流感病毒rt-pcr检测方法培训.ppt
流感病毒RNA荧光RT(PCR检测技术)-
流感病毒RNA荧光RT（PCR检测技术）-流感病毒核糖核酸荧光逆转录聚合酶链反应检测技术实时荧光定量聚合酶链反应是在常规聚合酶链反应基础上发展起来的定量聚合酶链反应技术。
通过在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累，对整个聚合酶链式反应过程进行实时监控。
最后，根据ct值和标准曲线对未知模板进行定量分析。
常用的实时荧光定量PCR可分为非特异性荧光标记的SYBR Green法、特异性荧光标记的TaqMan法和分子信标法。
1。
实时荧光定量聚合酶链反应原理:1。
SYBR Green方法:SYBR Green是一种双链DNA结合染料，在自由状态下不发光，当无意中掺入双链DNA时会发出荧光信号。
它的强度与双链DNA 的数量有关。
随着扩增产物数量的增加，检测到的荧光信号增加。
2，TaqMan方法:在扩增反应液中加入特异性探针，探针的5’端和3’端分别标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团，当探针完成时，两个基团的位置接近，5’端报告基团的荧光能量被3’端淬灭基团吸收，此时未检测到荧光信号，在扩增过程中，探针与模板结合形成5’→3’切除活性底物当Taq酶沿着模板向前延伸到探针连接处时，发生链置换。
Taq酶的5’→3’切除活性切割从探针上切割连接到探针5’端的报道基团。
5’末端报道基团的荧光能量与3’末端荧光淬灭基团的吸收分离，并且可以检测荧光信号。
在每个聚合酶链反应循环之后，荧光信号也有一个同步生长过程，就像扩增产物一样3.分子信标法:将探针设计成发夹形的茎环。
环的核苷酸序列与扩增产物的序列互补。
两端的核苷酸序列互补形成茎。
一端用报道基团标记，另一端用淬灭基团标记。
当探针不与模板结合时，报道基团和淬灭基团在空间上彼此靠近，报道基团的荧光能量被淬灭基团吸收。
此时，无法检测到荧光信号。
与模板结合后，探针的构象由发夹状变为链状，报道基团和淬灭基团分离，并呈荧光核酸检测是鉴定流感病毒基因组的一种强有力的方法，即使基因组含量很低或可以检测到死病毒。
荧光定量RT-PCR在检测流感病毒中的应用
此法 的 特 异 性 ， 提 取 后 的 新 甲 型 Ｈ． ． 分 别 与 季 节 性 将 Ｎ，
Ｈ】 、 ３ ２和 Ｈ Ｎ】Ｈ Ｎ Ｂ流 感病毒核酸 以 １ １比例进行 混合 ， ３ ： 对
个混合模板 进行检 测 ， 然后 对 以上 ４种流 感 病毒 的核 酸 按 １１ ： 比例人为混合 ， 行检 测。结果显示此 法特 异性 强， 进 每对
ｓ７ ５荧光 标 记 。 最 低 检 测 限 低 至 ２ ａ０ ０拷 贝／ 。 为 了测 试
量： 绝对定量是指用标 准 曲线 来确定标 本 的起始拷 贝数 ， 标
准品 一般 是 用 质 粒 Ｄ Ａ 或 是 Ｐ Ｒ 扩 增 产 物 等 制 备 的 ， 量 Ｎ Ｃ 其 根 据 ２０ｎ 的 吸 光 度 值 计 算 得 出ｋ ； 对 定 量 是 指 在 一 定 ６ ｍ ４ 相 ］
李文 悌 ，孙 菲 ，王晓春
中南大学湘雅医学院 医学检验系（ 沙 ４ ０ １ ） 湖南 国际旅行 卫生保健 中心 （ 长 １０ ３ ； 长沙 ４ ００ ） １０ ７ 流感病毒 （ｎ ｕ ｎａｖ ｕ ） 一 类具有 高度传 染性 的呼 ｉ ｅｚ ｉ ｓ 是 ｌ ｆ ｒ
吸道病毒 ， 线状 单股 负链 Ｒ Ａ病毒 ， 是 Ｎ 根据核 蛋 白和基 质蛋 白的抗原性 ， 流感病 毒可 以分 为 甲（ 、 Ｂ） 丙（ ） Ａ） 乙（ 、 Ｃ ３种 敏感度 ， 可以检 测到单拷 贝基 因， 区分微 小的拷 贝数差异” 。
３ １ 在 流感 病毒定型与亚型检测 中的应用 已有 多个研 究 ．
报道针对 Ａ或 Ｂ型流感病毒 的基 质蛋 白基 因 或膜蛋 白基 因 或者血凝 素基 因 等 的保 守序列 设计 引物 与探 针 ， 来 检测流感病毒 。赵丹 燕等 应用 一步法 荧光 定量 Ｒ Ｔ—Ｐ Ｒ Ｃ 技术 ， Ａ型选取基质蛋 白区， Ｂ型选择血凝 素基 因 区， 计 引 设 物与探针 ， 测敏 感性达 ０ ０ １ Ｃ Ｄ ０ 比常规 Ｒ 检 ．０ Ｔ Ｉ５ ， Ｔ—Ｐ Ｒ高 Ｃ
