PCR技术在转基因水稻检测中的应用
PCR技术在转基因水稻检测中的应用
仲恺农业工程学院生命科学学院
摘要：采用PCR技术检测启动子、终止子、Bt基因，判断水稻样品中是否含转基因成分，建立了稳定快速的转基因水稻定性PCR检测体系。
结果表明：PCR技术检测外源基因是灵敏和准确的，可以广泛地应用到转基因作物及其加工产品的转基因成分检测中。
此外，进一步讨论了转基因成分检测中存在的问题、转基因产品标识的必要性和目前转基因检测技术在检测中的问题。
针对转基因检测的方法有很多种，其中PCR以其快速、准确、重复性好等特点已成为转基因检测中的主流方法。
在PCR检测过程中，DNA模板的制备是保证PCR检测结果准确与否的重要因素之一。
关键词：水稻转基因 PCR检测内源检测
水稻是世界上最主要的粮食作物之一，在我国种植面积居第１位。
随着转基因技术的发展，转基因水稻改良已成全球的目标。
从1996-2000年，转基因作物种植面积累计达到近10亿hｍ２。
２010年国家农业部批准第一个转基因水稻可以商品化生产，表明我国的水稻转基因研究及产业化进程正在提速。
水稻转基因检测作为转基因研究体系中的重要环节，其重要性日益凸显。
目前，针对转基因检测的方法有很多种，其中PCR以其快速、准确、重复性好等特点已成为转基因检测中的主流方法。
在PCR检测过程中，DNA模板的制备是保证PCR检测结果准确与否的重要因素之一。
1.材料与方法
1.1 材料
1种转基因水稻、中花作为非转基因对照样本。
试剂：DNA抽提液；10×TBE；Loading Buffer；Hpt 引物。
1.2实验方法
1.2.1DNA的提取及检测
①取0.1g的种子在液氮中低温下迅速研磨成粉末，置于2mL离心管中加入1.8mL抽提液，65℃水浴30min-1h，水浴过程中温和翻转混均几次，12000rpm离心10分钟。
②将上清移至2mL离心管中，加入2/3体积的氯仿，去除苯酚，混均后离心，
12000rpm 10分钟。
③将上清移至2mL离心管中，混匀后加入2倍体积冷乙醇，轻轻混均并静止一段时间后12000rpm离心 10分钟。
④用0.5ml 70%乙醇洗2次，风燥。
⑤加入20 ul ddH
O溶解备用。
2
⑥0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.2.PCR反应体系
反应体系总体积为25μＬ，其中，正反向引物各1μl，Taq mixture 12.5ul，DNA 模版1ul，去离子水补充至２５μＬ。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45ｓ，35个循环；72℃再延伸10min。
1.2.3. PCR产物检测
每份扩增产物取10ul进行浓度为1.3%的琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像系统进行.
