时间相关单光子计数法测量荧光寿命-2011
荧光寿命_论文-自然科学论文
荧光寿命荧光寿命（ FLT）检测摘要这个技术手册介绍了荧光寿命（ FLT）这种新技术的基本原理。
从这本技术手册里，我们可以简单的了解与这项技术相关的理论基础和与之配合的实验条件，以及通过一项应用实例讨论了如何对实验中所获得的数据进行解析和归类的方法。
•微孔板技术在高通量筛选中的价值使用者利用一个 marker或者是标记物受光激发后，通过一台普通的微孔板阅读器，就可以监测生化和生物反应进程。
常用的读取模式包括检测吸收光，荧光强度(FI)，荧光偏振（FP），时间分辨荧光（TRF）。
一般没有方法能够包含所有可能的分析模式，如果达到这样的高分析程度，需要一个配套的方法能够覆盖尽可能宽的实验范围。
尽管如此，，还是会有一种方法被优选选择，通过它能够得到更可靠的数据，更高端的信息，以及迅速的读取数据。
荧光寿命被定义成荧光分析在回到基态之前驻留在激发态的时间。
荧光寿命对荧光标记物周围的微环境高度敏感。
当标记一个反应对，由于化学反应改变这个反应对的状态（例如在酶反应体系中）或者是发生了与其他结合伴侣的结合（例如受体 -配体的结合），将影响到上面所提到的微环境。
无论如何，检测荧光寿命将直接指示反应环境。
这类信号要远远强于通常会影响其它探测方法的干扰信号，因此它将为市场需求加入巨大的推动力。
Tecan Ultran Evolution detection platform已经融入了对荧光寿命的检测。
除了已经发展的各种检测方法以外，这项新技术使得Ultran Evolution技术平台具有更强的市场应用前景。
2.荧光寿命测定的原理用 Ultra Evolution测定荧光寿命采用的一种方法，称作时间关联的单光子计数（TCSPC）。
实验的基本流程显示在图1。
一个脉冲激光器重复激发样品。
调节激发脉冲的强度，使得对于任何一个脉冲，在探测器上只有一个光子被计数。
按照测量的激光脉冲和探测器感应之间的这段时间，将计数值引入已用荧光计数和时间绘制的柱状图。
基于时间相关单光子计数的荧光寿命成像技术
基于时间相关单光子计数的荧光寿命成像技术
盛翠霞;李田泽
【期刊名称】《强激光与粒子束》
【年(卷),期】2010(22)8
【摘要】采用时域法中的时间相关单光子计数方法记录荧光寿命,时间相关单光子计数采用多波长通道同时记录荧光光子数,可以提高计数效率和信息量,还可以在稳态图像中分离不同荧光团,形成4维图像.并采用多光子激发技术,利用长波长光源发出的两个或多个光子可以激发出一个短波长的光子.多个光子必须几乎同时到达激发点, 才能提供被激发分子足够的能量以产生荧光.多光子激发波长较长, 生物组织对其散射减小,因而可以穿透到更深层的组织,从而提高荧光成像深度和空间分辨力,并减少对活体样品的损伤.
【总页数】4页(P1731-1734)
【作者】盛翠霞;李田泽
【作者单位】山东理工大学,电气与电子工程学院,山东,淄博,255049;山东理工大学,电气与电子工程学院,山东,淄博,255049
【正文语种】中文
【中图分类】Q631
【相关文献】
1.皮秒时间相关单光子计数光谱仪的核心技术 [J], 张秀峰;宋克菲;于涛;韩炳冬;盛翠霞;林久令
2.时间相关单光子计数记录快速荧光寿命图像 [J], Bertram SU;Vicky KATSOULIDOU
3.时间相关单光子计数荧光寿命测量中数据获取和处理 [J], 龚达涛;刘天宽;虞孝麒
4.基于弹性变分模态提取的时间相关单光子计数信号去噪 [J], 汪书潮;苏秀琴;朱文华;陈松懋;张振扬;徐伟豪;王定杰
5.IEC/TS 62607-3-3:2020《纳米制造-关键控制特性-第3-3部分:发光纳米材料-时间相关单光子计数(TCSPC)测定半导体量子点荧光寿命》标准解读 [J], 樊阳波;王益群
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荧光寿命测定的现代方法与应用
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化学通报
F<<: 年 第 :< 期
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［!］ 相调制技术 相调制技术也称之为 “频域法” （ "#$%&$’()*+,-./’ 0$12,3） 。相调制与 45675 不同之处在于样 品被正弦调制的激发光激发， 发射光是激发光的受迫响应， 因此发射光和激发光有着相同的圆频率 ， 但是由于激发态的微小时间停滞— — —荧光寿命， 调制发射波在相上滞后激发波一个相角 "。 （!） 另外， 相对于激发波， 发射波被部分解调， 其振幅比激发波的振幅小。利用实验测定的相角 " 和解 调参数 ! （发射波振幅与激发波振幅之比） 可计算出相寿命 （ 和调制寿命 （ ， 对于单指数衰减， #8） #-） ［9］ 。 #8 与#- 相等。关于相调制法荧光寿命的测定原理可参见文献
（ " ）# !! "#$ （ $ " %!） !