流感病毒实验室PCR检测技术课件
流感病毒实验室PCR检测技术课件流感病毒实验室PCR检测技术课件一、引言流感病毒是一种引起呼吸道传染病的病毒，每年都会在全球范围内流行。
为了及时诊断和治疗流感病毒感染，实验室PCR检测技术得到了广泛应用。
本文将详细介绍流感病毒实验室PCR检测技术的原理、操作步骤、优点以及实验结果的分析方法。
二、流感病毒的基础知识流感病毒是一种负链RNA病毒，分为A、B、C三种主要类型。
其中，A型病毒变异能力强，易引起大规模流行。
流感病毒的主要传播途径是飞沫和接触传播，症状包括发热、咳嗽、喉咙痛等。
三、PCR检测技术的原理、过程和优点PCR检测技术是一种通过体外扩增特定DNA片段的分子生物学技术。
在流感病毒检测中，PCR技术利用特定的引物和探针，通过高温变性、低温退火和适温延伸等步骤，扩增病毒的核酸片段。
该技术的优点包括高特异性、高灵敏度、操作简便、快速等。
四、实验步骤及注意事项1.采集样品：使用拭子采集咽拭子、鼻拭子等样品，迅速放入保存液中。
2.样品处理：将采集的样品进行裂解、提取核酸。
3.PCR反应：根据不同类型的流感病毒，设计特定的引物和探针，加入到PCR反应液中。
4.扩增和检测：通过实时荧光PCR技术，监测核酸扩增过程，判断病毒是否存在。
5.注意事项：确保实验室安全，避免交叉感染；严格遵循实验操作规程；注意样品处理和PCR反应的条件。
五、实验结果及分析PCR实验结果以Ct值的形式呈现，Ct值较低表示病毒核酸含量较高。
根据Ct值大小，可以判断病毒载量。
同时，根据不同类型流感病毒的特异性引物和探针，可以判断病毒的种类。
结合临床症状和实验室结果，可以对流感病毒感染进行诊断和治疗。
六、结论实验室PCR检测技术是一种快速、特异、灵敏的流感病毒检测方法。
通过采集患者呼吸道样品，利用PCR技术扩增病毒核酸片段，可以及时诊断流感病毒感染，为临床提供重要参考。
此外，该技术还可以监测病毒载量，评估治疗效果，为制定抗病毒治疗方案提供依据。
流感病毒实验室PCR检测技术课件
根据流感病毒基因组的特点，设计特 异性引物，用于扩增病毒基因片段。
引物选择
选择高特异性、高灵敏度的引物，确 保PCR检测的准确性。
反应体系与反应条件
反应体系
根据所选引物和试剂盒的要求，建立适当的PCR反应体系。
反应条件
设置PCR反应的温度循环条件，包增数百万至数十 亿倍的DNA片段。
应用广泛
在遗传病诊断、基因克隆、流 行病学调查等领域广泛应用。
03
流感病毒的PCR检测方法
样本采集和处理
样本采集
采集疑似流感病毒感染者的咽拭 子、鼻拭子或支气管灌洗液等样 本。
样本处理
将采集的样本进行灭活处理，以 去除病毒活性，同时提取病毒核 酸。
引物设计与选择
产物检测
采用凝胶电泳或荧光定量PCR等方法检测扩增产物。
结果分析
对扩增产物进行分析，判断是否存在流感病毒核酸，并对其序列进行比对，以 确定病毒的亚型。
04
实验操作注意事项
实验前的准备事项
01
02
03
实验人员资质
确保实验人员具备PCR检 测技术资质，熟悉实验操 作流程和注意事项。
实验器材准备
根据实验需求，准备足够 的PCR仪、扩增管、吸头 、缓冲液等实验器材，确 保其性能良好。
流感病毒实验室PCR检测技 术课件
汇报人：
202X-12-25
• 流感病毒概述 • PCR技术原理 • 流感病毒的PCR检测方法 • 实验操作注意事项 • 实验结果解读与报告
01
流感病毒概述
流感病毒的特性
流感病毒属于正粘病毒科，是一种有 包膜的RNA病毒。
根据核蛋白和基质蛋白的不同，流感 病毒可分为A、B、C三型，其中A型 流感病毒经常发生变异，是引起大流 行的主要病毒。
流感病例采样培训课件
• 刺突：流感病毒的包膜上镶嵌有两种刺突， 即血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA），均 以疏水末端插入到脂质双层中。血凝素的 数量较神经氨酸酶多，大约为4∶1~5∶1。
• 血凝素（HA）：呈三棱柱形，糖蛋白成分， 占病毒蛋白的25%。HA为三聚体，每条单 体前体（HA0）由HA1和HA2通过精氨酸及 二硫键连接而成，当精氨酸被细胞蛋白酶 裂解而形成仅由二硫键连接的HA1和HA2时， 病毒才有感染性。