2 结果与分析
2.1实验结果
图1 水稻基因提取电泳结果图2 PCR产物电泳结果图
2.2分析
3、讨论与结论。
PCR技术在植物检疫性病害鉴定中的应用
1、样品采集：选择具有典型症状的病害样本进行采集，并做好记录。
2、DNA提取：将采集的病害样本进行处理，去除蛋白质等杂质，提取出其中 的DNA。
3、引物设计：根据已知的病害基因序列，设计出特异性的引物。
4、PCR扩增：将DNA模板、引物、dNTP等反应液加入PCR反应管中，进行PCR 扩增。
5、产物检测：对PCR扩增后的产物进行电泳分析或荧光检测，观察是否有特 异性条带或荧光信号。
3、植物生物安全监测：qPCR技术可以用于植物生物安全监测，如监测外来 入侵植物的扩散情况和评估植物种质资源的遗传多样性。
然而，qPCR技术在植物检疫中的应用也存在一些不足，如对设备要求较高、 对实验条件和操作技能的要求严格，以及可能出现的假阳性和假阴性结果等问题。 因此，需要进一步改进和完善qPCR技术，以提高其准确性和可靠性。
PCR技术在植物检疫性病害鉴定中 的应用
目录
01
一、PCR技术在植物 检疫性病害鉴定中的 应用前沿研究
03 四、PCR技术在植物 检疫性病害鉴定中的 应用案例及评价
二、PCR技术在植物
02 检疫性病害鉴定中的 原理和流程
04 参考内容
植物检疫性病害是指对农业生产和植物生态环境造成严重危害的植物病害， 其鉴定与防治对保障农业生产和生态安全具有重要意义。近年来，随着分子生物 学技术的迅速发展，聚合酶链式反应（PCR）技术在植物检疫性病害鉴定中得到 了广泛应用。本次演示将从PCR技术在植物检疫性病害鉴定中的应用前沿研究、 原理和流程、实验方法和结果分析以及应用案例及评价等方面进物检疫中的应用实践
1、植物病原物检测：qPCR技术可以快速、准确地检测植物病原物，如病毒、 细菌、真菌等。例如，针对水稻矮缩病毒的qPCR检测方法，可以实现对病毒的特 异性识别和定量检测。
利用qPCR法检测OsPIMT1转基因水稻中的外源片段拷贝数
利用qPCR法检测OsPIMT1转基因水稻中的外源片段拷贝数魏毅东;罗曦;吴方喜;林悦龙;何炜;连玲;谢华安;张建福【摘要】水稻转化过程中,多个拷贝数整合到基因组中影响遗传稳定性和基因表达.传统的Southern杂交检测法鉴定费时费力,不适合目前高通量和自动化的检测要求.因此研究通过比较定量除草剂草铵膦抗性基因(bar)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH2,建立了基于实时荧光定量PCR的拷贝数检测法.利用此体系对9个独立的异天冬氨酸甲基转移酶OsPIMT1转基因T0代植株进行了荧光定量分析,其中6个为单拷贝,3个为双拷贝,经过Southern杂交和分离比分析验证,表明该方法能够快速,准确的鉴定水稻含有草铵膦抗性基因的水稻转基因植株.【期刊名称】《福建稻麦科技》【年(卷),期】2017(035)004【总页数】4页(P39-42)【关键词】水稻;转基因;草铵膦抗性基因(bar);甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH2;实时定量PCR;拷贝数【作者】魏毅东;罗曦;吴方喜;林悦龙;何炜;连玲;谢华安;张建福【作者单位】福建省农业科学院水稻研究所,福建福州350019;农业部华南杂交水稻种质创新与分子育种重点实验室/福州(国家)水稻改良分中心/福建省作物种质创新与分子育种省部共建国家重点实验室培育基地/杂交水稻国家重点实验室华南研究基地/福建省作物分子育种工程实验室/福建省水稻分子育种重点实验室,福建福种质创新与分子育种重点实验室/福州(国家)水稻改良分中心/福建省作物种质创新与分子育种省部共建国家重点实验室培育基地/杂交水稻国家重点实验室华南研究基地/福建省作物分子育