荧光寿命测定
荧光寿命测定的现代方法与应用
荧光寿命测定的现代方法与应用房 喻 王 辉(陕西师范大学化学系 西安 710062)摘 要 介绍了时间相关单光子计数、相调制和频闪等三种现代荧光寿命测定方法的工作原理,指出了各种方法的优点和局限性;介绍了时间相关单光子计数实验数据的处理方法;概述了时间分辨荧光技术在化学和生命科学中的应用。
关键词 荧光寿命 单光子计数 相调制法 频闪技术Abstract The principles and characteristics of s ome of the m odern techniques,including time2correlated single2 photon counting(T CSPC),phase m odulation and strobe techniques,for fluorescence lifetime measurements have been briefly introduced.The advantages and disadvantages of each method have als o been pointed out.The comm on method used for the analysis of the fluorescence decay,taking T CSPC as an example,has been discussed in detail.On the basis of these introductions,the applications of time2res olved fluorescence techniques in chemical and biological re2 search have been overviewed.K ey w ords Fluorescence lifetime,T ime2correlated single photon counting,Phase m odulation methods,S trobe techniques荧光是分子吸收能量后其基态电子被激发到单线激发态后由第一单线激发态回到基态时所发生的,而荧光寿命是指分子在单线激发态所平均停留的时间。
时间相关单光子计数法测量荧光寿命-2011
时间相关单光子计数法测量荧光寿命（一）实验目的与要求目的：1、了解时间相关单光子计数法测量荧光寿命的原理和方法2、学习时间相关单光子计数荧光光度计的使用方法要求：1、掌握时间相关单光子计数法测量荧光寿命的原理；2、理解荧光寿命测量在物质定性及定量分析中的应用；3、了解时间分辨荧光光光度计的基本组成，各部件的作用；4、学习利用Origin软件处理实验数据。
（二）实验原理1 时间相关单光子计数器工作原理TCSPC（Time-Correlated Single Photon Counting）是目前主要应用的荧光寿命测定技术。
1975 年由PTI(Photon Technology International) 公司首先商品化，此外，Edinburgh Instruments、IBH、HORIBA 等公司也在生产基于TCSPC 的时间分辨荧光光谱仪。
TCSPC 的工作原理如图1 所示，光源发出的脉冲光引起起始光电倍增管产生电信号，该信号通过恒分信号甄别器1 启动时辐转换器工作，时幅转换器产生一个随时间线性增长的电压信号。
另外，光源发出的脉冲光通过激发单色器到达样品池，样品产生的荧光信号再经过发射单色器到达终止光电倍增管，由此产生的电信号经由恒分信号甄别器2 到达时幅转换器并使其停止工作。
这时时幅转换器根据累积电压输出一个数字信号并在多道分析仪(Multichannel Analyzer) 的相应时间通道计入一个信号，表明检测到寿命为该时间的一个光子。
几十万次重复以后，不同的时间通道累积下来的光子数目不同。
