鸡卵粘蛋白的提取及猪胰蛋白酶的分离纯化

鸡卵粘蛋白的提取及猪胰蛋白酶的分离纯化

摘要：鸡卵类粘蛋白是由鸡卵清中制得的一种糖蛋白，具有强烈的抑制胰蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究和胰蛋白酶的亲和层析纯化制备。胰蛋白酶Trypsin (Parenzyme) 为蛋白酶的一种，EC3.4.21.4。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。本实验以鸡蛋清为原料，提取猪胰蛋白酶的天然抑制剂鸡卵粘蛋白，并以此为配基，偶联到琼脂糖凝胶上，制成鸡卵粘蛋白的亲和吸附剂，然后通过亲和层析直接从猪胰脏的粗提液中纯化猪胰蛋白酶。并设计了酶活性测定以对纯化过程进行监测和对纯化效果进行评价；设计了电泳实验对制备的猪胰蛋白酶进行纯度和分子量的测定。

关键词：鸡卵粘蛋白；胰蛋白酶；亲和层析；分离纯化；酶活性。

鸡卵粘蛋白（chicken ovomucoid简称CHOM）是鸡蛋清中的一种糖蛋白，至今还未能获得单一组分，在电泳行为上常呈现不均一性。不同来源的卵类蛋白末端基有很大差别，鸡卵类蛋白N-末端基为丙氨酸。卵类粘蛋白在中性活酸性溶液中对热和高浓度的脲是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定，尤其温度较高是易迅速失活，在50%丙酮或10%三氯乙酸溶液中仍有较好的溶解度。它们的等电点有一定的范围，大致在3.9—4.5之间。鸡卵粘蛋白除对牛和猪的胰蛋白酶有强烈的抑制作用外，对枯草杆菌蛋白酶也有一定的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，对人的胰蛋白酶也无明显抑制作用，因此常用于胰蛋白酶酶学性质的研究。在pH7.8～8.0碱性条件下，CHOM可可逆性的结合胰蛋白酶，以CHOM为配基制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术对胰蛋白酶进行分离纯化。

1材料与方法

1.1材料与试剂

市售鲜鸡蛋，10%TCA，1mol/L NaOH ，5mol/L NaOH ，1mol/L HCl，5mol/L HCl，丙酮（A.R），葡聚糖凝胶G-25（ SephadexG-25)，0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液，DEAE-52离子交换纤维素，离子交换剂（0.5mol/L HCl ，0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl ），洗脱液（0.3mol/L NaCl—0.02mol/L, pH6.5磷酸缓冲液）,透析袋（φ2.7cm）,标准胰蛋白酶溶液（1mg/ml），0.05mol/L PH7. 8 Tris- HCl缓冲液，BAEE底物缓冲溶液（0.05mol/L CaCl2- 0.05mol/L PH8.0 Tris- HCl缓冲液），1mmol/L BAEE底物溶液，Sepharose 4B，0.5mol/L NaCl，2mol/L NaOH，0.2mol/L PH9.5碳酸钠缓冲液，56%1，4-二氧六环（V/V），环氧氯丙烷（A.R），亲和柱平衡液（0.5mol/L KCl，0.05mol/L CaCl2—0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液），亲和柱洗脱液（0.5mol/L KCl—0.1mol/L PH2.5甲酸溶液），

，无水氯化钙，亲和柱平衡液新鲜猪胰脏，PH2.5-3.0乙酸酸化水，2.5mol/L H2S0

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（ 0.5mol/L KCl，0.05mol/L CaCl2—0.1mol/L, Tris—HCl PH7.8缓冲液），亲和柱洗脱液：（0.5mol/L KCl— 0.1mol/L PH2.5甲酸溶液）等。

1.2主要仪器与设备

DELTA320型酸度计，离心机，磁力加热搅拌器，恒流泵，紫外检测仪，N2000生化工作站软件，Ø16×400mm 层析柱，电脑，布氏漏斗、抽滤瓶，循环水真空泵，Ø10×200mm 层析柱，紫外可见扫描分光光度计，微量可调取液器，石英比色皿（d=1cm），恒温摇床，紫外分光光度计，循环水真空泵，DS型高速组织捣碎机，电子天平，精密试纸

（PH0.5~5，PH5.5~9）及相关玻璃仪器。

1.3试验方法

1.3.1工艺流程

鸡卵粘蛋白的配基制备：CHOM粗品的制备（酸提取、丙酮沉淀）（凝胶过滤层析脱盐）→CHOM的纯化（离子交换层析）→CHOM纯品的制备（丙酮沉淀）（抑制活性测定）→卵粘蛋白配基；

亲和吸附剂的合成：载体活化→偶联(载体+配基)→亲和吸附剂；

猪胰蛋白酶的亲和层析制备：胰蛋白酶原的提取（活性测定）→酶原的激活（活性测定）→亲和层析（活性测定）→纯品冷冻干燥

1.3.2鸡卵粘蛋白的配基制备

粗品的制备：取新鲜蛋清，搅拌，加入等体积10% pH1.15的TCA溶液，继续搅拌直至絮状消失，调pH到pH3.5±0.2的范围以内。pH值调好后，将烧杯用保鲜膜密封好, 室温下静置4小时。 4000r/min 离心15min，弃沉淀，上清液用滤纸过滤，收集滤液。调pH到pH3.5±0.2的范围以内，边轻轻搅动边加入加3倍体积的预冷丙酮，用塑料薄膜封好杯口，在4℃下放置4h以上。3000r/min离心15min，弃去上清液，离心杯底部沉淀物放入真空干燥器内抽气，除去残留丙酮，然后用20ml蒸馏水溶解，经Sephadex G-25凝胶层析柱脱盐，收集第Ⅰ洗脱峰，得到鸡卵粘蛋白脱盐的粗提取液。4℃下保存好样品，准备进行离子交换层析纯化。

纯化：（1）离子交换层析：将10gDEAE-纤维素粉（DE-52）用过量的水溶胀，倾去悬浮颗粒，抽滤。抽干后用0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液室温下浸泡20min。抽滤，蒸馏水洗至中性。抽干后用100ml 0.5mol/L HCl浸泡20min。抽滤，蒸馏水洗至中性，转移到烧杯中，用100ml 0.02mol/L,pH6.5磷酸缓冲液浸泡，脱气后装住。装柱后用0.02mol/L，PH6.5磷酸缓冲液平衡。上样，继续以平衡液流经柱子，当杂蛋白峰完全下降，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线后，改用含0.3mol/L NaCl的0.02mol/L，PH6.5磷酸洗脱液洗脱。收集第Ⅲ洗脱峰。保存样品，准备脱盐和丙酮沉淀纯化。（2）透析：经DEAE-纤维素离子交换柱层析分离的CHOM溶液装入透析袋内，对蒸馏水透析至用1% AgNO3 检查袋外液无白色浑浊为止。（3）丙酮沉淀：将透析液转移到300ml烧杯内，取出1ml透析液测定鸡卵粘蛋白含量及其抑制活性，其余的透析液用1mol/L HCl调到PH4.0，然后加入3倍体积的预冷丙酮沉淀（此时出现大量的白色沉淀），盖上塑料膜，在4℃下放置4小时以上。待鸡卵粘蛋白析出后，倾出部分上清液，3000r/min离心15min。去上清，沉淀物真空干燥，干燥后的鸡卵粘蛋白为透明胶状物。

活性测定：

（1）鸡卵粘蛋白的抑制活性测定