种工程实验室/福建省水稻分子育种重点实验室,福建福州350003;福建省农业科学院水稻研究所,福建福州350019;农业部华南杂交水稻种质创新与分子育种重点实验室/福州(国家)水稻改良分中心/福建省作物种质创新与分子育种省部共建国家重点实验室培育基地/杂交水稻国家重点实验室华南研究基地/福建省作物分子育种工程实验室/福建省水稻分子育种重点实验室,福建福州350003;福建省农业科学院水稻研究所,福建福州350019;农业部华南杂交水稻种质创新与分子育种重点实验室/福州(国家)水稻改良分中心/福建省作物种质创新与分子育种省部共建国家重点实验室培育基地/杂交水稻国家重点实验室华南研究基地/福建省作物分子育种工程实验室/福建省水稻分子育种重点实验室,福建福州350003;福建省农业科学院水稻研究所,福建福州350019;农业部华南杂交水稻种质创新与分子育种重点实验室/福州(国家)水稻改良分中心/福建省作物种质创新与分子育种省部共建国家重点实验室培育基地/杂交水稻国家重点实验室华南研究基地/福建省作物分子育种工程实验室/福建省水稻分子育种重点实验室,福建福州350003;福建省农业科学院水稻研究所,福建福州350019;农业部华南杂交水稻种质创新与分子育种重点实验室/福州(国家)水稻改良分中心/福建省作物种质创新与分子育种省部共建国家重点实验室培育基地/杂交水稻国家重点实验室华南研究基地/福建省作物分子育种工程实验室/福建省水稻分子育种重点实验室,福建福州350003;福建省农业科学院水稻研究所,福建福州350019;农业部华南杂交水稻种质创新与分子育种重点实验室/福州(国家)水稻改良分中心/福建省作物种质创新与分子育种省部共建国家重点实验室培育基地/杂交水稻国家重点实验室华南研究基地/福建省作物分子育种工程实验室/福建省水稻分子育种重点实验室,福建福州质创新与分子育种重点实验室/福州(国家)水稻改良分中心/福建省作物种质创新与分子育种省部共建国家重点实验室培育基地/杂交水稻国家重点实验室华南研究基地/福建省作物分子育种工程实验室/福建省水稻分子育种重点实验室,福建福州350003【正文语种】中文【中图分类】S511;Q78植物转化已经广泛应用于植物功能基因研究与作物品种改良。
利用PCR方法检测转BT基因水稻
Ｔａ ｓ ｅ ｉ ｃ ｒｍ ｅｃ ｕ ｔｒａｔ ｆｎ ｎ ＧＭ ｒｄ ｃｓａ ｄｔｅｄ ｔｃｉｎｓｓ ｍ ｄｆｒｃ ｒｅａｉ ｅｍａｋ ｄｇ ｎ ｓａ ｄｔ ｎ ｇ ｎｃ Ｔ ｅ ｒｎ ｇ ｎｃＲｉ ｆｏ ｔ ｏ ｎｅｐ ｒ ｏ ｏ － ｅ ｈ ｐｏ ｕ ｔ ｎ ｈ ｅ ｔ ｔ ａ ｏｒｌｔ ｇ ｔ ｒｅ ｅ ｅ ａ ｓ ｅ ｉ． ｈ ｅ ｏ ｙｅ ｎ ｏ ｎ ｈ ｎ ｒ
ＤＥ ＮＧ ｎ － ｎ ， Ｈｏ ｇ ｌ ｇ ＧＵＯ ｎ ｄ ｎ ， ＶＵ ｕ ｌ ａ ｉ Ｘｉ － ｏ ｇ 、 Ｙ＿ ｕ ｎ －
（ ｕ ｎ ｚ ｏ ｒｄ ｃｓ ｕ ｌ ｕｅｖ ｉｎａｄＴ ｓｎ ｓｔｔ， ｕ ｎ ｚ ｏ １ Ｃ ｉ ） Ｇ ａ ｇ ｈ ｕ ｏ ｕ ｔＱ ａｉ Ｓ ｐ ｒｉｏ ｅｔ ｇ ｎｔｕｅ Ｇ ａｇ ｈ ｕ５ １０ ｈ ａ Ｐ ｔ ｙ ｓ ｎ ｉ Ｉ ｉ ， ｎ ０１
（ 广州市产品质量监智 验所，广东 广州 ５ Ｏ１） 检 １ ｌＯ
摘要：应用 Ｐ Ｒ技术进行转基因水稻检测研究。本文以转基因水稻为材料 ，以聚合酶链 式反应 （ Ｃ Ｃ Ｐ Ｒ）方法为基础 ，选择适用
于转基 因食品安全性检验的核酸检测技术， 针对转基因水稻中普遍存在的花椰 菜花叶病毒 （ ａ Ｃ ＭＶ３ Ｓ） ５ 启动子 、 胭脂碱合成酶 （ Ｓ） ＮＯ 终止子 、和转入苏云金杆菌 （ ａｉｕ ｕｉ ｉ ｓ 简 写为 Ｂ ） Ｂ ｃｌｓｈ ｒ ｇｅ ｉ ｌ ｔ ｎ ｎｓ ｔ 基因水稻的 Ｃｙ Ａ ｒｌ ｃ片段进行 Ｐ Ｒ检 测，建立适合转 Ｂ Ｃ Ｔ基因水稻 的检 测方法 该方法简便快速、检测结果与标准及其他文献资料相符
