蛋白质的特性和分离纯化
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它在细胞内发挥着重要的功能。
由于蛋白质的复杂性和多样性，研究人员通常需要从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质。
蛋白质的分离纯化是生物化学和生物技术领域中非常重要的一项工作，它为我们深入研究蛋白质的结构和功能提供了必要的条件。
蛋白质的分离纯化可以通过多种不同的方法实现，这些方法包括离心法、凝胶过滤法、电泳法、层析法等。
在选择合适的方法时，研究人员需要考虑到蛋白质的特性以及实验的要求。
离心法是最常用的分离方法之一，在离心过程中，通过调整离心力和离心时间，可以实现不同密度的蛋白质的分层。
这种方法适用于分离大分子量的蛋白质。
凝胶过滤法是利用孔径不同的凝胶将蛋白质分离开来。
通常使用的凝胶有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，这些凝胶具有不同的孔径，可以根据蛋白质的分子量选择合适的凝胶进行分离。
电泳法是基于蛋白质的电荷和分子量差异而进行分离的方法。
最常用的电泳方法是SDS-PAGE电泳，通过使用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行解性和蛋白质间的形成复合物，使得蛋白质在电泳过程中仅仅受到电场力的影响，从而实现蛋白质的分离。
层析法是一种利用物质在载体上的分配和吸附性质进行分离的方法。
常见的层析方法有凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等。
凝胶层析是通过利用载体颗粒的孔径进行分离，亲和层析是将特定配体固定在载体上，与目标蛋白质结合，从而实现分离，而离子交换层析是利用载体表面电荷与目标蛋白质的电荷相互作用进行分离。
在进行蛋白质的分离纯化时，需要注意以下几个关键步骤。
首先是样品制备，通常样品要经过细胞破碎、蛋白质提取等步骤，使得目标蛋白质从复杂的混合物中提取出来。
其次是样品的处理，包括去除杂质、调整蛋白质的溶液环境等。
然后是选择合适的分离方法，根据蛋白质的特性和实验要求来确定最适合的方法。
最后是纯化过程中的监测和分析，通过使用各种蛋白质分析方法，如SDS-PAGE、Western blot等，来确定目标蛋白质的纯化程度和鉴定其存在。
蛋白质的理化性质与分离纯化
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
酸碱性质
分子量
胶体性质 紫外吸收 变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
RT Mr = lim π c→0 c
蛋白质的分子量
化学组成法 SDS-PAGE法 SDS-PAGE法 凝胶过滤法 渗透压法 沉降系数法和沉降平衡法
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质紫外吸收
大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 吸收，使得大多数蛋白质在280nm 附近 显示强的吸收。 显示强的吸收。 利用这个性质， 利用这个性质，可以对蛋白质进行定 性鉴定。 性鉴定。
酸碱性质 分子量 胶体性质
紫外吸收
变性作用 化学反应
分离纯化 分析鉴定
生物 化学
1 理化性质
(1) (2) (3) (4) (5) (6)
第四节 蛋白质的理化性质 及其分离纯化
蛋白质变性、 蛋白质变性、沉淀与凝固 蛋白质的变性作用(denaturation) 变性后的蛋白质由于疏水基团 某些物理或化学因素，： 某些物理或化学因素，破坏蛋白质的结构 变性蛋白质的性质改变： 变性蛋白质的性质改变 状态， 状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生 的暴露而易于沉淀， ，溶解度下降 物理性质：旋光性改变， ①的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白 ， 物理性质：旋光性改变 溶解度下降， 理活性丧失，称为蛋白质的变性。 理活性丧失，称为蛋白质的变性。 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 质不一定都是变性后的蛋白质。 质不一定都是变性后的蛋白质。 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 蛋白质变性的实质是次级键的断裂和重排， 化学性质：官能团反应性增加， ② 化学性质：官能团反应性增加，易被 有些变性蛋白质在一定条件下还 不涉及肽键的断裂。 不涉及肽键的断裂。 蛋白酶水解。 蛋白酶水解。 引起蛋白质变性的因素 。 可以复性，是可逆变性。 生物学性质：原有生物学活性丧失， ③可以复性，是可逆变性 生物学性质：原有生物学活性丧失， 物理因素： ① 物理因素：高温、高压、紫外线、电离 抗原性改变。 抗原性改变。 高温、高压、紫外线、 加热使蛋白质变性并凝聚成块状 辐射、超声波、机械剪切等； 辐射、超声波、机械剪切等； 称为凝固。因此， 强碱、有机溶剂 化学因素：强酸、 ② 称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质 、重 化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、 金属盐等。 金属盐等。 一定发生变性。 一定发生变性。