以光子数对时间作图可得到如图2 所示直方图,此图经过平滑处理得到荧光衰减曲线。
图1 TCSPC 的工作原理简图图2 时间相关单光子计数2 荧光寿命及其含义假定一个无限窄的脉冲光(δ函数) 激发n 0个荧光分子到其激发态，处于激发态的分子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。
假定两种衰减跃迁速率分别为Γ和k nr ，则激发态衰减速率可表示为)()()(t n k dtt dn nr +Γ-= 其中n (t ) 表示时间t 时激发态分子的数目，由此可得到激发态物种的单指数衰减方程。
荧光寿命测定方法
三、时间相关的单光子计数方法TCSPC
降低激光功率，使每一个激光脉冲所含能量足够小，以至于每次激发样 品时或者仅有１个荧光光子到达探测器的光阴极，或者没有。假如100 个激光脉冲激发样品，所发出的荧光光子仅能使光阴极平均发射１个 光电 子。光子q重概率密度则变成单个光电子概率密度：
E4 E3 E2
(10-8s) (10-3s)
E4 E3 E2
h
E1
E1
一、荧光寿命的概念
自发辐射：处于高能级E2的原子自发地向低能级E1跃迁，并发射出一个频
率为 υ=（ E2- E1 ）/h的光子。
自发跃迁几率：发光材料在单位时间内，从高能级上产生自发辐射的发光
粒子数密度占高能级总粒子数密度的比值 A21=(dn21/dt)sp/n2
三、时间相关单光子计数方法TCSPC
时间相关单光子计数技术首先由 Bollinger、Bennett、Koechlin 三人在六十 年代为检测被射线激发的闪烁体发光而建立的,后来人们把它应用到荧光 寿命的测量。
四、TCSPC技术优缺点
• TCSPC 法的突出优点在于灵敏度高、测定结果准确、系统误差 小,是目前最流行的荧光寿命测定方法； • 实际测定中,必须调节样品的荧光强度,确保每次激发后最多只有 一个荧光光子到达终止光电倍增管。否则会引起“堆积效应” (Pileup Effect)； • 对于量子效率较高的样品，需要限制激发光强度，即减小多个光 电子同时到达的概率； • 这种方法所用仪器结构复杂、价格昂贵、而且测定速度慢,无法满 足某些特殊体系荧光寿命测定的要求。
Pf(t) ≈ <λ(t)> = αI（t）
只要测得单个光电子到达时间概率分布，也就得到了微弱光场衰变曲线。 利用窗口鉴别器开设时间窗口，可以很方便地测量激发后不同时间区 间的荧光光谱，就得到了时间分辨荧光光谱。利用非线性最小二乘法、 矩法、Laplace 变换法、最大熵法以及正弦变换法等拟合曲线得到结果。
荧光寿命和光催化
荧光寿命和光催化荧光寿命和光催化是化学领域中两个重要的概念。
荧光寿命是指荧光分子从激发态返回基态所需的时间，而光催化是指利用光能促使化学反应发生的过程。
本文将分别介绍荧光寿命和光催化的概念、原理、应用以及未来发展方向。
一、荧光寿命1.1概念荧光寿命是指荧光分子由激发态返回基态所需的平均时间。
在分子受到激发光的照射后，电子跃迁到高能级激发态，随后再以荧光辐射的形式返回基态。
荧光寿命可以作为荧光物质的特征性质，对于分子结构的研究和应用具有重要意义。
1.2原理荧光寿命的测定是通过观察荧光分子在激发态和基态之间跃迁的过程来实现的。
一般采用激光或者其他光源对样品进行激发，然后测量荧光发射的时间延迟，通过分析发射光的强度随时间的衰减曲线，可以得到荧光寿命的信息。
1.3应用荧光寿命具有广泛的应用价值，包括但不限于生物医学领域的分子探针、荧光成像技术、环境监测、材料科学等方面。
在生物医学领域，荧光寿命的测定可以用于分子标记和细胞成像，具有很好的生物相容性和生物标记度。
1.4发展方向随着技术的不断进步，荧光寿命的测定方法也在不断完善。
近年来，单分子荧光寿命成像技术逐渐成为研究热点，可以实现对单个分子的实时观测，为生物学研究提供了新的手段。
未来，荧光寿命的精确测定和应用将更加广泛和深入。
