荧光寿命测定方法
荧光寿命的定义
荧光寿命的定义简介荧光寿命是描述荧光物质发光时间的一个重要参数。
随着光学技术的快速发展，对荧光寿命的研究也越来越深入。
荧光寿命在许多领域中都有广泛的应用，如生物物理学、材料科学、化学等。
本文将对荧光寿命的定义进行详细探讨，包括荧光寿命的概念、测量方法和影响因素等。
荧光寿命的概念荧光寿命是指荧光物质由受激态回到基态所需的时间。
当荧光物质受到外界激发能量时，部分电子会从基态跃迁到激发态，形成受激态。
随后，受激态上的电子会自发地跃迁回到基态，释放出能量并产生荧光。
荧光寿命是受激态电子从激发态回到基态所需的平均时间。
荧光寿命的长短与荧光物质的性质密切相关，它可以通过荧光寿命测量仪器来获得。
荧光寿命的测量方法有许多方法可以用来测量荧光寿命，其中最常用的方法是荧光寿命衰减法。
该方法通过测量荧光强度随时间的衰减曲线来得到荧光寿命。
具体操作步骤如下： 1. 准备样品：选择合适的荧光物质作为样品，并将其制备成适当的形式，如溶液、薄膜等。
2. 激发样品：使用合适的激发源，如激光器或荧光灯，对样品进行激发。
激发波长通常与样品的吸收峰相匹配。
3. 收集荧光信号：使用荧光探测器收集样品发出的荧光信号，并将其转化为电信号。
4. 记录荧光信号随时间的变化：使用荧光寿命测量仪器记录荧光信号随时间的变化，并得到荧光强度随时间的衰减曲线。
5. 拟合曲线：利用合适的数学模型，如指数衰减模型，对荧光衰减曲线进行拟合，从而得到荧光寿命。
影响荧光寿命的因素荧光寿命受到多种因素的影响，其中包括以下几个方面： 1. 荧光物质的性质：荧光物质的分子结构和化学组成对荧光寿命有重要影响。
不同的分子结构会导致不同的荧光激发和退激发机制，从而影响荧光寿命的长短。
2. 温度：温度是影响荧光寿命的重要因素。
一般情况下，荧光寿命会随着温度的升高而缩短。
这是因为温度的升高会增加分子的振动和动力学速率，从而加快荧光退激发的速率。
3. 溶剂效应：溶剂对荧光寿命也有较大影响。
荧光寿命_论文-自然科学论文
荧光寿命荧光寿命（ FLT）检测摘要这个技术手册介绍了荧光寿命（ FLT）这种新技术的基本原理。
从这本技术手册里，我们可以简单的了解与这项技术相关的理论基础和与之配合的实验条件，以及通过一项应用实例讨论了如何对实验中所获得的数据进行解析和归类的方法。
•微孔板技术在高通量筛选中的价值使用者利用一个 marker或者是标记物受光激发后，通过一台普通的微孔板阅读器，就可以监测生化和生物反应进程。
常用的读取模式包括检测吸收光，荧光强度(FI)，荧光偏振（FP），时间分辨荧光（TRF）。
一般没有方法能够包含所有可能的分析模式，如果达到这样的高分析程度，需要一个配套的方法能够覆盖尽可能宽的实验范围。
尽管如此，，还是会有一种方法被优选选择，通过它能够得到更可靠的数据，更高端的信息，以及迅速的读取数据。
荧光寿命被定义成荧光分析在回到基态之前驻留在激发态的时间。
荧光寿命对荧光标记物周围的微环境高度敏感。
当标记一个反应对，由于化学反应改变这个反应对的状态（例如在酶反应体系中）或者是发生了与其他结合伴侣的结合（例如受体 -配体的结合），将影响到上面所提到的微环境。
无论如何，检测荧光寿命将直接指示反应环境。
这类信号要远远强于通常会影响其它探测方法的干扰信号，因此它将为市场需求加入巨大的推动力。
Tecan Ultran Evolution detection platform已经融入了对荧光寿命的检测。
除了已经发展的各种检测方法以外，这项新技术使得Ultran Evolution技术平台具有更强的市场应用前景。
2.荧光寿命测定的原理用 Ultra Evolution测定荧光寿命采用的一种方法，称作时间关联的单光子计数（TCSPC）。
实验的基本流程显示在图1。
一个脉冲激光器重复激发样品。
调节激发脉冲的强度，使得对于任何一个脉冲，在探测器上只有一个光子被计数。
按照测量的激光脉冲和探测器感应之间的这段时间，将计数值引入已用荧光计数和时间绘制的柱状图。
荧光寿命测定
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化学通报 2001 年 第 10 期 http :ΠΠwww. chemistrymag. org