蛋白质的分离纯化和表征
蛋白质的分离纯化和表征
第21页
2. 盐析 在蛋白质水溶液中，加入大量高浓度强
电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等， 可破坏蛋质分子表面水化层，中和它们电 荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称 为盐析。
而低浓度盐溶液加入蛋白质溶液中，会 造成蛋白质溶解度增加，该现象称为盐溶。
盐析机理：破坏蛋白质水化膜，中和表面 净电荷。
灵敏度高，能检测1微克蛋白，重复性好。
蛋白质的分离纯化和表征
第48页
蛋白质纯度判定
各种层析单峰，电泳单带，双向电泳单点， 末端氨基酸测定一个，溶解度曲线单转折。
蛋白质的分离纯化和表征
第49页
盐溶盐溶—盐析
• 等电点沉淀蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀 溶解—盐溶
• 原因？
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少
许盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶
于水中 蛋白质的分离纯化和表征
第9页
盐析 盐析（（NH4）2SO4）
• 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质 会沉淀析出
• 原因？
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
蛋白质的分离纯化和表征
第46页
蛋白质含量测定Ⅱ
3．Folin-酚法（Lowry法） 蛋白质中酪氨酸或半胱氨酸，能与Folin-酚试
剂起氧化还原反应，生成蓝色化合物，500nm比 色测定。
Folin-酚试剂配制比较复杂。 4．BCA法
蛋白质还原Cu2 +成Cu+，与4,4’-二羧基-2,2’-二 喹啉（BCA）形成配合物，显紫色，比色测定。
到达最高值。
蛋白质的分离纯化和表征
第13页
三、蛋白质分离纯化普通标准
总目标：增加制品纯度或比活 1.前处理：因动/植物/细菌而异 2.粗分级分离：采取盐析/等电点沉淀/有 机溶剂分级分离等方法 3.细分级分离：采取凝胶过滤、离子交换 层析、吸附层析以及亲和层析等 4.结晶
蛋白质的分离纯化(1)
白质的净电荷为零时的pH称等电点（pI）。
蛋白质等离子点： 没有其他盐类干扰时, 蛋白质质子供体基团解离出来
的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH称为等 离子点。
二、蛋白质的紫外吸收性质
蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外光，主要是由带 芳香环的氨基酸决定的。其在280nm处对紫外吸收能力 的强弱顺序为：
电
电
泳
泳
方
方
向
向
等电聚焦电泳
SDS-PAGE
双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映 出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。
所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等 电点相同而分子量不同的蛋白质分开。
5.层析聚焦(P310)
是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
(polyacrylaminde gel electrophoresis) 电泳
PAGE
样品浓缩成很薄的起始区带（0.1mm）
它以聚丙烯酰胺 凝胶为支持物，一般 制成凝胶柱或凝胶板 （不连续体系）。
浓缩胶 分离胶
凝胶的浓度（孔径大小）、 缓冲液组分和离子强度、 pH以及电场强度都是不同的
分离成单区带
依次洗脱收集后， 通过紫外吸收法测定吸 收峰。
这样大小不同的蛋白 质就被分离开来了。
（二）根据蛋白质溶解度不同的纯化方法
（蛋白质的胶体和沉淀性质）
主要方法： 1：等电点沉淀和PH值控制 2：蛋白质的盐溶和盐析 3：有机溶剂分级分离法 4：改变温度
1.等电点沉淀和PH值控制
即在不改变其它条件的情况下，PH处于等电点时的蛋白质 溶解度达到最低点。而位于等电点两侧的PH条件下蛋白质的溶
简述一般根据蛋白质的哪些性质分离、纯化蛋白质
离子交换层析 带正电的离子交换树 脂结合带负电的蛋白。
（四）利用选择性吸附的纯化 方法
疏水作用层析是根据蛋白质表面的疏 水性差别。
在疏水作用层析中，不是暴露的疏 水基团促进蛋白质与蛋白质之间的相互 作用，而是连接支持介质(如琼脂糖)上 的疏水基团与蛋白质表面上暴露的疏水 基团结合。
由于疏水作用层析要求盐析化合物 如硫酸铵的存在以促进蛋白质分子表面 的疏水区暴露。为使吸附达到最大，可
电泳法原理
2、离子交换层析法