式中! 为荧光寿命。荧光强度正比于衰减的激发态分子数， 因此可将上式改写为：
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其中 & ! 是时间为零时的荧光强度。于是， 荧光寿命定义为衰减总速率的倒数：
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也就是说荧光强度衰减到初始强度的 ) + " 时所需要的时间就是该荧光物种在测定条件下的荧光寿 命。实际上用荧光强度的对数对时间作图， 直线斜率即为荧光寿命倒数的负值。荧光寿命也可以 理解为荧光物种在激发态的统计平均停留时间。事实上当荧光物质被激发后有些激发态分子立即 这样就形成了实验测定的荧光强度 返回基态， 有的甚至可以延迟到 * 倍于荧光寿命时才返回基态， 衰减曲线。 由于实际体系的复杂性， 荧光衰减往往要用多指数或非指数衰减方程描述：
荧光寿命测定方法
λ（t）＝ αI（t） 式中：α 是比例系数。说明光电子发射概率密度与光场瞬时强度成正比。
三、时间相关的单光子计数方法TCSPC
降低激光功率，使每一个激光脉冲所含能量足够小，以至于每次激发样 品时或者仅有１个荧光光子到达探测器的光阴极，或者没有。假如100个 激光脉冲激发样品，所发出的荧光光子仅能使光阴极平均发射１个光电 子。光子q重概率密度则变成单个光电子概率密度：
dn2(t)/dt=-(dn21/dt)sp=-A21n2(t) n2(t)= n2(0)e -A21n2(t)
定义粒子数密度由t=0时的n(0)衰减到它的1/e时所用的时间为E2能级的平 均寿命τ。
τ=1/A21
一、荧光寿命的概念
假定一个无限窄的脉冲光(δ函数) 激发n0 个原子到其激发态,处于激发态的 原子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。假定两种衰减跃迁速率分别为Γ 和knr ,则激发态衰减速率可表示为
荧光寿命测定方法
一、荧光寿命的概念 二、测定荧光寿命的几种方法 三、时间相关单光子计数方法TCSPC 四、TCSPC技术优缺点 五、荧光寿命测定中可能存在的问题
自发跃迁几率：发光材料在单位时间内，从高能级上产生自发辐射的发光粒子数密度占高能级总粒子数密度的比值
一、荧光寿命的概念
一、荧光寿命的概念 假如100个激光脉冲激发样品，所发出的荧光光子仅能使光阴极平均发射１个光电
• 实际测定中,必须调节样品的荧光强度,确保每次激发后最多只有 一个荧光光子到达终止光电倍增管。否则会引起“堆积效应” (Pileup Effect)；
• 对于量子效率较高的样品，需要限制激发光强度，即减小多个光 电子同时到达的概率；
• 这种方法所用仪器结构复杂、价格昂贵、而且测定速度慢,无法满 足某些特殊体系荧光寿命测定的要求。
时间相关单光子计数法测量荧光寿命-2011
时间相关单光子计数法测量荧光寿命（一）实验目的与要求目的：1、了解时间相关单光子计数法测量荧光寿命的原理和方法2、学习时间相关单光子计数荧光光度计的使用方法要求：1、掌握时间相关单光子计数法测量荧光寿命的原理；2、理解荧光寿命测量在物质定性及定量分析中的应用；3、了解时间分辨荧光光光度计的基本组成，各部件的作用；4、学习利用Origin软件处理实验数据。
（二）实验原理1 时间相关单光子计数器工作原理TCSPC（Time-Correlated Single Photon Counting）是目前主要应用的荧光寿命测定技术。
1975 年由PTI(Photon Technology International) 公司首先商品化，此外，Edinburgh Instruments、IBH、HORIBA 等公司也在生产基于TCSPC 的时间分辨荧光光谱仪。
TCSPC 的工作原理如图1 所示，光源发出的脉冲光引起起始光电倍增管产生电信号，该信号通过恒分信号甄别器1 启动时辐转换器工作，时幅转换器产生一个随时间线性增长的电压信号。
另外，光源发出的脉冲光通过激发单色器到达样品池，样品产生的荧光信号再经过发射单色器到达终止光电倍增管，由此产生的电信号经由恒分信号甄别器2 到达时幅转换器并使其停止工作。
这时时幅转换器根据累积电压输出一个数字信号并在多道分析仪(Multichannel Analyzer) 的相应时间通道计入一个信号，表明检测到寿命为该时间的一个光子。
几十万次重复以后，不同的时间通道累积下来的光子数目不同。
以光子数对时间作图可得到如图2 所示直方图,此图经过平滑处理得到荧光衰减曲线。
