞测序技术是一种能够从单个细胞中测定基因组信息的技术。
通过这种技术，研究人员可以深入了解细胞的多样性和异质性，揭示不同细胞类型之间的关系。
同时，单细胞测序技术也为研究疾病的起源和发展提供了新的思路。
2. 大规模测序技术随着高通量测序技术的发展，基因组测序的速度和精度也大幅提高。
现在，我们可以以前所未有的速度和准确性完成全基因组测序，这使得研究人员可以更好地理解复杂疾病的发生机制，并为个性化治疗奠定基础。
二、疾病研究1. 癌症基因组学癌症的发生和发展与基因变异密切相关。
通过对癌症患者基因组的测序和分析，研究人员已经鉴定出了数千个与癌症相关的基因变异。
这些研究成果为癌症的早期诊断和治疗提供了重要的依据，有助于提高患者的生存率和生活质量。
2. 遗传病的基因组学研究基因组学也在遗传病的研究中发挥了重要作用。
通过对患者和家族成员基因组的分析，研究人员可以确定遗传病的致病基因，并揭示疾病的发病机制。
这些研究为遗传病的早期预测、诊断和治疗提供了新的思路和方法。
三、生物进化1. 人类基因组计划人类基因组计划是一个旨在解析人类基因组的国际合作项目。
该计划的完成使得我们对人类基因组的了解大大增加，揭示了人类与其他物种的进化关系，为人类起源、发展和遗传疾病提供了重要的线索。
2. 动植物基因组研究除了人类基因组，研究人员还对其他物种的基因组进行了广泛的研究。
通过比较不同物种的基因组，我们可以深入了解物种的进化历程、适应性演化和群体遗传结构。
这些研究为保护濒危物种、改良农作物和理解生物多样性提供了重要的依据。
总结起来，基因组学的研究进展为我们深入了解生命的起源、发展和疾病的发生机制提供了重要的工具和方法。
随着技术的不断发展和研究的深入，相信基因组学将会在未来取得更多令人瞩目的成就。
生命科学中的基因功能研究
生命科学中的基因功能研究基因功能研究是生命科学中的一个重要领域，旨在了解和解析基因的功能和作用机制。
通过对基因功能的探索，可以更深入地了解细胞内的生物学过程，以及基因与疾病之间的关联，为生物学和医学的发展提供理论和实践基础。
基因是生物体内传递遗传信息的基本单位，是决定个体性状的重要因素。
通过研究基因功能，可以揭示基因在个体发育、生长、代谢以及对环境变化的适应等方面的作用机制。
基因功能的研究方法主要包括遗传学方法、分子生物学方法、生物化学方法和细胞生物学方法等。
遗传学方法是探索基因功能的重要手段之一、遗传学研究中，通过比较野生型与突变型生物体的差异，可以进一步了解基因在个体发育和其他生物学过程中的功能。
例如，透过分析两个种群的遗传相关性，可以发现相关的突变基因，并进一步研究这些基因的功能。
分子生物学方法是研究基因功能的常用手段之一、分子生物学方法可以研究基因在细胞内的表达调控、蛋白质合成过程以及基因在细胞内的相互作用等。
通过克隆和表达基因，可以进一步验证和研究基因的功能。
例如，通过基因敲除技术，可以研究基因在细胞发育和生物学过程中的功能。
生物化学方法也是研究基因功能的重要手段之一、生物化学方法主要通过分析和研究基因编码的蛋白质及其功能，来了解基因在细胞内的作用机制。
例如，通过研究酶的功能和调控机制，可以揭示基因在代谢过程中的作用机制。
细胞生物学方法是研究基因功能的重要手段之一、细胞生物学方法主要通过观察和研究基因在细胞内的表达和调控，来了解基因的功能和作用机制。
例如，通过显微镜观察基因在细胞内的定位和相互作用，可以揭示基因在细胞发育和生物学过程中的作用机制。
基因功能研究的重要意义在于解析基因与生物学过程和疾病之间的关联。
基因在细胞生物学过程中的功能异常可能导致疾病的发生和发展。
通过研究基因功能的异常和调控机制，可以发现和诊断遗传疾病，并为疾病防治提供新思路和新方法。
此外，基因功能研究还可以为开发新药物和治疗方法提供理论和实践基础，对药物研发和治疗效果进行评估和改进。
功能基因组学主要研究技术
3、寻找新的基因
示例：肿瘤相关新基因的发现
4、大规模DNA测序
基因芯片利用固定探针与样品进行分子 杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品 的序列，这种测定方法快速而具有十分 诱人的前景。
Mark chee等用含135000个寡核苷酸探针 的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体 基因组序列，准确率达99%。
四、基因芯片制作与应用
美 国
AFFYMETRIX
公
司
的
一
些
产 品
1989年的第一张芯片， 2002年的全人类基因组芯片， 构建在显微镜镜片上 包含33000多个基因位点
一）基因芯片发展历史
Southern & Northern Blot Dot Blot
Macroarray
Microarray
点阵固定 光刻合成 微量点样 喷墨
功能基因组学（functional genomics）是 利用结构基因组学提供的信息，以高通量，大 规模实验方法及统计与计算机分析为特征，全 面系统地分析全部基因的功能。
功能基因组学的研究涉及众多的新技术， 包括生物信息学技术、生物芯片技术、转基因 和基因敲除技术、酵母双杂交技术、蛋白质组 学技术、反义核酸技术等技术。
linkage, and genetic variability.
