第20章 比色法和分光光度法
比色法和分光光度计分析法
分光光度计分析法的原理
分光光度计分析法的原理基于朗伯-比尔定律，即当一束单 色光通过溶液时，光线被吸收的程度与溶液的浓度和液层 的厚度成正比。
通过测量特定波长的光线通过溶液后的透射强度，可以计 算出溶液中目标物质的浓度。分光光度计可以自动调整波 长，并使用光电检测器测量透射光线强度，从而得到吸光 度值。
比色法对实验条件要求不高，可 在普通实验室进行。分光光度计 分析法需要使用精密仪器，对实
验室环境有一定要求。
实验时间
比色法操作简便，实验时间较短 。分光光度计分析法需要较长时
间进行波长调整和测量。
准确度的比较
准确度
分光光度计分析法具有较高的准确度 ，能够更准确地测量待测物质的浓度 。比色法准确度相对较低，但适用于 一般实验室和现场检测。
挑战与机遇
挑战
尽管比色法和分光光度计分析法具有许多优点，但仍存在一些挑战，如样品预处理、干扰物质的影响以及仪器设 备的普及程度等。
机遇
随着科学技术的不断进步和应用领域的拓展，比色法和分光光度计分析法将面临更多的发展机遇。同时，政府支 持、市场需求和技术创新也将为其发展提供有力支持。
谢谢您的聆听
THANKS
05
未来展望
技术发展展望
智能化
01
随着人工智能和机器学习技术的进步，比色法和分光光度计分
析法将更加智能化，实现自动化、快速和准确的检测。
高灵敏度
02
提高检测灵敏度是未来的重要发展方向，以便更好地检测低浓
度的物质。
多组分同时检测
03
发展多组分同时检测技术，能够同时测定多种目标物质，提高
分析效率。
应用领域展望
干扰因素
重复性
分光光度计分析法的重复性较好，结 果稳定。比色法重复性相对较差，受 操作影响较大。
吸光光度法
第20 章吸光光度法吸光光度法(light absorption method)是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。
包括比色法（colorimetric method）和分光光度法（spectrophotometry）。
前者是通过比较有色溶液颜色深浅来确定有色物质的含量；后者是根据物质对一定波长光的吸收程度来确定物质的含量的。
分光光度法包括紫外分光光度法（ultraviolet spectrophotometry）、可见光分光光度法（visible spectrophotometry）、红外分光光度法（infrared spectrophotometry）。
本章主要讨论可见光分光光度法。
20.1 概述20.1.1 物质对光的选择性吸收1. 光的性质光是一种电磁波，具有波粒二象性。
光的偏振、干涉、衍射、折射等现象就是其波动性的反映，波长λ与频率ν之间的关系式：λν=c （c为光速）亦反映光的波动性。
光又是由大量具有能量的粒子流所组成，这些粒子称为光子。
光子的能量则反映微粒性，光子的能量E 与波长λ的关系：E = hν = hc/λ（h为普朗克常量）亦可用来表示光的微粒性。
由上述关系可知，光子的能量与光的波长（或频率）有关，波长越短，光能越大，反之亦然。
光的能量范围很广，在波长或频率上相差大约20个数量级。
不同光的波长范围及其在分析化学中的应用情况见表20-1。
表20-1 各种光的波长范围及其在分析化学中的应用情况光的名称波长范围跃迁类型分析方法X-射线远紫外光近紫外光可见光近红外光中红外光远红外光微波无线电波10-1~ 10nm10 ~ 200nm200 ~ 400nm400 ~ 750nm0.75 ~ 2.5μm2.5 ~ 50μm50 ~ 1000μm0.1 ~ 100cm1 ~ 1000mK和L层电子中层电子价电子价电子分子振动分子振动分子振动和低位振动分子转动X射线光谱法真空紫外光度法紫外光度法比色及可见光度法近红外光谱法中红外光谱法远红外光谱法微波光谱法核自旋共振光谱2. 物质的颜色与其对光的选择性吸收光可分为单色光与复合光，单色光（chromatic light）是仅具有单一波长的光，而复合光（polychromatic light）是由不同波长的光（不同能量的光子）所组成。
紫外可见分光光度法
有色化合物组成
Fe(CNS)52MoO(CNS)52WO(CNS)4Nb(CNS)4硅钼蓝 磷 磷钨蓝 磷钼钒杂多酸 Cu(NH3)42+ Co(NH3)62+ Ni(NH3)62+ TiO(H2O2)2+ VO(H2O2)3+ Nb2O3(SO4)2(H2O2)
颜色
红 橙 黄 黄 蓝 蓝 蓝 黄 蓝 红 紫 黄 红橙 黄
OH COOH
其结构式如下：
SO3H