二、光催化2.1概念光催化是指利用光能来促进化学反应的过程。
通过选择合适的光催化剂和反应条件，可以实现一系列重要的化学转化，如光解水制氢、光催化氧化还原反应等。
2.2原理光催化的原理涉及到光生电子激发、电子转移和反应物质的吸附等多个方面。
一般来说，光催化反应需要两个步骤：光生电子-空穴对的产生和电子-空穴对的利用。
光生电子-空穴对可以通过光照射材料表面激发得到，之后通过电子转移反应参与到催化反应中。
2.3应用光催化在环境净化、化学合成、能源转化等领域具有广泛的应用前景。
例如，光催化技术可以用于大气污染物的降解、有机废水的处理、光催化水解制氢等方面。
flim 荧光寿命用途
flim 荧光寿命用途荧光寿命是指荧光物质在受到激发后，从激发态返回基态所需的时间。
荧光寿命是一种重要的物理特性，具有广泛的应用价值。
本文将介绍荧光寿命的定义、测量方法和在不同领域的应用。
一、荧光寿命的定义和测量方法荧光寿命是荧光物质从激发态退激回基态所需要的时间，它是荧光物质的一个固有性质。
荧光寿命的测量通常使用荧光寿命仪进行，该仪器可以通过测量荧光物质的光强随时间的变化来获得荧光寿命数据。
荧光寿命仪利用激光或其他光源激发荧光物质，然后通过检测荧光物质发射的荧光光强来确定荧光寿命。
二、荧光寿命的应用1. 生物医学研究领域荧光寿命在生物医学研究中有着广泛的应用。
例如，在分子生物学中，荧光寿命可以用于研究荧光标记的分子在细胞中的运动和相互作用。
荧光寿命还可以用于研究细胞内的代谢活动和分子结构的变化，如DNA的损伤修复和蛋白质的折叠过程等。
此外，荧光寿命还可以用于研究荧光染料在生物组织中的分布和代谢途径，从而为荧光成像提供了重要的信息。
2. 材料科学领域荧光寿命在材料科学领域也有着重要的应用。
例如，在半导体材料中，荧光寿命可以用于研究材料的光致发光性质和载流子寿命。
荧光寿命还可以用于研究荧光材料的光学性能和电子结构，从而为材料的设计和应用提供指导。
3. 环境监测领域荧光寿命在环境监测领域也有着重要的应用。
例如，在水质监测中，荧光寿命可以用于研究水中有机物质的来源和分解途径。
荧光寿命还可以用于研究大气颗粒物中的有机污染物和气溶胶物质，从而为环境保护和治理提供重要的数据支持。
4. 光电子学领域荧光寿命在光电子学领域也有着重要的应用。
例如，在光通信领域，荧光寿命可以用于研究光纤和光器件的光学性能和信号传输特性。
荧光寿命还可以用于研究光电器件的发光机制和光电转换效率，从而为光电子技术的发展提供重要的参考。
总结：荧光寿命作为荧光物质的一个重要特性，在生物医学、材料科学、环境监测和光电子学等领域都有着广泛的应用。
荧光寿命谱
荧光寿命谱
荧光寿命谱（Fluorescence Lifetime Spectrum）是一种用于研究物质荧光特性的光谱技术。
荧光寿命是指荧光物质在激发态下的寿命，它与物质的化学结构和所处环境密切相关。
通过测量荧光寿命，可以获取关于物质结构、性质和微观环境的信息。
荧光寿命谱测量技术主要包括时域和频域两种方法：
1. 时域荧光寿命测量：通过测量荧光信号随时间的变化，得到荧光寿命。
这种方法通常采用时间相关单光子计数（Time-Correlated Single Photon Counting，TCSPC）技术，可以测量寿命范围从几十皮秒到几秒的荧光过程。
2. 频域荧光寿命测量：通过测量荧光信号在激发光源频率范围内的变化，得到荧光寿命。
这种方法通常采用相调制（Phase Modulation）和频闪（Frequency Flash）等技术，可以测量寿命范围从几十兆赫兹到几十吉赫兹的荧光过程。
荧光寿命谱在物理学、化学、生物学、材料科学等领域有广泛的应用。
例如，在生物医学研究中，通过测量荧光寿命谱可以研究生物分子之间的相互作用、蛋白质的构象变化等；在材料科学中，可以研究材料的电子结构和光学性质等。
荧光寿命测定方法.