的分子体积 ( V0 ) ,根据 Perrin 方程来计算荧光寿命[4] ,虽然这种方法所用仪器比较简单 ,但测定过
数有限 ,因此测量精度较差 。1980 年后多频相技术得到发展 ,相调制技术测定荧光寿命的精度也随之
提高 ,从而使复杂体系荧光寿命测定成为可能。但同时仪器也变得昂贵 ,实验测定难度也相应增大。
113 频闪技术[9]
频闪技术也叫脉冲取样 技 术 ( Pulse Sam2
pling Techniques) ,仪器工作原理示于图 3 ( a) 。
首先商品化 。此外 ,Edinburgh Instruments、IBH、HORIBA 等公司也在生产基于 TCSPC 的时间分辨荧
光光谱仪 。
TCSPC 的工作原理如图 1 所示 ,光源发出的脉冲光引起起始光电倍增管产生电信号 ,该信号通
过恒分信号甄别器 1 启动时辐转换器工作 ,时幅转换器产生一个随时间线性增长的电压信号 。另
除了直接应用之外 ,荧光寿命测定还是其它时间分辨荧光技术的基础 。例如基于荧光寿命测 定的荧光猝灭技术可以研究猝灭剂与荧光标记物或探针相互靠近的难易 ,从而对所研究体系中探 针或标记物所处微环境的性质作出判断 。基于荧光寿命测定的时间分辨荧光光谱可以用来研究激 发态发生的分子内或分子间作用以及作用发生的快慢 。另外 ,非辐射能量转移 、时间分辨荧光各向 异性等主要荧光技术都离不开荧光寿命测定 。因此本文拟对荧光寿命测定的主要方法 、各种方法 的原理 、特点以及荧光寿命测定的主要应用进行介绍 。
荧光寿命测定的现代方法与应用
荧光寿命测定的现代方法与应用房 喻 王 辉(陕西师范大学化学系 西安 710062)摘 要 介绍了时间相关单光子计数、相调制和频闪等三种现代荧光寿命测定方法的工作原理,指出了各种方法的优点和局限性;介绍了时间相关单光子计数实验数据的处理方法;概述了时间分辨荧光技术在化学和生命科学中的应用。
关键词 荧光寿命 单光子计数 相调制法 频闪技术Abstract The principles and characteristics of s ome of the m odern techniques,including time2correlated single2 photon counting(T CSPC),phase m odulation and strobe techniques,for fluorescence lifetime measurements have been briefly introduced.The advantages and disadvantages of each method have als o been pointed out.The comm on method used for the analysis of the fluorescence decay,taking T CSPC as an example,has been discussed in detail.On the basis of these introductions,the applications of time2res olved fluorescence techniques in chemical and biological re2 search have been overviewed.K ey w ords Fluorescence lifetime,T ime2correlated single photon counting,Phase m odulation methods,S trobe techniques荧光是分子吸收能量后其基态电子被激发到单线激发态后由第一单线激发态回到基态时所发生的,而荧光寿命是指分子在单线激发态所平均停留的时间。
荧光寿命的认识
寿命 是衰减常数k 的倒数。事实上，在 瞬间激发后的某个时 间，荧光强度达到最 大值，然后荧光强度 将按指数规律下降。 从最大荧光强度值后 任一强度值下降到其 1/e所需的时间都应 等于 。
分析采用非线性最小二乘曲线拟合方法, 迭代过程用Marquardt法。拟合初值可由 用户输入,也可对曲线粗略分析得到。如 对两种衰变成分的衰变曲线,先由曲线尾 部段进行单指数曲线拟合得到长寿命成分 参数,再由曲线前段进行双指数曲线拟合 得到(其中长寿命成分参数已得到)短寿命 成分参数。