可用于测定三价铁离子。
② 邻二氮菲（邻菲罗啉，1， 10—二氮菲）： 结构式为：
在PH=3～9时 与Fe2+生成红 色螯合物。用 于铁的测定。
N
N
③ 双硫腙：也叫二苯—硫腙。 结构式为：
NH S C N N NH
测定很多重金属离子，如：铅、锌、铜、 银、汞、镉等。
470 氧化剂存在、 碱性 570 不同酸度 490～550 (Pb520)
偶氮胂(Ⅲ) U( Ⅳ ) 、 U( Ⅵ ) 、 强酸至弱酸 665～675 (Th665) Th( Ⅳ ) 、 Zr( Ⅳ ) 、 La3+、 Ce4+、Ca2+、Pb2+等 铬天菁S Al PH5～5.8 530
5.9×104
（二）显色剂： 与待测组分生成有色化合物的 试剂叫显色剂； 分为两种 无机显色剂和有机显色剂
1．无机显色剂：
显色剂 测定元素 反应介质 /(mol/L) 鉄 0.1～0.8 HNO3
钼 钨 铌 硅 磷 钨 钒 铜 钴 镍 钛 钒 铌 1.5～2 1.5～2 3～4 0.3～0.5 0.5 4～6 1.0 浓氨水 H2SO4 H2SO4 HCl H2SO4 H2SO4 HCl HNO3
比色法和分光光度法cha
20.1.2 吸收光谱
1. 光谱区的划分
1000u m10um
波 长
100n m10n m
微波 远红外 近红外 可见光 近紫外 真空紫外 X-射线 -射线
红 620 － 750nm
橙 590 － 620nm
黄 570 － 590nm
绿 550 － 570nm
青 495 － 55109n0m－400nm 蓝 450 － 495nm
2. 分光光度计的基本部件
光 源
单 色 器
吸 收 池
检 测 系 统
结 果 显 示
光源： ➢ 在可见和近红外区使用钨灯或碘钨灯，波长范围 320-2500nm； ➢ 在紫外区使用氢灯或氘灯，波长范围180-375nm。 ➢ 使用稳压器保证光强稳定。
单色器：
➢色散元件：将连续光谱分解为单色光的元件（如棱镜、 光栅）；
实例1：荧光分析法测定邻- 与间-羟基苯甲酸
➢邻- 与间-羟基苯甲酸均含有能发射荧光的苯环，但取代 基的位置不同使它们具有不同的荧光性质；
➢碱性溶液中（pH12），二者在310nm附近紫外光的激发 下均发生荧光，而在中性偏酸性溶液中（pH5.5）只有邻羟基苯甲酸发荧光；对-羟基苯甲酸在上述两种条件下均不 发生荧光，故不干扰测定。
➢对于一个可能含有邻- 、间-和对-羟基苯甲酸的样品溶液， 先在pH5.5测定邻-羟基苯甲酸含量，然后在pH12测定邻与间-羟基苯甲酸总量，计算得到间-羟基苯甲酸含量。
实例2：环糊精增敏4-羟基香豆素衍生荧光法测定肉制品中 痕量亚硝酸盐。
比色法和分光光度法cha
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比色法和分光光度法及其仪器
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分光光度法
分光光度法的优点和缺点
分光光度法的优点包括高精度、高灵敏度和高选择性。它能够提供精确的定量数据，适用 于各种不同物质的测量。此外，分光光度法通常具有较高的灵敏度和较低的检测限，能够 检测到微量的物质 然而，分光光度法也有一些缺点。首先，它需要昂贵的仪器设备，通常只有实验室级别的 分析才使用分光光度计。其次，分光光度法需要一定的操作技能和经验，因为不同物质的 测量可能需要不同的条件和参数设置。此外，对于某些特定物质的测量，可能需要使用特 定的试剂和标准品，这可能会增加实验成本和时间
比色法和分光光度 法及其仪器
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目录
CONTENTS
1 比色法 2 分光光度法Biblioteka 比色法和分光光度法及其仪器
比色法和分光光度法是两种常用的化学分析方法，用 于测量溶液中的物质浓度
x
这两种方法都基于朗伯-比尔定律，该定律描述了溶液 的吸光度与溶液浓度之间的关系
PART 1
比色法
比色法
比色法是一种通过比较有色物质 溶液的颜色深度来确定其浓度的
技术
它主要基于颜色的差异，使用肉 眼或比色计来比较样品溶液和标 准溶液的颜色
比色法
比色法仪器
比色法通常使用比色计作为仪器。比色计是一种简单的 光学仪器，它通过比较样品溶液和标准溶液的颜色来测 量浓度。比色计通常由一个光源、一个滤光片和一个接 收器组成。光源发出的光通过滤光片，然后照射到样品 溶液和标准溶液上。接收器接收反射回来的光，并将其 转换为电信号。通过比较样品溶液和标准溶液的反射率 ，可以确定样品的浓度