五、荧光寿命测定中可能存在的问题
• 当荧光寿命值与仪器自身响应时间为同一量级时，实测结果为二 者的卷积，需要对结果进行解卷积，扣除系统响应时间的影响。 • 发光材料自身存在荧光俘获效应，尽量减小样品厚度。
谢谢大家！
均寿命τ 。 τ =1/A21
一、荧光寿命的概念
假定一个无限窄的脉冲光(δ函数) 激发n0 个原子到其激发态,处于激发态的 原子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。假定两种衰减跃迁速率分别为Γ 和knr ,则激发态衰减速率可表示为 d n ( t)/d t= - (Γ + knr ) n ( t) 其中n ( t) 表示时间t 时激发态原子的数目,由此可得到激发态物质的单指数 衰减方程。 n ( t) = n0 exp ( - t/τ) 式中τ为荧光寿命。荧光强度正比于衰减的激发态分子数,因此可将上式改 写为: I ( t) = I0 exp ( - t/τ) 其中I0 是时间为零时的荧光强度。于是,荧光寿命定义为衰减总速率的倒数: τ = (Γ + knr ) - 1 也就是说荧光强度衰减到初始强度的1/e 时所需要的时间就是该荧光物质 在测定条件下的荧光寿命。
Pf(t) ≈ <λ(t)> = αI（t） 只要测得单个光电子到达时间概率分布，也就得到了微弱光场衰变曲线。 利用窗口鉴别器开设时间窗口，可以很方便地测量激发后不同时间区间 的荧光光谱，就得到了时间分辨荧光光谱。利用非线性最小二乘法、矩 法、Laplace 变换法、最大熵法以及正弦变换法等拟合曲线得到结果。
一、荧光寿命的概念
自发辐射跃迁的过程是一种只与原子本身的性质有关，与辐射场无关的自
发过程。A21的大小与原子处在E2能级上的平均寿命τ 2有关。 E2能级上的粒子数密度n2随时间的变化率
荧光寿命名词解释
荧光寿命名词解释
荧光寿命是指荧光物质从激发态返回基态所需要的时间。
荧光物质在受到能量激发后，会进入激发态，此时电子处于高能级，不稳定的状态。
荧光物质会通过自发辐射的方式跃迁到较低的能级，释放出能量，并产生荧光现象。
荧光寿命就是这个跃迁过程所需要的时间。
荧光寿命是荧光物质特性的重要指标，通常用来描述荧光物质的稳定性和发光效率。
荧光寿命与分子的内部结构、化学环境和溶剂有关。
不同的荧光物质具有不同的荧光寿命，通常在纳秒到微秒的范围内。
荧光寿命可以通过多种方法进行测量，最常用的是时间相关单光子计数技术。
这种方法通过测量荧光物质所释放的光子的到达时间和强度，来推断荧光寿命。
还有一种方法是使用荧光寿命成像技术，该技术可以用来观察并测量荧光物质在空间上的分布和寿命。
荧光寿命的测量对于很多领域都有重要的应用价值。
在生物医学领域，荧光寿命可以用来研究生物分子的结构和功能，例如蛋白质的折叠状态和交互作用。
在材料科学领域，荧光寿命可以用来评估和优化荧光材料的性能，例如有机发光二极管（OLED）和荧光染料。
此外，荧光寿命还可以用来研究分子的运动和环境变化。
通过观察荧光寿命的变化，可以推断分子所处的生化过程和环境参数，如温度、离子浓度和pH值。
这些信息对于理解分子的功
能和反应动力学具有重要意义。
总之，荧光寿命是荧光物质特性的重要指标，可以用来研究分子结构和功能。
通过测量荧光寿命，可以获得对分子的独特信息，有助于推断分子的性质和反应过程。
荧光寿命在生命科学、材料科学和化学分析等领域都有广泛的应用。
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化学通报 2001 年 第 10 期 http :ΠΠwww. chemistrymag. org
的分子体积 ( V0 ) ,根据 Perrin 方程来计算荧光寿命[4] ,虽然这种方法所用仪器比较简单 ,但测定过
数有限 ,因此测量精度较差 。1980 年后多频相技术得到发展 ,相调制技术测定荧光寿命的精度也随之
提高 ,从而使复杂体系荧光寿命测定成为可能。但同时仪器也变得昂贵 ,实验测定难度也相应增大。
113 频闪技术[9]
频闪技术也叫脉冲取样 技 术 ( Pulse Sam2
pling Techniques) ,仪器工作原理示于图 3 ( a) 。