Ａｂｔａｔ Ｐ ｌ ｒ ｅＣ ａ ｅ ｔ ｎ（ｃ ） ｌ ｉ ｏｔ ｔｍ ｔｏ ｏ ｅｉｅｔ ｃｔ ｎｏ ｅｏ ｃｍｏｉｅ ｏｄ Ｇ ） Ｗ Ｓ ｓ ｃ： ｏｙ ａ ｈｉ Ｒ ａ ｉ Ｐ Ｒ，ａ ｒ ｍｅ ｓ ｎ ｃ ｏ ｌｍｐ ｒｎ ｅ ｄ ｆｒｔ ｄｎｉ ａ ｏ ｆｇｎｍｉ ｄ ｆｄ ｆｏｓ（ ＭＦ， ａ ａ ｈ ｈ ｉ ｆ ｉ ｉ
PCR技术的原理与应用
PCR技术的原理与应用PCR（聚合酶链式反应）技术是一种体外扩增DNA的方法，其原理是在适当的条件下，通过对DNA序列的短端引物的特异性杂交和聚合酶的扩增作用，来快速合成指定序列的DNA。
PCR技术的应用非常广泛，涵盖了医学、生物学、农业等领域。
本文将分别从原理和应用两方面详细介绍PCR技术。
1.变性：将DNA的双链分离为单链，通常是通过加热至90-95摄氏度进行变性。
高温使DNA的双链断裂，形成两条单链，用于之后的PCR反应。
2.退火：将反应体系温度降低至50-60摄氏度，加入两个引物（即DNA的扩增首尾序列），引物通过碱基对特异性杂交到DNA模板的特定区域上。
3.延伸：将温度升高至72摄氏度，引物上的聚合酶开始将引物区域上的DNA模板扩增。
由于引物的方向相对，两个引物同时在相应的模板序列两侧将DNA扩增。
通过这三个步骤的循环，可以指数级地扩增特定DNA片段，从而使其可以被快速检测和分析。
1.分子诊断：PCR技术广泛应用于临床医学中的分子诊断。
通过扩增其中一种病原体的DNA片段，可以快速诊断感染或遗传病。
例如，HIV的检测、乳腺癌的早期诊断等。
2.犯罪学：PCR技术可以对指定的DNA样本进行扩增，并通过比对DNA指纹数据库来进行罪犯的辨认。
这一技术在犯罪学中被广泛应用。
3.基因工程：通过PCR技术可以扩增特定基因，然后进行突变或重组。
这一技术在基因工程研究和基因治疗中发挥了重要作用。
4.农业：PCR技术可以用于快速检测转基因作物，对粮食和蔬菜进行品种鉴定。
同时，PCR技术还可以被用于植物病理学研究、基因组学研究等。
5.法医学：PCR技术可以通过对DNA标记位点的扩增，来对遗传证据进行鉴定。
例如，通过扩增DNA片段并与被疑犯的DNA进行比对，从而确定罪犯的身份。
总之，PCR技术是一种简便、快速和高效的DNA扩增方法。
通过合理设计引物和选择合适的参数，可以对特定DNA片段实现精确扩增。
其在医学、生物学、农业等领域都有广泛的应用，为相应领域的科研和实践提供了强有力的工具。
农作物基因鉴定与转基因技术
农作物基因鉴定与转基因技术农作物是人类的重要食源之一，因此，研究和开发适应不同环境和需求的农作物品种受到了广泛的关注。
在这个过程中，农作物基因鉴定和转基因技术成为了研究人员的重要工具。
农作物基因鉴定技术主要是指对农作物的基因进行检测和分析，了解其遗传特性以及相关的生理、形态和产量特征。
目前，应用较广泛的基因鉴定技术包括PCR技术、DNA芯片技术、同源性比对以及基于测序分析的方法等。
PCR技术是将DNA扩增至可检测水平的一种技术。
它可以根据需要选择一段基因特定的引物，将目标DNA片段扩增出来，并对扩增产物进行分析和鉴定。
这种方法可以用于快速检测作物中的特定基因或基因组，比较经济和简便。
在现代育种中，PCR技术被广泛应用于种品质检测和品种鉴别等方面。
DNA芯片技术是一种基于高通量检测原理的技术，可以同时检测和鉴定大量的基因。
这种技术在基因组学研究中被广泛运用，可以对作物中的成千上万个基因进行分析和鉴定。
与PCR技术相比，DNA芯片技术的检测速度更快、准确性更高。
同源性比对是一种在作物基因组学中常用的方法，它可以通过比对作物DNA序列和其他物种的DNA序列进行匹配，从而分析和鉴定出目标基因。