• 标本采集和检测 • 1、标本采集：按照本指南的应急监测方案（附件2）要求，采集相关标本进
行检测。具体标本采集类型、方法参见《全国流感/人禽流感监测实施方案》 的“流感监测实验技术操作规范”。 • 2、标本检测：标本检测方法和流程参见附件3《人甲型H1N1流感病例标本 采集和实验室检测指南（暂行）》。 • 3、生物安全要求：甲型H1N1流感病毒培养应在具有资质的BSL-3实验室中进 行，标本储存、包装和运送应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》 （国务院424号令）和《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样 本运输管理规定》（中华人民共和国卫生部第45号令）等有关规定执行。
• 1、早期皮肌炎患者，还往往伴 有全身不适症状，如-全身肌肉酸 痛，软弱无力，上楼梯时感觉两 腿费力；举手梳理头发时，举高 手臂很吃力；抬头转头缓慢而费 力。
鸡胚尿囊腔、羊膜腔接种
24
四、临床标本的采集
• 1、 鼻拭子：将带有聚丙烯纤维头的拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留 片刻后缓慢转动退出。以另一拭子拭另侧鼻孔。将拭子头浸入采样液中， 尾部弃去。 2、 咽拭子：用带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁， 同样将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。 注：亦可将鼻、咽拭子收集于 同一采样管中，以便提高分离率，减少工作量。 3、鼻咽抽取物：用与负压泵相连的收集器从鼻咽部抽取粘液。先将收集 器头部插入鼻腔，接通负压，旋转收集器头部并缓慢退出。收集抽取的 粘液，并用采样液5ml涮洗收集器3次。
流感病毒实验室检测 PPT
鸡胚分离方法-试剂准备
鸡胚分离方法-标记鸡胚
鸡胚分离方法
■ 接种病毒方法
◆ 单腔接种
盲种
◆双腔接种
灯下接种
开窗接种
鸡胚分离流程（1）
◆将标记好的鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，通常每个样 本接种3个鸡胚
◆用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10x6mm 窗口 ◆用注射器吸200µl处理过的临床标本，装上16 号针头 ◆从窗口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让 液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯下即 可清楚 的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺入胚胎的 鄂下胸前， 用针头轻轻拨动下颚及腿，当进入羊膜腔时，能看到鸡胚 随着针头的拨动而动，即可注射100µl标本。将针头退出至 ½ 寸，将另外100 µl标本 注入鸡胚尿囊腔
咽拭子采集
• 咽拭子
•
用灭菌棉签（最好用聚丙烯纤维头的
塑料杆拭子）擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，
将棉签头部浸入含3-4ml采集液的管中，尾
部弃去，旋紧管盖。
• 标本采集后应在4℃条件下，尽快（哨点监 测48小时疫情24小时内）运送至流感监测网 络实验室
• 未能送至实验室的，应置-70℃或以下保存， 一周内送实验室
标本的接收
• 接收标本时必须核对送检表 • 流感监测网络实验室的工作人员接到标本
后，24小时内将“流感/人禽流感监测病例 标本原始登记送检表”（表2）录入到“监 测信息系统”
标本的处理
• 标本送至实验室后，立即进行处理，未加 抗菌素的加入适量的抗菌素。
• 将原始标本一分为三份，一份（1ml）用于
MDCK细胞病毒分离
CPE出现时间与感染病毒的型别、毒株的差 异、感染量的大小和MDCK细胞的敏感性 有关
流感病毒实验室PCR检测技术课件