首先商品化 。此外 ,Edinburgh Instruments、IBH、HORIBA 等公司也在生产基于 TCSPC 的时间分辨荧
光光谱仪 。
TCSPC 的工作原理如图 1 所示 ,光源发出的脉冲光引起起始光电倍增管产生电信号 ,该信号通
过恒分信号甄别器 1 启动时辐转换器工作 ,时幅转换器产生一个随时间线性增长的电压信号 。另
除了直接应用之外 ,荧光寿命测定还是其它时间分辨荧光技术的基础 。例如基于荧光寿命测 定的荧光猝灭技术可以研究猝灭剂与荧光标记物或探针相互靠近的难易 ,从而对所研究体系中探 针或标记物所处微环境的性质作出判断 。基于荧光寿命测定的时间分辨荧光光谱可以用来研究激 发态发生的分子内或分子间作用以及作用发生的快慢 。另外 ,非辐射能量转移 、时间分辨荧光各向 异性等主要荧光技术都离不开荧光寿命测定 。因此本文拟对荧光寿命测定的主要方法 、各种方法 的原理 、特点以及荧光寿命测定的主要应用进行介绍 。
外 ,光源发出的脉冲光通过激发单色器到达样品池 ,样品产生的荧光信号再经过发射单色器到达终
止光电倍增管 ,由此产生的电信号经由恒分信号甄别器 2 到达时幅转换器并使其停止工作 。这时
时幅转换器根据累积电压输出一个数字信号并在多道分析仪 (Multichannel Analyzer) 的相应时间通
道计入一个信号 ,表明检测到寿命为该时间的一个光子 。几十万次重复以后 ,不同的时间通道累积
下来的光子数目不同 。以光子数对时间作图可得到如图 2 所示直方图 ,此图经过平滑处理得到荧
光衰减曲线 。
图 1 单光子计数( TCSPC) 测定
图 2 单光子计数荧光衰减曲线
荧光寿命工作原理图
形成示意图
实际测定中 ,必须调节样品的荧光强度 ,确保每次激发后最多只有一个荧光光子到达终止光电
倍增管 。假若一次激发引起的是多个荧光光子信号 ,则最先到达光电倍增管的 (寿命短的) 光子引
相调制技术也称之为“频域法”( Frequency2Domain Method) 。相调制与 TCSPC 不同之处在于样
品被正弦调制的激发光激发 ,发射光是激发光的受迫响应 ,因此发射光和激发光有着相同的圆频率 (ω) ,但是由于激发态的微小时间停滞 ———荧光寿命 ,调制发射波在相上滞后激发波一个相角 <。
上早在 1960 年就有人提出用频闪技术测定荧
光寿命[10] ,不过当时能够测定的荧光寿命在毫
秒级 、分辨率太差 ,实用价值不大 ,因此一直没
有得到广泛关注 。随着计算机技术的 发 展 ,
1987 年 PTI 公司将纳秒级频率荧光寿命测定仪
商品化[9] 。最近 PTI 公司推出了新一代频闪分
时光谱仪[11] ,据称新一代频闪分时光谱仪有着
另外 ,相对于激发波 ,发射波被部分解调 ,其振幅比激发波的振幅小 。利用实验测定的相角 < 和解
调参数 m (发射波振幅与激发波振幅之比) 可计算出相寿命 (τp ) 和调制寿命 (τm) ,对于单指数衰减 , τp 与τm 相等 。关于相调制法荧光寿命的测定原理可参见文献[ 4 ] 。
相调制技术所用仪器比 TCSPC 类仪器便宜 ,而且测定速度也快得多 ,但实验所能选择的频率
光被检测 。如果在预设时间内没有荧光信号到达终止光电倍增管 ,则时幅转换器自动回复到零 ,不
输出信号 。
TCSPC 法的突出优点在于灵敏度高 、测定结果准确 、系统误差小 ,是目前最流行的荧光寿命测
定方法 。但是这种方法所用仪器结构复杂 、价格昂贵 、而且测定速度慢 ,无法满足某些特殊体系荧
光寿命测定的要求 。
TCSPC 的准确性 ,比相调制测定速度更快 ,操作
也很方便 ,仪器价格也大大降低 。不过脉冲法 得到的荧光衰减曲线包含噪音的水平尚无法知
图 3 脉冲取样法测定荧光寿命工作原理图 (a) 工作原理图 ; (b) 检测时间门与
道 ,在数据分析时应当有所估计 。
荧光衰减关系示意图
除了上述三种主要的荧光寿命测定方法外 ,条纹相 机法 (Streak Cameras) [12] 和上转换法 (Upcon2
测定中 ,样品被脉冲光源激发 。与脉冲光源同
步 ,电压脉冲启动或按一定程式延迟启动光电
倍增管 ,光电倍增管按预设时间门 (Δt) 检测样
品的荧光强度 。一般检测时间门比荧光寿命短