紫外分光光度法计算
第20章 吸光光度法思 考 题1. 什么叫单色光？复色光？哪一种光适用于朗伯－比耳定律？答：仅具有单一波长的光叫单色光。
由不同波长的光所组成光称为复合光。
朗伯--比耳定律应适用于单色光。
2. 什么叫互补色？与物质的颜色有何关系？答：如果两种适当的单色光按一定的强度比例混合后形成白光，这两种光称为互补色光。
当混合光照射物质分子时，分子选择性地吸收一定波长的光，而其它波长的光则透过，物质呈现透过光的颜色，透过光与吸收光就是互补色光。
3. 何谓透光率和吸光度？ 两者有何关系？答：透光率是指透射光强和入射光强之比，用T 表示 T =tI I 吸光度是吸光物质对入射光的吸收程度，用A 表示，A εbc =，其两者的关系 lg =-A T4. 朗伯-比耳定律的物理意义是什么？ 什么叫吸收曲线？ 什么叫标准曲线？答：朗伯--比耳定律是吸光光度法定量分析的理论依据，即吸光物质溶液对光的吸收程度与溶液浓度和液层厚度之间的定量关系。
数学表达式为 lg A T εbc =-=吸收曲线是描述某一吸光物质对不同波长光的吸收能力的曲线，即在不同波长处测得吸光度，波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图即可得到吸收曲线。
标准曲线是描述在一定波长下，某一吸光物质不同浓度的溶液的吸光能力的曲线，吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作图即可得到。
5. 何谓摩尔吸光系数？质量吸光系数？两者有何关系？答：吸光系数是吸光物质吸光能力的量度。
摩尔吸光系数是指浓度为1.0 mol·L ，液层度为1cm 时，吸光物质的溶液在某一波长下的吸光度。
用ε表示，其单位 11cm mol L --⋅⋅。
质量吸光系数是吸光物质的浓度为1g 1L -⋅时的吸光度，用a 表示。
其单位 11cm g L --⋅⋅ 两者的关系为 εM a =⨯ M 为被测物的摩尔质量。
6. 分光光度法的误差来源有哪些？答：误差来源主要有两方面，一是所用仪器提供的单色光不纯，因为单色光不纯时，朗伯—比耳定律中吸光度和浓度之间的关系偏离线性；二是吸光物质本身的化学反应，其结果同样引起朗伯—比耳定律的偏离。
分光光度法
光度法的优点
与目视比色法相比，光度法的优点： 1. 用光电仪器进行测量可消除轻度色盲、眼睛 疲劳等主观误差。 2. 有其他物质共存时，可选适当的入射光和参 比溶液来消除干扰，提高选择性。 3. 对于大批试样分析，校正曲线可简化手续， 提高分析速度。
2.3.2.测量条件的选择(1)
（1）选择合适的入射光 由于溶液对光的吸收是有选择性的，因此 必须选择溶液吸收最大的波长作为入射光的波 长。 （2）控制适当的吸光度范围 用光度计测量吸光度，都存在着误差。当 测量小于0.2和大于0.7吸光度时，误差会迅速 增加。为了使测量误差落在0.2～0.7之间，可 以控制试样的称取量。对于组分含量高的试样， 可减少称取量，或是稀释;对于含量低的溶液 可增加称样量或浓缩的方法来提高浓度。
图2－8 721分光光度计的光学系统
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（三）
图2－9 7530G紫外—可见光分光光度计
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（四）
图2－10 7530G紫外-可见分光光度计光学系统
检测器和读数装置 （2）
2. 光电管. 是一个二极真空管由一个阳极和一个光敏阴 极组成。 3. 光电倍增管。 是利用光敏阴极把光信号放大的装置。 4. 读数装置。 读数装置常用的是微安计或检流计。
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（一）
图2－7 721分光光度计
几种类型的分光光度计（ 几种类型的分光光度计（二）
2.分光光度法 2.分光光度法
光度可用光电比色计或分光光度计进 行测量。 测定时常用的是校正曲线法或比较法。
（1）校正曲线法
校正曲线法，又称工作曲线或标准曲线法。 当溶液厚度b固定时，吸光度A与溶液浓度c成 正比.取一系列不同浓度标准溶液（5－7图）， 分别测定其吸光度，以浓度c为横坐标，吸光 度为纵坐标，作校正曲线.试液用同样条件显 色，测定吸光度，从曲线上求得试液浓度。
第二十章 比色法和分光光度法
3、朗伯-比尔定律
4、透光度（透射比） 5、吸光系数（吸收系数） 6、摩尔吸收系数
