YB_1对乳腺癌MCF_7细胞C_省略_4表达和细胞侵袭及成球能力的影响_吴晓君 (1)

在 293A 细胞融合度为 80% 时，以腺病毒载体 与培养基体积 1 ∶ 10 的比例加入已构建好的病毒载 体，每天观察细胞状态，48 ～ 72 h 后，见细胞大片浮 起，收集细胞于 1. 5 ml EP 管中，加入 600 ～ 700 μl DMEM 完全培养基，重悬细胞，将 EP 管置于 － 70 ℃ 冰箱 15 min，取出置于 37 ℃ 培养箱中 30 min，反复 3 次后 1 000 r / min 离心取上清，－ 70 ℃ 保存备用。
DOI:10.13312/j.issn.1671-7783.2011.04.013
第 21 卷第 4 期 2011 年 7 月
江 苏 大 学 学 报（ 医 学 版） Journal of Jiangsu University（ Medicine Edition）
Vol． 21 No． 4 Jul． 2011
（ Central Laboratory，the Affiliated People's Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）
［Abstract］ Objective： To explore the effects of YB-1 on regulating CD44 and invasion ability and mammosphere formation of breast cancer cells MCF-7． Methods： YB-1 and its siRNA recombined adenovirus vectors were transfected into MCF-7 cell lines，and the expressions of YB-1 and CD44 were tested after the transfection by RT-PCR and Western blotting． Immunofluorescence was also used to confirm the CD44 protein expression changes． MTT was used to test the tumor cell proliferation and a cell growth curve was drawn afterward． Transwell chamber models were used to test the capabilities of cell invasion and migration． For evaluating the abilities of MCF-7 cell forming mammospheres after the transfection，a sphere growth test was applied by culturing cells in serum-free medium plus EGF （ 20 ng / ml） and bFGF （ 10 ng / ml） ． Result： According to the results of RT-PCR and Western blotting，the expressions of YB-1 and CD44 were enhanced after MCF-7 cells were transfected with YB-1 recombined adenovirus vectors，compared to the control groups． On the contrary，the expressions of YB-1 and CD44 were reduced by transfecting YB-1 siRNA recombined adenovirus vectors． The results of CD44 in immunofluorescence experiments indicated the same conclusion of RT-PCR and Western blotting． The cell proliferation curve showed that MCF-7 cells transfected with YB-1 recombined adenovirus vectors possessed the best growth abilities，and the cells transfected
Y-盒结合蛋白 1 （ Y-box binding protein-1，YB1） 是 Y 盒蛋白家族的成员之一，广泛分布于原核和 真核生物中，调节多种生物学过程。近年来的研究 发现，YB-1 与人类恶性肿瘤的关系非常密切，在多 种恶性肿瘤组织中表达偏高，尤其在乳腺癌［1］和前 列腺癌［2］中。YB-1 的表达量随病情恶化而增加，表 明 YB-1 与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。目前 的研究结果表明 YB-1 与肿瘤细胞的增殖、耐药及 相关基因的转录调节相关，而关于 YB-1 与肿瘤细 胞的迁移、侵袭的研究较少，特别是 YB-1 如何影响 细胞的迁移与侵袭仍然未知。
1 材料和方法
1. 1 细胞株 人乳腺癌 MCF-7 细胞株，购自南京凯基生物有
限公司，293A 人胚肾细胞株购自中国科学院典型培 养物保藏委员会 细 胞 库，培 养 于 DMEM 完 全 培 养 基，其中含 10% 胎牛血清，2 mmol / L 谷氨酰胺，置于 37 ℃ ，5% CO2 恒温保湿培养箱内培养。 1. 2 试 剂
［基金项目］ 国家自然科学基金资助项目（ 39970832） ； 江苏省卫生厅重大课题资助项目（ K2005017） ［作者简介］ 吴晓君（ 1983—） ，女，硕士研究生； 许文林（ 通讯作者） ，教授，博士研究生导师，E-mail： wilma． gtkiller@ yahoo． cn
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江 苏 大 学 学 报（ 医学版）