得多 ,这样通过逐渐改变光电倍增管的延迟时
间 ,可以得到样品被脉冲光源激发后不同时刻
的一系列荧光强度 ,结果如图 3 ( b) 所示 。实际
1 荧光寿命测定
荧光寿命测定的现代方法主要有三种 ,即时间相关单光子记数法 ( Time2Correlated Single2Photon Counting , TCSPC) 、相调制法 ( Phase Modulation Methods) 和频闪技术 (Strobe Techniques) 。在这些方法 出现之前 ,人们也曾通过测定荧光物种在溶液中的荧光偏振 ( P) 、溶液粘度 (η) 以及估算荧光物种
version Methods) [13] 近年来也颇受人们关注 。
2 荧光寿命测定中的数据处理
211 荧光寿命及其含义
假定一个无限窄的脉冲光 (δ函数) 激发 n0 个荧光分子到其激发态 ,处于激发态的分子将通过
辐射或非辐射跃迁返回基态 。假定两种衰减跃迁速率分别为 Γ和 knr ,则激发态衰减速率可表示为
d n( t) dt
=-
(Γ + knr ) n ( t)
(2)
其中 n ( t) 表示时间 t 时激发态分子的数目 ,由此可得到激发态物种的单指数衰减方程 。
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荧光寿命测定的现代方法与应用
房 喻 王 辉
(陕西师范大学化学系 西安 710062)
摘 要 介绍了时间相关单光子计数 、相调制和频闪等三种现代荧光寿命测定方法的工作原理 ,指 出了各种方法的优点和局限性 ;介绍了时间相关单光子计数实验数据的处理方法 ;概述了时间分辨荧光 技术在化学和生命科学中的应用 。
程烦琐 ,而且不管荧光衰减机理 ,都只给出平均寿命 ,因此实际应用意义有限 。
1 P
-
1 3
≡
1 P0
-
1 3
1
+
R Tτ ηV0
(1)
111 时间相关单光子记数法[4 ,5]
TCSPC 是目前主要应用的荧光寿命测定技术 ,1975 年由 PTI( Photon Technology International) 公司
起时幅转换器停止 ,而长寿命的光子不被检测 ,这样实际得到的荧光衰减曲线将向短寿命一方偏
移 ,这种现象被称之为“堆积”效应 ( Pileup Effect) [6 ,7] 。为了避免堆积效应 ,实际测定时 ,多道分析仪
存储的光子数大致只有光源脉冲数的 1 %。也就是说 ,光源 100 次脉冲 ,大约只有 1 次所引发的荧
房 喻 男 ,44 岁 ,博士 ,教授 ,主要从事光物理应用和高分子胶体与界面研究 。E2mail :yfang @snnu. edu. cn 国家自然科学基金资助项目 (29973024) 和教育部中青年骨干教师基金资助项目 (3006) 2001201231 收稿 ,2001202225 修回
Key words Fluorescence lifetime , Time2correlated single photon counting , Phase modulation methods , Strobe techniques
荧光是分子吸收能量后其基态电子被激发到单线激发态后由第一单线激发态回到基态时所发 生的 ,而荧光寿命是指分子在单线激发态所平均停留的时间 。荧光物质的荧光寿命不仅与自身的 结构而且与其所处微环境的极性 、粘度等条件有关 ,因此通过荧光寿命测定可以直接了解所研究体 系发生的变化 。荧光现象多发生在纳秒级 ,这正好是分子运动所发生的时间尺度 ,因此利用荧光技 术可以“看”到许多复杂的分子间作用过程 ,例如超分子体系中分子间的簇集[1] 、固液界面上吸附态 高分子的构象重排[2] 、蛋白质高级结构的变化[3] 等 。
(4)
其中 I0 是时间为零时的荧光强度 。于是 ,荧光寿命定义为衰减总速率的倒数 :
τ = (Γ + knr ) - 1
(5)
也就是说荧光强度衰减到初始强度的 1Πe 时所需要的时间就是该荧光物种在测定条件下的荧光寿
命 。实际上用荧光强度的对数对时间作图 ,直线斜率即为荧光寿命倒数的负值 。荧光寿命也可以
理解为荧光物种在激发态的统计平均停留时间 。事实上当荧光物质被激发后有些激发态分子立即