图1 TCSPC 的工作原理简图图2 时间相关单光子计数2 荧光寿命及其含义假定一个无限窄的脉冲光(δ函数) 激发n 0个荧光分子到其激发态，处于激发态的分子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。
假定两种衰减跃迁速率分别为Γ和k nr ，则激发态衰减速率可表示为)()()(t n k dtt dn nr +Γ-= 其中n (t ) 表示时间t 时激发态分子的数目，由此可得到激发态物种的单指数衰减方程。
TCSPC荧光寿命工作原理
Techcomp LtdTCSPC 时间相关单光子计数技术基本原理说明Dr. Hailin Qiu2011-9-3qwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyu iopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfg hjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcv bnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqw ertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiop asdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjk lzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbn mqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwert yuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopas dfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklz xcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnm qwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyu iopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfg hjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcv bnmrtyuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyu iopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfg hjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcv bnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqw TCSPC 时间相关单光子计数技术 基本原理说明 2011-9-3 Dr. Hailin Qiu荧光寿命测试—TCSPC工作原理处于分子轨道基态的电子吸收高能量光子的激发后，跃迁到激发态，产生电子-空穴对，这个过程我们称为光致激发，处在激发态的电子从第一激发单重态回到基态，以发光的形式释放出能量，整个过程称为光致发光的荧光过程。
时间相关单光子检测
时间相关单光子检测一、时间相关单光子检测是啥呢？嘿呀，咱先聊聊这个听起来就很酷炫的“时间相关单光子检测”吧。
其实呢，这就像是一个超级精密的时间侦探在追踪那些超级微小的光子。
你想啊，光子那么小，要检测它们就已经很难了，还得和时间关联起来，这就像是在一堆沙子里找特定的一粒，还得知道它啥时候出现的呢。
二、它有啥用呢？这玩意儿用处可大啦。
比如说在科研领域，就像研究一些超微观的物理现象的时候，它能帮我们看清楚那些原子、分子啥的在极短时间内的变化。
就好比你想知道一个超级小的魔术是怎么变的，这个检测就能给你把每一个瞬间都揭露出来。
在医学上呢，也能发挥作用，比如说检测一些生物分子的活动啥的，就像是给身体里那些小小的“居民”拍一个超精细的活动纪录片，而且还是带时间轴的那种哦。
三、它是怎么做到的呢？这里面的门道可不少呢。
首先得有一个能检测单光子的设备，这个设备就像是一个超级敏感的眼睛，能捕捉到那些微弱的光子信号。
然后呢，还得有一套很厉害的计时系统，这个计时系统得非常非常精确，就像那种一秒钟能分成无数小份的时钟一样。
当光子被检测到的时候，这个计时系统就能把这个时间记录下来，这样就实现了时间相关的检测啦。