二．研究荧光寿命的意义
从下式可以得到 F的粗略估计值(单位为秒)。
1/F≈104 max
在讨论寿命时，必须注意不要把寿命与跃迁时 间混淆起来。跃迁时间是跃迁频率的倒数，而 寿命是指分子在某种特定状态下存在的时间。
通过量测寿命，可以得到有关分子结构和动力 学方面的信息。
荧光寿命及其含义
假定一个无限窄的脉冲光(δ函数)激发n0个荧 光分子到其激发态,处于激发态的分子将通 过辐射或非辐射跃迁返回基态。假定两种衰 减跃迁速率分别为Γ和knr,则激发态衰减 速率可表示为dn(t)/dt=- (Γ+ knr) n(t) (1)
Zn3(PO4)2 存在α,β,和γ三种晶体结构对于这三 种磷光体,在α-ZPMG中没有红色长余辉现象,因为在 结构中不存在六配位Mn2+。相反,在β和γ-ZPMG中, 可以很清楚地观察到红色长余辉现象。采用254nm紫 外光激发5min后,立即测得磷光粉的余辉光谱如图6 所示。由图我们可以看出,β和γ-ZPMG中监测到宽 带峰与发射光谱中的峰位相同,均位于616nm,归属为 Mn2+的4T1g(4G) →6A1g(6S)跃迁。
荧光平均寿命
荧光平均寿命荧光平均寿命是一个非常重要的参数，常常用于描述荧光材料的荧光特性，也被广泛用于生物医学、材料科学、化学、物理学等领域。
荧光平均寿命是荧光发射的持续时间，是指在激发光源的作用下，物质吸收能量后发出荧光的平均持续时间。
荧光平均寿命可以反映荧光材料内部荧光衰减的速度以及能量转移的过程。
荧光材料是一种特殊的分子或化合物，其分子结构中含有能够发生荧光的活性基团，当其受到激发能量时，能够发出特定波长的荧光信号。
荧光信号不仅具有高度的灵敏度和选择性，还具有高采样速度和非破坏性等特点，因此被广泛用于分析、传感、成像等领域。
荧光平均寿命是荧光材料的一个重要参数，它可以反映出荧光信号的时间演化规律和荧光衰减速度。
荧光信号的衰减速度与荧光平均寿命成反比关系，荧光平均寿命越长，信号衰减速度越慢，信号持续时间越长，具有更好的稳定性和可靠性。
荧光平均寿命的测定方法主要有时间分辨荧光光谱仪、荧光寿命成像系统和脉冲激光荧光寿命测量系统等。
其中，时间分辨荧光光谱仪是最常用的测量荧光平均寿命的方法，通过对样品的荧光发射信号进行光谱分析和时间延迟分析，可以得到荧光信号的荧光发射光谱和荧光平均寿命等信息。
在生物医学领域，荧光平均寿命被广泛用于分析细胞内蛋白质结构、药物分子与细胞内组分的相互作用、蛋白质分子的折叠状态等生物过程。
荧光平均寿命可以反映出样品内分子的结构和动力学特性，可以用于解析细胞内生物过程的复杂性，为药物研发和疾病诊断提供了新的手段。
在材料科学领域，荧光平均寿命被广泛应用于分析材料的化学组成、结构和性能等方面。
荧光平均寿命可以用于表征材料表面和界面的能量转移和荧光共振能量转移过程，为优化材料设计和制备提供了新的思路和方法。
总之，荧光平均寿命是荧光材料的一个重要参数，具有广泛的应用价值和研究意义。
在今后的生物医学、材料科学、化学、物理学等领域的研究中，荧光平均寿命将扮演着越来越重要的角色，为科技创新和人类福祉做出更大的贡献。
荧光寿命测定方法
三、时间相关的单光子计数方法TCSPC
降低激光功率，使每一个激光脉冲所含能量足够小，以至于每次激发样 品时或者仅有１个荧光光子到达探测器的光阴极，或者没有。假如100 个激光脉冲激发样品，所发出的荧光光子仅能使光阴极平均发射１个 光电 子。光子q重概率密度则变成单个光电子概率密度：
E4 E3 E2
(10-8s) (10-3s)
E4 E3 E2
h
E1
E1
一、荧光寿命的概念
自发辐射：处于高能级E2的原子自发地向低能级E1跃迁，并发射出一个频
率为 υ=（ E2- E1 ）/h的光子。
自发跃迁几率：发光材料在单位时间内，从高能级上产生自发辐射的发光
粒子数密度占高能级总粒子数密度的比值 A21=(dn21/dt)sp/n2
三、时间相关单光子计数方法TCSPC
时间相关单光子计数技术首先由 Bollinger、Bennett、Koechlin 三人在六十 年代为检测被射线激发的闪烁体发光而建立的,后来人们把它应用到荧光 寿命的测量。
四、TCSPC技术优缺点