书P398： 例题20-1
二、吸光度的加和性 测得溶液的吸光度等于各组分的吸光度之 和。 A总 = ∑ Ai ＝κ1 b c1 + κ2 b c2 + …… κn b cn
三、朗伯-比尔定律的偏离 1、比尔定律的局限性 2、非单色入射光引起的偏离
4、颜色的产生：物质对不同波长的光具有选
择性吸收作用而产生了不同颜色。
5、光吸收曲线 6、吸收峰：光吸收程度最大处对应的波长。
7、物质定性分析的依据：不同物质的溶液，
其最大吸收波长不同。
20.2 光吸收的基本定律
一、朗伯-比尔定 1、朗伯定律 朗伯(Lambert) 1760年阐明了光的吸收程 度和吸收层厚度的关系。 A∝b 2、比尔定律 1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度 和吸收物浓度之间也具有类似的关系。 A∝ c
一、光度分析法的特点 1、灵敏度高 2、准确度能满足微量组分测定的要求 3、操作简便快速，仪器设备简单
二、物质对光的选择性吸收
1、单色光：同一波长的光称为单色光。 2、复合光：由不同波长的光组成的光称为复
合光。如可见光。 3、互补色光：两种适当颜色的单色光按一定 强度比例混合可成为一种白光，这种两种单 色光称为互补色光。
A
λ1 A
λ2
λ
λ1
λ2
λ
Aλ1= kaλ1bCa ＋kbλ1bCb Aλ2= kaλ2bCa ＋kbλ2bCb
三、光度滴定 四、酸碱解离常数的测定 五、配合物组成的测定 1、饱和法 2、连续变化法
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第20章比色法和分光光度法
【20-1】将下列百分透光度值换算为吸光度：
（1）1% （2）10% （3）50% （4）75% （5）99%
解：A＝2－lg T%
（1）A=2－lg 1 = 2.000
（2）A=2－lg 10 = 1.000
（3）A=2－lg 50 = 0.301
（4）A=2－lg 75 = 0.125
（5）A=2－lg 99 = 0.0044
【20-2】将下列吸光度值换算为百分透光度：
（1）0.01 （2）0.10 （3）0.50 （4）1.00
解：lgT%=2－A
（1）lgT1%=2－0.01 = 1.99 T1%=97.7 %
（2）lgT2%=2－0.10 = 1.90 T2%=79.4 %
（3）lgT3%=2－0.50 = 1.50 T3%=31.6 %
（4）lgT4% =2－1.00 =1.00 T4%=10.0 %
【20-3】有一有色溶液，用1.0 cm 吸收池在527 nm 处测得其透光度T = 60%，如果浓度加倍，则（1）T值为多少？
（2）A 值为多少？
（3）用5.0 cm 吸收池时，要获得T = 60%，则溶液的浓度为原来浓度的多少倍？
解：A＝－lg T =εbc －lg 0.60 = 0.222
浓度增倍时：
（1）lg T =－0.444 T= 36 %
（2）A＝－lg T = 0.444
（3）1.0cm时：c1 = 0.222 5.0cm时：c2 = 0.222
c2/c1= 1.0 /5.0 = 0.2倍
【20-4】有两种不同浓度的KMnO4溶液，当液层厚度相同时，在527nm处透光度T分别为（1）65.0%，（2）41.8%。
求它们的吸光度A各为多少？若已知溶液（1）的浓度为6.51×10-4mol·L-1，求出溶液（2）的浓度为多少？
解：（1）A＝εbc =－lgT＝－lg 0.650 = 0.187
（2）A＝－lg 0.418 = 0.379
（3）当c1= 6.51×10-4 mol • L-1时，
b = 0.187∕6.51×10-4 = 287 mol -1 • L
c 2= 0.379∕287 = 1.32×10-3 mol • L -1
【20-5】在pH=3时，于655 nm 处测得偶氮胂Ⅲ与镧的紫蓝色配合物的摩尔吸光系数为4.50×104。
如果在25mL 容量瓶中有30g La 3+，用偶氮胂Ⅲ显色，用2.0cm 吸收池在655 nm 处测量，其吸光度应为多少？ 解：A =εbc
= (4.50×104×2.0×30×10-6)∕(138.9×0.025) = 0.78
【20-6】有一含有0.088 mgFe 3+的溶液用SCN -显色后，用水稀释到50.00 mL ，以1.0 cm 的吸收池在480 nm 处测得吸光度为0.740，计算Fe(SCN)2+配合物的摩尔吸光系数。
解：ε= A ∕bc