Effect of YB-1 on the expression of CD44，invasion ability，and mammosphere formation in breast cancer cells MCF-7
WU Xiao-jun，XU Wen-lin，LENG Jia-yan，LONG Lu-lu，ZHU Xiao-lan， LI Hao，YAO Jun，XU Hong-mei，CHEN Qiao-yun，HUI Lu-lu
YB-1 对乳腺癌 MCF-7 细胞 CD44 表达 和细胞侵袭及成球能力的影响
吴晓君，许文林，冷加燕，龙璐璐，朱小兰，李皓， 姚俊，徐红美，陈巧云，惠璐璐
（ 江苏大学附属人民医院中心实验室，江苏 镇江 212002）
［摘 要］ 目的： 观察 Y-盒结合蛋白 1（ Y-box binding protein-1，YB-1） 对乳腺癌 MCF-7 细胞 CD44 表达及细胞迁移、 成球能力的影响。方法： 应用基因重组技术将 YB-1 基因及其 siRNA 构建于腺病毒载体 pADeasy-1，重组腺病毒及腺 病毒空载体转染乳腺癌细胞株 MCF-7； 通过蛋白质印迹法，RT-PCR 和免疫荧光的方法检测 YB-1 和 CD44 的表达； MTT 法检测转染后细胞生长速度，并绘制生长曲线； 并通过 Transwell 小室法检测细胞侵袭和迁移能力； 细胞使用无血 清培养基培养，并加入表皮生长因子（ EGF） 和碱性成纤维细胞生长因子（ bFGF） 后，观察 YB-1 对细胞成球能力的影 响。结果： 蛋白质印迹法和 RT-PCR 结果显示，转染 YB-1 重组腺病毒载体的 MCF-7 细胞中，YB-1 和 CD44 的表达明 显高于转染腺病毒空载体组和未转染组； 相反，转染 YB-1 siRNA 重组腺病毒载体的 MCF-7 细胞中，YB-1 和 CD44 表 达明显低于对照腺病毒空载体组和未转染组； 免疫荧光也证实 CD44 蛋白水平与 YB-1 表达正相关。细胞生长曲线表 明，转染 YB-1 重组腺病毒载体组的细胞生长速度最快，而且其侵袭、迁移和成球能力最强。结论： YB-1 可能通过调 控 CD44 的表达影响人乳腺癌细胞 MCF-7 的侵袭及成球能力。 ［关键词］ YB-1； CD44； 乳腺癌； MCF-7 细胞株； 侵袭； 肿瘤成球能力 ［中图分类号］ R73 － 35 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1671 － 7783（2011）04 － 0313 － 06
胎牛血清和 DMEM 高糖培养基购自 Gibco 公 司，兔抗人 β-肌动蛋白多克隆抗体购自 Santa Cruz 公司 （ 美 国 ） ，兔 抗 人 YB-1 多 克 隆 抗 体，兔 抗 人 CD44 单克隆抗体购自 Abcam 公司，表皮生长因子 （ EGF） ，碱 性 成 纤 维 细 胞 生 长 因 子 （ bFGF ） 购 自 Ebioscience 公司（ 美国） ，山羊抗兔 CY3 多克隆抗体 购自北京 康 为 世 纪 生 物 科 技 有 限 公 司，山 羊 抗 兔
HRP 多克隆抗 体，MTT 购 自 碧 云 天 生 物 技 术 研 究 所，Trizol 试 剂 购 自 Invitrogen 公 司 （ 美 国） ，MMLV 逆转录酶、Taq DNA 聚 合 酶 及 其 缓 冲 体 系、dNTP、 RNA 逆转录 酶 及 随 机 引 物 均 购 自 Femnentas 公 司 （ 美国） 。YB-1 及其 siRNA 重组腺病毒载体由本实 验室构建。重组 YB-1 载体为 pAdEasy-1-hYB1 （ 简 称 Ad-YB-1 ） ，对 照 载 体 为 pAdEasy-1-hGFP （ 简 称 Ad-GFP） ，重组 siRNA 载体为 pAdEasy-1-pshuttleH1siYB1（ 简 称 AdSi-YB-1 ） ，对 照 载 体 为 pAdEasy-1pshuttleH1-HK（ 简称 AdSi-对照） 。 1. 3 YB-1 及其 siRNA 重组腺病毒载体转染和扩增
CD44 是一种细胞表面黏附分子，与相关配体结 合后，参与 细 胞 黏 附、迁 移、侵 袭 等 过 程 的 调 节［3］。 有研究报道，YB-1 能与编码 CD44 的基因的上游调 控区域结合［4］。因而，为了进一步研究 YB-1 影响 乳腺癌 MCF-7 迁移及侵袭能力的作用机制，本研究 构建了 YB-1 及 其 siRNA 重 组 腺 病 毒 载 体，转 染 MCF-7 细胞后，观察 YB-1 对 CD44 分子的影响，及 其对细胞迁移、侵袭与成球能力的影响，探讨其可能 的作用机制，为B-1 siRNA recombined adenovirus vectors，as expected，showed the lowest growth speed among all groups． MCF-7 cells introduced with YB-1 recombined adenovirus vectors also had the strongest invasion， migration，and mammosphere formation abilities，while the cells transfected with YB-1 siRNA recombined adenovirus vectors were opposite． Conclusion： High expression of YB-1 might potentially enhance the expression of tumor stem cell gene CD44，in addition，to increase the invasion and mammosphere formation in breast tumor cells． ［Key words］ Y-box binding protein-1； CD44； MCF-7 cell strain； invasion； mammosphere formation