• TCSPC 法的突出优点在于灵敏度高、测定结果准确、系统误差 小,是目前最流行的荧光寿命测定方法； • 实际测定中,必须调节样品的荧光强度,确保每次激发后最多只有 一个荧光光子到达终止光电倍增管。否则会引起“堆积效应” (Pileup Effect)； • 对于量子效率较高的样品，需要限制激发光强度，即减小多个光 电子同时到达的概率； • 这种方法所用仪器结构复杂、价格昂贵、而且测定速度慢,无法满 足某些特殊体系荧光寿命测定的要求。
Pf(t) ≈ <λ(t)> = αI（t）
只要测得单个光电子到达时间概率分布，也就得到了微弱光场衰变曲线。 利用窗口鉴别器开设时间窗口，可以很方便地测量激发后不同时间区 间的荧光光谱，就得到了时间分辨荧光光谱。利用非线性最小二乘法、 矩法、Laplace 变换法、最大熵法以及正弦变换法等拟合曲线得到结果。
荧光寿命和光催化
荧光寿命和光催化荧光寿命和光催化是化学领域中两个重要的概念。
荧光寿命是指荧光分子从激发态返回基态所需的时间，而光催化是指利用光能促使化学反应发生的过程。
本文将分别介绍荧光寿命和光催化的概念、原理、应用以及未来发展方向。
一、荧光寿命1.1概念荧光寿命是指荧光分子由激发态返回基态所需的平均时间。
在分子受到激发光的照射后，电子跃迁到高能级激发态，随后再以荧光辐射的形式返回基态。
荧光寿命可以作为荧光物质的特征性质，对于分子结构的研究和应用具有重要意义。
1.2原理荧光寿命的测定是通过观察荧光分子在激发态和基态之间跃迁的过程来实现的。
一般采用激光或者其他光源对样品进行激发，然后测量荧光发射的时间延迟，通过分析发射光的强度随时间的衰减曲线，可以得到荧光寿命的信息。
1.3应用荧光寿命具有广泛的应用价值，包括但不限于生物医学领域的分子探针、荧光成像技术、环境监测、材料科学等方面。
在生物医学领域，荧光寿命的测定可以用于分子标记和细胞成像，具有很好的生物相容性和生物标记度。
1.4发展方向随着技术的不断进步，荧光寿命的测定方法也在不断完善。
近年来，单分子荧光寿命成像技术逐渐成为研究热点，可以实现对单个分子的实时观测，为生物学研究提供了新的手段。
未来，荧光寿命的精确测定和应用将更加广泛和深入。
二、光催化2.1概念光催化是指利用光能来促进化学反应的过程。
通过选择合适的光催化剂和反应条件，可以实现一系列重要的化学转化，如光解水制氢、光催化氧化还原反应等。
2.2原理光催化的原理涉及到光生电子激发、电子转移和反应物质的吸附等多个方面。
一般来说，光催化反应需要两个步骤：光生电子-空穴对的产生和电子-空穴对的利用。
光生电子-空穴对可以通过光照射材料表面激发得到，之后通过电子转移反应参与到催化反应中。
2.3应用光催化在环境净化、化学合成、能源转化等领域具有广泛的应用前景。
例如，光催化技术可以用于大气污染物的降解、有机废水的处理、光催化水解制氢等方面。
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五、荧光寿命测定中可能存在的问题
• 当荧光寿命值与仪器自身响应时间为同一量级时，实测结果为二 者的卷积，需要对结果进行解卷积，扣除系统响应时间的影响。 • 发光材料自身存在荧光俘获效应，尽量减小样品厚度。
谢谢大家！
Pf(t) ≈ <λ(t)> = αI（t） 只要测得单个光电子到达时间概率分布，也就得到了微弱光场衰变曲线。 利用窗口鉴别器开设时间窗口，可以很方便地测量激发后不同时间区间 的荧光光谱，就得到了时间分辨荧光光谱。利用非线性最小二乘法、矩 法、Laplace 变换法、最大熵法以及正弦变换法等拟合曲线得到结果。
三、单光子计数方法
•
单光子计数技术，是检测极微弱光的有力手段，这一技术是通过 分辨单个光子在检测器（PMT）中激发出来的光电子脉冲，把光 信号从热噪声中以数字化的方式提取出来 • 光电倍增管(PMT)是一种高灵敏度电真空光敏器件，主要包括以下 几个部分： 光窗：光线或射线射入的窗口璃； 光阴极：这是接受光子产生光电子的电极； 倍增极：管内光电子产生倍增的电极，倍增极的数目有8～13个，一 般电子放大倍数达106-109； 阳极：经过多次倍增后的电子被阳极收集，形成输出信号。
三、时间相关单光子计数方法TCSPC