这种方法在作物基因鉴定和育种研究中具有重要意义，能够为品种改良提供有益的信息。
基于测序分析的方法则是提取目标作物DNA，进行高通量测序后再利用生物信息学技术对其进行分析和鉴定。
这种方法实验流程比较复杂，但是可以获取准确性高、信息量大的结果。
在研究作物基因组结构和功能方面，基于测序分析的方法被广泛应用。
除了农作物基因鉴定技术外，转基因技术也是农作物品种改良和产量提高的重要方法之一。
转基因技术是指将人为设计的基因或DNA片段导入其他生物体内的一种技术。
在农业领域，转基因技术可以实现对作物特定性状的精准调控，如抗虫、抗病、抗旱、耐盐等。
转基因作物的应用，受到广泛的关注和争议。
其中一个重要的原因是转基因技术的安全性问题。
虽然经过多年的研究和实践，当前认为转基因技术的安全性得到较好的控制，但对于人类健康和环境的长期影响还需要更多的研究。
说明使用表型观察,pcr法鉴定转基因水稻的条件(一)
说明使用表型观察,pcr法鉴定转基因水稻的条件(一)说明使用表型观察、PCR法鉴定转基因水稻的条件1. 引言转基因技术的广泛应用使得转基因作物的鉴定成为农业领域中的重要任务之一。
其中，转基因水稻鉴定对于保障粮食安全、推动农业可持续发展具有重要意义。
本文将针对使用表型观察和PCR法鉴定转基因水稻进行详细介绍。
2. 表型观察鉴定转基因水稻的条件转基因水稻的表型观察鉴定通常需要以下条件：•生长环境：转基因水稻和非转基因水稻应在相同的生长环境下进行观察，包括温度、湿度、光照等因素。
确保生长环境的一致性有助于排除其他环境因素对水稻表型的影响。
•对照品种：选择与待鉴定水稻表型相似的非转基因水稻对照品种，用于对照比较观察结果。
这有助于辨别转基因水稻的特异表型特征。
•观察时间点：需要在适当的生长阶段进行观察，以确保转基因水稻的表型特征能够明显表现出来。
通常，在水稻植株出苗、分蘖、开花等关键生长阶段进行观察效果较好。
•观察指标：通过观察转基因水稻在相关生长阶段的形态特征、生理指标等来判断其是否为转基因品种。
例如，观察水稻株高、叶片形态、穗长等指标的变化情况。
3. PCR法鉴定转基因水稻的条件PCR法是一种常用的转基因鉴定方法，也可用于转基因水稻的鉴定。
下面是鉴定转基因水稻所需的条件：•提取基因组DNA：利用合适的DNA提取方法，从待鉴定水稻样品中提取基因组DNA。
确保提取的DNA质量和浓度适宜，以保证PCR反应的准确性和可靠性。
•选择适当的引物：根据需要鉴定的转基因特征，选择适当的引物。
这些引物应与目标转基因序列具有特异性，以确保可靠的扩增结果。
•反应体系设计：根据引物设计PCR反应体系，包括适当的引物浓度、Mg2+浓度、模板DNA浓度等。
并设置负对照和阳性对照，以确保实验的准确性和可靠性。
•PCR反应条件：设置合适的PCR反应条件，包括反应温度、反应时间、循环次数等。
根据引物的特性和PCR仪的要求进行合理调节，确保PCR反应能够成功扩增目标序列。
PCR原理、技术及应用简介
首先对水稻DNA进行抽提和纯化
设计PCR引物定量PCR体系构建这里用到的也是荧光探针的标记方法进行定量PCR扩增
最后通过转基因拷贝数的分析来定量的分析转基因水稻中的外源基因拷贝数
（1）感染基因检测：用间接原位PCR分析了11个HIV血清阳性病人的外周血大单核细胞的感染情况。
其中8个患者被发现含有HIV DNA序列, 而这8例用传统的原位杂交方法未能检测出来。
（2）人工转入基因的检测：原位分子杂交是检测外源基因的传统手段,对哺乳动物中枢神经系统导入的外源基因进行研究。
在每个转基因实验中，用原位PCR都可以在脑内神经细胞中显示1个拷贝的DNA，而常规原位分子杂交则不能。
该方法对导入基因本身进行检测，能追踪和定出转入基因的确切位置，从而很好地克服了目前采用的标记基因的缺陷。
因为导入的基因并不一定能表达，也不一定能转录、翻译蛋白质和发挥功能作用。