= (0.740×55.85×50.00)∕(1.0×0.088) = 2.35 × 104 cm -1 • mol -1 • L
【20-7】当光度计的透光度测量的读数误差△T = 0.01时，测得不同浓度的某吸光溶液的吸光度为 0.010，0.100，0.200，0.434，0.800，1.20。
利用吸光度与浓度成正比以及吸光度与透光度的关系，计算由仪器读数误差引起的浓度测量的相对误差。
解：T = 10－A lg T ＝－A
0.434 c T
c T lg T
= 当 A = 0.010 时, T = 10－0.010 ，lg T ＝－0.010 , 又△T = 0.01
c
c
= 0.434 ×0.01∕10－0.010×(－0.01 0 ) =－44.4 % 同理，当A = 0.100 、0.200、0.434、0.800、1.20时，
c
=－5.46% ,－3.44 %,－2.72 % ,－3.42 % ,－5.73% c c
【20-8】设有 X 和 Y 两种组分的混合物。
X 组分在波长1λ和2λ处的摩尔吸光系数分别为1.98 × 103 cm -1 • mol -1 • L 和2.80 × 104cm -1 • mol -1 • L 。
Y 组分在波长1λ和2λ处的摩尔吸光系数分别为2.04×104 cm -1• mol -1•L 和3.13×102cm -1•mol -1•L 。
液层厚度相同，在1λ处测得总吸光度为0.301，在2λ处为0.398。
求算X 和Y 两组分的浓度是多少？
解：A 1X ＝ε1X bc X 、A 1Y ＝ε1Y bc Y
A 1总＝ A 1X + A 1Y ＝ε1X bc X +ε1Y bc (1) 同理A 2总＝ A 2X + A 2Y ＝ε2X bc X +ε2Y bc (2)
由(1) c X ＝( A 1总－ε1Y bc Y )∕ε1X b
代入(2) c Y ＝( ε1X A 2总－ε2X A 1总)∕( ε1X 2Y b －2X 1Y b ) 设 b ＝1.0 cm ，
c Y ＝( 1.98×103×0.398－2.80×104×0.301 )∕(1.98×103×3.13×102×1.0－2.80×104×2.04×104×1.0) = 1.34×10－
5 mol • L －
1
c X = ( 0.301－2.04×104×1.0×1.34×10－
5)∕(1.98×103×1.0)
= 1.40×10
－5
mol • L －
1
【20-9】某有色配合物的0.0010%水溶液在510nm 处，用2cm 吸收池测得透光度T 为0.420，已知510κ=2.5×103L·
mol -1·cm -1。
试求此有色配合物的摩尔质量。
解：A=-lgT=-lg0.42=0.376，
c=A/bε=0.376/（2.5×103×2）=7.52×10-5 mol/L
因此，1000mL 中含有色物7.52×10-5×Mg 。
已知含量为0.001%， 故1000/（7.52×10-5M ）=100/0.0010，M=131.5g/mol
【20-10】浓度为2.0×10-4mol·L -1的甲基橙，在不同pH 的缓冲溶液中，于520nm 波长处，用1cm 吸收池测得吸光度值。
计算甲基橙的p K a 值。
解：设甲基橙酸式组分和碱式组分在波长520nm 处的吸光度分别为A HL 和A L -，由已知数据
可知A HL =0.890，A L -=0.260。
所以： 311HL -41
0.890
=
4.4510L mol cm 1cm 2.010mol L
κ---=⨯⋅⋅⨯⨯⋅，
-311
-41
L 0.260= 1.3010L mol cm 2cm 10mol L
κ---=⨯⋅⋅⨯⋅ （1）用代数法求K a 。
根据HL L =
[H ]a A A A A K -
+
--计算不同pH 值时的K a 值：
pH=2.99时，K a =4.7×10-4；pH=3.41时，K a =4.5×10-4；pH=3.95时，K a =4.5×10-4。
取以上三个K a 的平均值，有K a =4.6×10-4，得到p K a =3.34。
（2）用图解法求K a ：
按已知条件A L -=0.260，A HL =0.890，计算相关数据，填入表中：
以pH 值为横坐标，L HL lg
A A
B A A
--=-为纵坐标绘图，如图所示。
直线与横坐标交点处对应的值（或与纵坐标交点处对应的值）即为p K a 。
从图中可得p K a =3.33，K a =4.7×10-4。