不过这过程可不像我说的这么简单，中间涉及到好多高科技的原理和技术呢。
四、它的发展历程时间相关单光子检测可不是一下子就这么厉害的。
最开始的时候呢，人们可能只是有了一个模糊的想法，就像在黑暗中看到了一点小亮光。
然后经过好多科学家的努力，一点一点地改进设备、优化技术。
就像盖房子一样，一块砖一块砖地往上垒，慢慢地就建成了现在这个看起来很厉害的样子。
在这个过程中，也遇到了好多困难呢，比如说怎么提高检测的灵敏度啊，怎么让计时更精确啊，不过这些困难都被聪明的科学家们克服啦。
五、未来的展望我觉得这个时间相关单光子检测以后肯定还能更厉害。
说不定能在更多的领域发挥作用，像探索宇宙的奥秘啦，研究那些神秘的外星物质啥的。
也可能会变得更小更方便，就像手机一样，人人都能拿着它来检测身边那些微观世界的小秘密呢。
荧光寿命谱
荧光寿命谱
荧光寿命谱（Fluorescence Lifetime Spectrum）是一种用于研究物质荧光特性的光谱技术。
荧光寿命是指荧光物质在激发态下的寿命，它与物质的化学结构和所处环境密切相关。
通过测量荧光寿命，可以获取关于物质结构、性质和微观环境的信息。
荧光寿命谱测量技术主要包括时域和频域两种方法：
1. 时域荧光寿命测量：通过测量荧光信号随时间的变化，得到荧光寿命。
这种方法通常采用时间相关单光子计数（Time-Correlated Single Photon Counting，TCSPC）技术，可以测量寿命范围从几十皮秒到几秒的荧光过程。
2. 频域荧光寿命测量：通过测量荧光信号在激发光源频率范围内的变化，得到荧光寿命。
这种方法通常采用相调制（Phase Modulation）和频闪（Frequency Flash）等技术，可以测量寿命范围从几十兆赫兹到几十吉赫兹的荧光过程。
荧光寿命谱在物理学、化学、生物学、材料科学等领域有广泛的应用。
例如，在生物医学研究中，通过测量荧光寿命谱可以研究生物分子之间的相互作用、蛋白质的构象变化等；在材料科学中，可以研究材料的电子结构和光学性质等。
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时间相关单光子计数法测量荧光寿命
（一）实验目的与要求
目的：1、了解时间相关单光子计数法测量荧光寿命的原理和方法
2、学习时间相关单光子计数荧光光度计的使用方法
要求：1、掌握时间相关单光子计数法测量荧光寿命的原理；
2、理解荧光寿命测量在物质定性及定量分析中的应用；
3、了解时间分辨荧光光光度计的基本组成，各部件的作用；
4、学习利用Origin软件处理实验数据。
（二）实验原理
1 时间相关单光子计数器工作原理
TCSPC（Time-Correlated Single Photon Counting）是目前主要应用的荧光寿命测定技术。
1975 年由PTI(Photon Technology International) 公司首先商品化，此外，Edinburgh Instruments、IBH、HORIBA 等公司也在生产基于TCSPC 的时间分辨荧光光谱仪。
TCSPC 的工作原理如图1 所示，光源发出的脉冲光引起起始光电倍增管产生电信号，该信号通过恒分信号甄别器1 启动时辐转换器工作，时幅转换器产生一个随时间线性增长的电压信号。
另外，光源发出的脉冲光通过激发单色器到达样品池，样品产生的荧光信号再经过发射单色器到达终止光电倍增管，由此产生的电信号经由恒分信号甄别器2 到达时幅转换器并使其停止工作。
这时时幅转换器根据累积电压输出一个数字信号并在多道分析仪(Multichannel Analyzer) 的相应时间通道计入一个信号，表明检测到寿命为该时间的一个光子。
几十万次重复以后，不同的时间通道累积下来的光子数目不同。
以光子数对时间作图可得到如图2 所示直方图,此图经过平滑处理得到荧光衰减曲线。
图1 TCSPC 的工作原理简图
图2 时间相关单光子计数
2 荧光寿命及其含义
假定一个无限窄的脉冲光(δ函数) 激发n 0个荧光分子到其激发态，处于激发态的分子将通过辐射或非辐射跃迁返回基态。
假定两种衰减跃迁速率分别为Γ和k nr ，则激发态衰减速率可表示为)()()(t n k dt
t dn nr +Γ-= 其中n (t ) 表示时间t 时激发态分子的数目，由此可得到激发态物种的单指数衰减方程。
荧光寿命定义为衰减总速率的倒数：
τ = (Γ + k nr ) – 1
荧光强度正比于衰减的激发态分子数，因此可将上式改写为:。
I ( t ) = I 0 exp ( - t /τ)
其中I 0 是时间为零时的荧光强度，τ为荧光寿命。