用免疫荧光、快速抗原检测（快诊）等技术进行病理
诊断, 并且在有可能的情况下进行耐药性检测。
13
禽流感(H5N1)病毒的检测方法
抗原检测
•IFA •ELISA •胶体金
诊断快速； 特异度高； 灵敏度低；
核酸检测 •PCR •MDD •NASBA
抗体检测 •HI •MN •SRH
诊断快速； 特异度高； 灵敏度高； 得不到病毒；
10
临床标本运送、接收和保存
根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务 院424号令）的有关规定, 人禽流感标本应当由不少于 两人的专人护送, 并采取相应的防护措施, 不得通过公 共电（汽）车和城市铁路运输。
标本接受不少于两人, 做好记录, 办理相关接受手续。 标本保存应设立专库或专柜单独保存
血清: 采集5-10ml全血放入带垫圈的螺口管中，不
加抗凝剂，待血液凝固分离血清，-20℃保 存，血凝块灭菌处理后弃掉； 采集时间: 入院后24小时；14-28天或出院当 日。
4
采样液的要求
▪ 标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存 ▪ 采样液应包含有一定量的蛋白质和抗菌素 ▪ 最佳采样液: Hank’s液，Eagel’s液,生理盐水 ▪ BD15ML采样管 ▪ 拭子是聚脂纤维杆可折断，不推荐棉拭和木杆
流感病毒实验室PCR检测技术
1
标本采集
▪ 应遵循标准的流感检测方案 ▪ 应采集鼻拭子和/或咽拭子, 和/或依据标准
操作来进行采集。对标本采集者应采取 ▪ 适当的防护。 ▪ 对于标本的处理、储存和运输应遵照流感
病毒A H5N1的操作指南来进行。
2
标本采集（一）
▪ 主要采集上呼吸道标本 ▪ 鼻咽拭子: 将棉签平行于上颚插入鼻孔，保持几
RT-PCR检测方法
RT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程（一）RNA提取1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。
2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。
3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。
4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。
取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。
5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。
6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15 s。
7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE 液，12000rpm，离心15s。
8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE 液，13000~14000rpm，离心2min。
9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30 ~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。
10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。
（二）反应体系配制1、实验设计：检测标本RNA阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。
）阳性对照：已知病毒RNA2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液）1）按下表加入试剂：PCR反应体系对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。