蛋白质对离子交换剂的结合力取 决于彼此间相反电荷基团的静电吸引， 而这和溶液的pH有关，离子交换剂有阳 离子交换剂 （羧甲基纤维素 ）和阴离子 交换剂（二乙氨基乙基纤维素 ），当被 分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱 时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白 质被吸附在离子交换剂上，随后用改变 pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱 下来。
（2）pH值带净电荷越多，它的溶解度就越大。改 变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改 变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度 大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀 蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附 近。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱 而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致 蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋 白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用 偏碱性的提取液。
超滤技术的应用 有很好的前景，应引 起足够的重视。
2、密度梯度（区带）离心
蛋白质沉降不仅决定于它的大小，而且也 取决于它的密度。蛋白质颗粒在具有密度梯度 的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量 和密度小的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗 粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时， 即停止不前，前后各种蛋白质在离心管中被分 离成各自独立的区带。
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化方法蛋白质是细胞中的重要生物大分子，具有多样的结构和功能。
为了研究蛋白质的性质和功能，需要将蛋白质从混合样品中分离纯化出来。
蛋白质的分离纯化方法有很多种，主要包括离心法、电泳法、层析法和亲和纯化法等。
下面将逐一介绍这些方法及其原理。
1. 离心法离心法是利用离心机将混合物中的蛋白质分离出来。
首先将细胞裂解，得到细胞裂解液，然后进行离心，以将细胞器、胞外物质和亲粒子（如蛋白质颗粒）分离。
离心可以根据不同物质的相对密度和大小进行分层分离，快速旋转离心机可以很好地分离出不同密度的颗粒。
2. 电泳法电泳法是将带电的蛋白质沿着电场移动，根据蛋白质的带电性质和大小分离的方法。
蛋白质可以根据电荷性质分为阴离子蛋白和阳离子蛋白，也可以根据亲水性质分为亲水性蛋白和疏水性蛋白。
电泳法常用的有SDS-PAGE、等电聚焦电泳等。
其中，SDS-PAGE可以根据蛋白质的分子量进行分离。
3. 层析法层析法是通过蛋白质与载体之间的亲和性或者分离介质之间的亲和性进行分离的方法。
层析法主要分为凝胶层析、离子交换层析、亲合层析和大小排阻层析等。
凝胶层析法是利用凝胶的网格结构来分离蛋白质，如凝胶过滤层析、凝胶过渡层析等。
离子交换层析法是利用蛋白质对离子交换树脂的吸附性质进行分离。
亲合层析法是通过亲和柱中的配体与蛋白质的亲和作用进行分离。
大小排阻层析法是根据蛋白质的分子量和形状进行分离。
4. 亲和纯化法亲和纯化法是利用特定的亲合剂与目标蛋白质之间的特异性亲和性进行分离纯化的方法。
亲和纯化主要包括亲和柱层析法、浸没纯化法、亲和剂电泳法等。
亲和柱层析法是将具有亲和填料的柱子与样品接触，通过洗脱再生的操作，将目标蛋白质从其他组分中分离纯化出来。
浸没纯化法是将特定亲合剂浸泡在蛋白质混合物中，使其与目标蛋白质发生亲和结合，然后以特定条件洗脱目标蛋白质。
亲和剂电泳法是负载亲和剂的凝胶片上进行电泳，使蛋白质与亲和剂结合，再通过电泳将其分离纯化出来。
蛋白质的分离、纯化和鉴定
三、蛋白质的胶体性质与蛋பைடு நூலகம்质沉淀
蛋白质是亲水胶体。 1. 蛋白质是亲水胶体。 水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。 水化层与双电层使蛋白质成为稳定的亲水胶体。
球状的水溶性蛋白疏水基团借疏水作用聚合在分 子内部， 子内部，而亲水基团则分布于表面与周围水分子 结合形成水化层； 结合形成水化层； 水化层 同时蛋白质表面的可解离基团带有相同的净电荷， 同时蛋白质表面的可解离基团带有相同的净电荷， 与其周围的反离子构成稳定的双电层。 与其周围的反离子构成稳定的双电层。 双电层
影响盐析的因素有： 影响盐析的因素有： 温度 pH值 值 蛋白质浓度 常用的中性盐主要有硫酸铵， 常用的中性盐主要有硫酸铵，优点是温度系数小而溶 解度大 。
※ 有机溶剂沉淀反应
：用与水互溶的乙醇、丙酮等夺取 用与水互溶的乙醇、