因此，可预料原位PCR检测将在研究导入基因的遗传稳定性、基因工程应用以及基因治疗等方面有着重大的意义。
3.3.2基因变异的研究：原位PCR能用于基因突变、基因重组和染色体易位等基因变异研究。
Embleton等[14]用原位反转录PCR技术，在单个细胞内显示了扩增拼接重排的免疫球蛋白重链及轻链可变区基因。
pcr 国内发展现状
pcr 国内发展现状PCR（聚合酶链反应）是一种可以在体外复制和扩增特定DNA片段的分子生物学技术。
自1983年PCR技术被开发以来，它在许多领域的应用取得了巨大成功，如医学诊断、基因工程、体外复制等。
以下是PCR在国内的发展现状：首先，PCR在医学诊断领域的应用十分广泛。
例如，PCR可以用于检测各种病原体，如细菌、病毒和寄生虫。
临床上，PCR被广泛用于诊断肿瘤、传染病和遗传病等疾病。
通过检测特定的DNA序列，PCR可以提供高度敏感和特异性的诊断结果，有助于早期发现和治疗。
其次，PCR在农业科学中的应用也越来越重要。
PCR可以用于检测和鉴定农作物病害、害虫和转基因作物。
通过PCR技术，可以快速、准确地鉴定受感染植物或有害昆虫的存在，有助于保护农作物的质量和产量。
此外，PCR还可以用于育种和品种鉴定等农业研究领域。
此外，PCR在环境监测和食品安全领域也有广泛的应用。
例如，PCR可以用于检测水源中的细菌、寄生虫和病毒，以及环境中的重金属和污染物。
在食品安全方面，PCR可以用于检测食品中的潜在病原体和转基因成分。
这些应用可以提高环境和食品安全的监测能力，保护公众的健康和安全。
此外，PCR技术也在基础研究中发挥了重要作用。
例如，PCR 可以用于DNA测序、基因突变分析、基因表达研究等。
PCR 的快速、高效、准确的特性为基础研究提供了强有力的工具，推动了生命科学等领域的发展。
不过，尽管PCR技术在国内已经得到广泛应用，但还存在一些挑战。
首先，PCR技术的操作较为复杂，需要高度的专业知识和实验技术。
此外，PCR技术中的污染问题也需要重视，否则可能会导致假阳性结果。
另外，PCR技术的成本相对较高，限制了其在一些基层医疗机构和农村地区的应用。
总结起来，PCR技术在国内的发展已经取得了显著进展，广泛应用于医学诊断、农业科学、环境监测和基础研究等领域。
随着技术的不断进步和成本的降低，相信PCR技术的应用将进一步扩展，并在更多领域发挥重要作用。
利用微滴数字PCR分析转基因生物外源基因拷贝数_姜羽
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 转基因水稻(Oryza sativa)T1c-19 材料由华中农
示意图。 1.3.3 引物和探针
实验中涉及的定性、实时荧光定量 PCR 扩增 引物和探针通过软件 primer express v2.0 设计，由
业大学生命科学技术学院提供。转人乳铁蛋白基 Invitrogen 公司合成，具体序列见表 1。其中，转基 因(human lactoferrin, HLF)山羊(Capra hircus)134 血 因水稻 T1c-19 的外源基因杀虫晶体蛋白基因 (in-
Southern blot 和实时荧光定量 PCR 是常用的两种 多 功 能 酶 标 仪 (BioTek, 美 国)。 QX100TM Droplet
外源基因拷贝数分析技术, 已广泛用于外源基因拷 DigitalTM PCR 系统(Bio-Rad, 美国, 包括微滴生成仪
贝数分析。但这两种方法也存在一定缺陷。例如， 和 微 滴 读 取 仪)。 ABI 7900 定 量 PCR 仪 (Applied