2、基因表达分析
用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地 检测出成千上万个基因的表达情况。
rnai技术及其应用
rnai技术及其应用一、RNai技术简介RNA干扰（RNAi）是一种广泛存在于真核生物中的基因沉默机制。
通过特定的siRNA或miRNA靶向mRNA，使其降解或翻译受到抑制，从而达到基因沉默的效果。
这项技术具有高效、特异性强、操作简单等优点，近年来被广泛应用于生物学研究和临床治疗领域。
二、RNai技术在基础生物学研究中的应用1. 基因功能研究：通过靶向特定基因进行干扰，观察其对细胞或个体的影响，推断该基因在生物体内所扮演的角色。
2. 基因调控网络分析：利用RNAi技术对关键基因进行干扰，进而分析其对整个调控网络的影响，揭示调控网络中各个组成部分之间相互作用的规律。
3. 药物筛选：利用RNAi技术对大量候选药物进行筛选，鉴定出具有治疗潜力的药物，并为新药开发提供理论依据。
三、RNai技术在临床治疗中的应用1. 肿瘤治疗：RNAi技术可以靶向肿瘤细胞中的癌基因进行干扰，抑制其生长和扩散，从而达到治疗肿瘤的目的。
2. 病毒感染治疗：利用RNAi技术靶向病毒基因进行干扰，阻断其复制和传播，从而达到治疗感染性疾病的目的。
3. 遗传性疾病治疗：RNAi技术可以靶向患者体内异常表达或突变的基因进行干扰，纠正其表达水平或功能异常，从而达到治疗遗传性疾病的目的。
四、RNai技术在农业领域中的应用1. 作物抗逆性改良：利用RNAi技术对作物中与逆境响应相关的基因进行干扰，提高其抵抗逆境能力。
2. 生物防治：利用RNAi技术靶向害虫或致病微生物中关键基因进行干扰，实现对害虫或致病微生物的有效控制。
3. 品质改良：利用RNAi技术靶向作物中与品质相关的基因进行干扰，提高其营养价值和经济价值。
五、RNai技术的发展趋势1. 基于CRISPR-Cas9技术的RNAi：将RNAi技术与CRISPR-Cas9技术相结合，可以实现更精准、更高效的基因编辑和调控。
2. 微型RNA（miRNA）在RNAi中的应用：miRNA是一种短链非编码RNA，具有广泛的生物学功能。
研究植物基因功能的策略和方法_3110
研究植物基因功能的策略和方法研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）策略。
正向遗传学即通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关表型或性状改变，然后通过图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能，例如遗传病基因的克隆。
反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找与之有关的表型变化，例如基因剔除技术或转基因研究。
简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。
研究植物体内基因功能的方法主要有以下几种：（1）基因功能丧失或减少，即筛选目的基因功能部分丧失或全部丧失的突变体，比较其与野生型的表型差异来确定该基因功能；（2）基因功能增加或获得，即筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与相应对照植株（野生型植株，功能丧失突变体或模式植物植株）差异，观察其表型性状变化来鉴定基因功能；（3）基因异位表达（Ectopic expression），通过定向调控靶基因的时空表达模式来研究基因功能；（4）微阵列（Microarray）是一种在全基因组水平对基因表达进行高通量检测的技术；（5）酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）用于分析基因产物即蛋白质之间的互作。
1 基因功能丧失或减少以前，通常通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的突变体，但概率较低；现在一般通过各种人工方法来获得合适突变体。
人工产生基因功能丧失的方法有插入突变、反义抑制（antisense suppression）、共抑制（cosuppression）、双链RNA干扰（double-stranded RNA interference, dsRNAi）。
博士专题：基因功能研究技术之基因敲除与基因编辑技术
（一）完全基因敲除
• 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同 源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因 等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失 去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：
有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得 无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基 因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致 突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型 是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。
Cre/loxP系统作用原理示意图
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的 DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP 系统在真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一 个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需 要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的 另一个成分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点 非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了 目的片段的缺失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作 用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp 重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP 和FRT位点的序列如图所示
（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。