时间相关单光子计数技术首先由 Bollinger、Bennett、Koechlin 三人在六十 年代为检测被射线激发的闪烁体发光而建立的,后来人们把它应用到荧光 寿命的测量。
四、TCSPC技术优缺点
• TCSPC 法的突出优点在于灵敏度高、测定结果准确、系统误差 小,是目前最流行的荧光寿命测定方法； • 实际测定中,必须调节样品的荧光强度,确保每次激发后最多只有 一个荧光光子到达终止光电倍增管。否则会引起“堆积效应” (Pileup Effect)； • 对于量子效率较高的样品，需要限制激发光强度，即减小多个光 电子同时到达的概率； • 这种方法所用仪器结构复杂、价格昂贵、而且测定速度慢,无法满 足某些特殊体系荧光寿命测定的要求。
三、单光子计数方法
荧光的发射是一个统计过程，很少有荧光分子刚好在τ（荧光寿命）时刻 发射荧光，荧光寿命仅反映荧光强度衰减到其起始值1/e所需的时间。 在被测的微弱随机光场作用下，光检测计光阴极发射光电子，其行为可 用双随机泊松点过程来描述，光电子时间统计特性可用多重概率密度求 平均来得到
式中：tj＝to＋tj0 得到光检测方程
均寿命τ 。 τ =1/A21
一、荧光寿命的概念
假定一个无限窄的脉冲光(δ函数) 激发n0 个原子到其激发态,处于激发态的 原子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。假定两种衰减跃迁速率分别为Γ 和knr ,则激发态衰减速率可表示为 d n ( t)/d t= - (Γ + knr ) n ( t) 其中n ( t) 表示时间t 时激发态原子的数目,由此可得到激发态物质的单指数 衰减方程。 n ( t) = n0 exp ( - t/τ) 式中τ为荧光寿命。荧光强度正比于衰减的激发态分子数,因此可将上式改 写为: I ( t) = I0 exp ( - t/τ) 其中I0 是时间为零时的荧光强度。于是,荧光寿命定义为衰减总速率的倒数: τ = (Γ + knr ) - 1 也就是说荧光强度衰减到初始强度的1/e 时所需要的时间就是该荧光物质 在测定条件下的荧光寿命。
荧光寿命的测定方法
2013-9-26
一、荧光寿命的概念
二、测定荧光寿命的几种方法
三、时间相关单光子计数方法TCSPC
四、TCSPC技术优缺点
五、荧光寿命测定中可能存在的问题
一、荧光寿命的概念
激光(Laser)的全名是“光的受激辐射放大”。 (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation)
一、荧光寿命的概念
自发辐射跃迁的过程是一种ห้องสมุดไป่ตู้与原子本身的性质有关，与辐射场无关的自
发过程。A21的大小与原子处在E2能级上的平均寿命τ 2有关。 E2能级上的粒子数密度n2随时间的变化率
dn2(t)/dt=-(dn21/dt)sp=-A21n2(t)
n2(t)= n2(0)e -A21n2(t)
定义粒子数密度由t=0时的n(0)衰减到它的1/e时所用的时间为E2能级的平
E4 E3 E2
(10-8s) (10-3s)
E4 E3 E2
h
E1
E1
一、荧光寿命的概念
自发辐射：处于高能级E2的原子自发地向低能级E1跃迁，并发射出一个频
率为 υ=（ E2- E1 ）/h的光子。
自发跃迁几率：发光材料在单位时间内，从高能级上产生自发辐射的发光
粒子数密度占高能级总粒子数密度的比值 A21=(dn21/dt)sp/n2
λ（t）＝ αI（t） 式中：α 是比例系数。说明光电子发射概率密度与光场瞬时强度成正比。
三、时间相关的单光子计数方法TCSPC
降低激光功率，使每一个激光脉冲所含能量足够小，以至于每次激发样 品时或者仅有１个荧光光子到达探测器的光阴极，或者没有。假如100个 激光脉冲激发样品，所发出的荧光光子仅能使光阴极平均发射１个光电 子。光子q重概率密度则变成单个光电子概率密度：
二、测定荧光寿命的几种方法
荧光寿命测定的现代方法主要有以下几种： 时间相关单光子记数法(Time-Correlated Single-Photon Counting ，TCSPC) 频闪技术(Strobe Techniques) 相调制法(Phase Modulation Methods) 条纹相机法(Streak Cameras) 上转换法(Upcon-version Methods)