水膜，降低介电常数，增加蛋白质之间的相互作用， 水膜，降低介电常数，增加蛋白质之间的相互作用，使 蛋白质颗粒凝集而沉淀。不同蛋白质所需溶剂浓度不同， 蛋白质颗粒凝集而沉淀。不同蛋白质所需溶剂浓度不同， 可进行分级沉淀，但易引起变性，与有机溶剂浓度、 可进行分级沉淀，但易引起变性，与有机溶剂浓度、作 用时间和沉淀温度有关。 用时间和沉淀温度有关。 例如：丙酮沉淀。使用丙酮沉淀时，必须在 ～ ℃ 例如：丙酮沉淀。使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温 下进行，丙酮用量一般 倍于蛋白质溶液体积 倍于蛋白质溶液体积。 下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质 被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外， 被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙 醇沉淀。 醇沉淀。
（2）不可逆沉淀
在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性， 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性， 而且也破坏了蛋白质的结构和性质， 而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可 能再重新溶解于水。 能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构 和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀、强酸碱沉淀、 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐 沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。 沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。
生物蛋白质的理化性质及分离分析
孔径大小
分子筛效应
电泳仪
水平电泳槽 垂直电泳槽
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
不连续：浓缩胶和分离胶
电泳迁移率决定于所带的净电荷以及分子 大小和形状等因素。
v：沉降速率（dx/dt）可以从实验测得。 ω：离心机转子每秒钟的角速度，以弧度/秒计。（即2Л
×转子每秒钟的转速） x：蛋白质界面中点与转子中心之间的距离（以cm计）。
Svedberg单位的定义：
• 单位引力场沉降分子下沉的速率。 • 取 1 ×10-13秒为一个Svedberg单位。 • 例： ①牛血清清蛋白的沉降常数为:4.4×10-13 用Svedberg单位则为: 4.4 S ②原核细胞核糖体的沉降常数为:70×10-13 用Svedberg单位则为: 70 S
蛋白质变性的应用
理论上：
研究蛋白质分子结构与功能,分子量测定,亚单位拆 分；
生产生活中有利的一面：
食品加工，消毒灭菌等； 非蛋白生物物质提取纯化，终止酶促反应；
生产生活中不利的一面：
活性蛋白制品（酶、抗体）的分离提取和保存；
四、蛋白质的沉淀作用
（precipitation of protein）
淀，加热后变成红色
六、蛋白质的颜色反应
7. 乙醛酸反应—色氨酸的特有反应
在蛋白质溶液中加入HCOCOOH，将浓 硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在 液面交界处，即有紫色环形成
色氨酸的反应（吲哚环的反应） 鉴定蛋白质中是否含有色氨酸 明胶中不含色氨酸
六、蛋白质的颜色反应
8Hale Waihona Puke 坂口反应—精氨酸特有的反应层析分离方法层析方法分离依据吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团活性基团对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起实现组分分离1吸附层析吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中的各组分分离的方法
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5、渗透压法和扩散法
两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成紫红色的复合物含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反应肽键的反应，肽键越多颜色越深
受蛋白质特异性影响小
蛋白质定量测定；测定蛋白质水解程度
双向电泳（2D电泳）
第一向电泳：等电聚焦电泳
第二向电泳：SDS-聚丙烯酰胺凝胶
电泳
蛋白质组（proteome）是指一个细胞、一种组织甚至是一种物种的全部蛋白质成分。
蛋白质组学（proteomics）就是研究某种细胞、某种组织或某种物种的全部蛋白质成分的含量、结构、功能和相互作用方式。
蛋白质组学的关键点是将全部蛋白质作为一个整体来研究。