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correct
例子
wrong
标本采集方法—鼻拭子
将1根聚丙烯纤维头的 塑料杆拭子轻轻插入 鼻道内鼻腭处，停留 片刻后缓慢转动退出。 取另一根聚丙烯纤维 头的塑料杆拭子以同 样的方法采集另一侧 鼻孔。上述两根拭子 浸入同一含3ml采样 液的管中，尾部弃去， 旋紧管盖。
3. 鼻咽吸取液的收集
1. 将吸液管与真空泵相连 2. 将软管与上腭平行插入鼻孔 3. 使用真空泵 4. 缓慢的移出同时轻轻旋转 5. 使用同一个管子采集另一鼻孔的液体 6. 收集的液体用3ml VTM 冲洗出，放入
采样管中
标记样品
被采样者的信息 样品采集的日期 样品采集的部位 样本编号 采集单位
个人防护设备（PPE）
口罩 (N-95 or N/P/R-100) 手套 帽子 鞋套 防护服 (gown or apron)
如何采集样本
1.咽拭子
容易操作
请病人尽量把嘴张开
当拭子触及咽后壁时病人不要往后 躲，应该抵住
病毒采样盒
咽拭子
标本采集方法—咽拭子
干采 用2根聚丙烯纤维头的
其它样品管 冰袋 PPE 防水的Marker笔,
用于标本的标记
病毒运输液 (VTM)
用于咽拭和鼻拭的VTM:
MEM、EMEM、DMEM PH 7.4-7.6 Hank’s
庆大霉素 (终浓度为1mg/ml) 两性霉素B (终浓度为2μ g/ml)
在无菌的带螺旋塑料管分装2-3ml VTM。最好储存在:–20℃,4℃可放 48–96h,室温1–2天。
标本的采集时限
症状出现后尽早采集 尽量在抗病毒药物使用前采集 即使症状出现1周后也要采集 可能的情况下多天多次采集
标本的采集方法
1. 准备采集物品包 2. 如何采集标本
采集物品包
装好VTM的样品采集管 聚酯纤维拭子 痰或粘液吸取管 压舌板 采样杯或平皿 吸管
A类之外，仅具有一般危险性，引起感染的机 会较少的感染性物质为B类(联合国编号 UN3373),采用PI650包装要求。
感染性物质运输的包装系统
三层包装系统： 内层容器， 中层包装 外层包装。
基本包装
内层容器(装有 样本)
中层包装(含吸 水性材料)
外层包装
内层容器
标记 合适的材料 封口 防漏防渗 裹以软垫或分隔多
个内层容器，防止 碰撞破碎
中层包装
包含 裹有软垫的内
层容器 吸水性材料
防漏防渗
外层包装
放入中层容器 内容物名细单 封箱
标识
Category A
INFECTIOUS SUBSTANCE
In case of damage or leakage Immediately notify Public Health authority
呼吸道标本采集、运送及保存
北京市CDC传地所
石伟先
2009年9月21日
标本采集
采集时间----何时采 采集种类----采什么 采集方法----怎么采
标本的种类
首选标本 上呼吸道标本
咽后壁拭子பைடு நூலகம்鼻咽拭子
下呼吸道标本: 气管吸取液或肺泡灌洗液
血样: 血清(急性期和恢复期血清)。
疑似人感染甲型H1N1流感感染病例列为A类， 用UN2814包装运输
—《甲型H1N1流感监测方案》附录3 《甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案》 2009年5月11日
IATA对感染性物质的运输分类
A类指人感染后发病的可能性大，传染性强， 对人群危害性大的烈性感染性物质。高度怀 疑具有严重危害性的感染性物质也属于A类。 A类感染性物质感染性物质[联合国编号 UN2814 和 UN2900( 只 导 致 动 物 致 病 )] 采 用 PI602包装要求。
流感样品的运输
采集的标本若不能在24小时内送达，则 应尽快在－70℃以下保存。无－70℃ 条件的需在－20℃冰箱短时间暂存， 并尽快联系递送标本。标本需由专人 运送，不得邮寄，最好使用专 车。
谢谢!
如何保存样品
VTM中保存的样品
尽快运到实验室
48小时内可以检测的可以保存在4℃，超过48小 时-70℃冻存。流感病毒在-20℃～-40℃时不稳 定，故长期保存应在-70℃温度以下，不要冻存 于-20℃，会降低流感病毒的检出率。
避免反复冻融 冰上一周也比冻融一次要好
标本的包装和运输