也就是说荧光强度衰减到初始强度的1/e 时所需要的时间就是该荧光物种在测定条件下的荧光寿命。
实际上用荧光强度的对数对时间作图，直线斜率即为荧光寿命倒数的负值。
荧光寿命也可以理解为荧光物种在激发态的统计平均停留时间。
事实上当荧光物质被激发后有些激发态分子立即返回基态，有的甚至可以延迟到5倍于荧光寿命时才返回基态，这样就形成了实验测定的荧光强度衰减曲线。
3 荧光寿命测定中的数据处理
由于实际体系的复杂性,荧光衰减往往要用多指数或非指数衰减方程描述:∑-=i
i t a t I )/ex p()(τ
式中αi 为第i 项的指前因子。
衰减方程的复杂性反映了体系中荧光物种的多样性或存在状态的复杂性。
当所测量的荧光寿命较短时，实验数据就和光源的脉冲宽度，光电倍增管及电子学电路的响应时间有着密切的关系。
为了去掉仪器响应对测量结
果的影响，需要解下面的积分方程：
)()()(k k k t I t L t N ⊗=
样品的实测荧光衰减曲线N (t k )，实际上为L (t k ) 与脉冲响应函数I (t ) 的卷积，即利用解卷积的办法有可能得到脉冲响应函数I (t )，进而求得描述样品荧光衰减本质的荧光寿命(τ) 等有关参量。
实际工作中一般以胶体SiO2 (商品名Ludox) 为虚拟样品进行测定,仪器响应函数表明了仪器能够测定的最短荧光寿命。
（三）仪器与样品
仪器：LifeSpec Ⅱ荧光光度计
样品：甲基橙染料溶液
（四）实验步骤与内容
1、实验仪器的准备：打开CO1，主机和F900电源；打开计算机，双击桌面上F900图标进入工作站；光度计开始初始化，并进行自检；当荧光光度计自检结束，处ready 状态时，则可以开始测量；
2、点击进入Signal Rate 设置窗口，先将Excitation Wavelength 和Emission Wavelength 处的Δλ均设置为0.01nm ，按回车键(Enter)或者点击Apply 确认；
3、打开样品室的盖子，将待测样品放置于样品架上，注意放置样品的位置，使激发光能落在样品上并且样品发出的光能进入探测器，然后盖好；
4、在Signal Rate 设置窗口内输入相应的Excitation Wavelength 和 Em1 Wavelength 值，逐渐加大Δλ，并调节Iris Setting 使Em1获得一个合适的Signal Rate （注意：在设置后需要按下回车或者Apply 按钮设置才真正生效，Em1的Signal Rate 千万不要超过106）；
5、点击λ按钮，选择Emission Scan ，进入设置窗口，在Emission Scan Parameters 内设置波长扫描范围、扫描间隔（step ）、停留时间（Dwell Time ）和扫描次数（Number of Scans ），设置完毕后点击Start 即开始测量，得到发射光谱(荧光光谱)；
6、点击τ按钮，选择Manual Lifetime ，进入设置菜单，在Excitation 栏内设置好激发波长和Light Source ，在Emission 1栏内设置好发射波长和Detector ，将Live 选择框勾上，然后开始设置下部的Lifetime Sample 1菜单，在Rates 标签内一边观察Stop Rate 一边调节Iris Setting 使Stop Rate 务必在2000以下，再在Time Range 标签内选择一个合适的Time Range 和Channels ，在Stop Condition 标签内根据样品情况选择一个合适的条件，设置好之后，点击New 开始测试。
(五) 数据处理
1. 测量完成后，点击保存将原始文件保存到“C:\users\导师\自己的文件夹”；
2. 点击“Zoom In”按钮，然后在图上选取一个需要进行拟合的范围，在Data 菜单
下选择“Exponential Fit中的Tail Fit，在弹出的窗口内输入数值进行拟合，得到衰减寿命；对于寿命很短的样品，在样品测量完成后，要做仪器的衰减(即IRF)。
3、拟合完成后，保存拟合的文件，共三种类型的文件，原始文件，ASCⅡ文件和图片文件：直接点击保存可以保存原始文件，点击File选择Export ASCII即可以保存成文本文件；选择save as，保存文件类型选择为Windows MetaFile可以保存成图片格式。
（六）关机程序
1. 关闭F900程序和计算机；
2. 关闭CO1电源，F900电源和主机电源；
3. 关闭laser电源以及其他使用过的仪器；
4. 在使用记录本上做好使用记录。
（七）思考题
1、荧光寿命测量中stop rate为何不能超过2000？
2、如何选择laser的重复频率和寿命测量的“时间窗口”？。