Abstract Droplet digital PCR(ddPCR) is a new absolutely quantitative method based on Poisson distribution, which shows huge potential applicability in accurate quantification of nucleic acid. Herein, we developed the ddPCR method to evaluate the exogenous gene copy number in genetically modified organisms (GMOs) as the example from genetically modified rice(Oryza sativa) T1c-19 and transgenic human lactoferrin gene goat(Capra hircus) 134 examples, and the results was also compared with those from quantitative Realtime PCR (qRT-PCR) and Southern blot. The results from qRT-PCR and ddPCR for cry1C* in T1c-19 were comparatively unanimous (~2 copies), while 1 copy was reported in literatures by Southern blot. The copy number from ddPCR was higher than that of qRT- PCR for bar gene in T1c- 19, 2.09 and 1.51 copies respectively. Same result (~1 copy) was obtained from qRT- PCR and ddPCR for HLF gene in goat 134. Therefore, the ddPCR was well developed as one novel method for estimating transgene copy number with high accuracy, and which may be widely used in the exogenous genes copy number analysis in GMOs. Keywords Droplet digital PCR(ddPCR), Genetically modified organisms(GMOs), Exogenous gene, Copy number
转基因水稻培育实验报告
一、实验目的本实验旨在通过基因工程技术，将具有特定功能的基因导入水稻中，培育出具有抗病、抗虫、抗逆等优良性状的转基因水稻，为我国水稻育种提供新的途径。
二、实验原理转基因技术是指将外源基因导入目标生物体基因组中，使目标生物体获得新的性状或功能。
本实验采用农杆菌介导法将目的基因导入水稻中，通过基因重组，使水稻获得抗病、抗虫、抗逆等优良性状。
三、实验材料1. 水稻品种：Oryza sativa L.（籼稻）2. 抗病基因：Xa213. 抗虫基因：Bt蛋白基因4. 抗逆基因：海藻糖合成酶基因5. 农杆菌：Agrobacterium tumefaciens EHA1056. 实验试剂：限制酶、DNA连接酶、质粒、抗生素等四、实验方法1. 目的基因的克隆与构建（1）从基因库中获取抗病基因Xa21、抗虫基因Bt蛋白基因和抗逆基因海藻糖合成酶基因的DNA序列。
（2）利用PCR技术扩增目的基因。
（3）将扩增的目的基因与载体质粒连接，构建重组质粒。
2. 农杆菌转化（1）将重组质粒转化农杆菌EHA105。
（2）将转化后的农杆菌接种于含有抗生素的培养基中，筛选阳性克隆。
3. 转化水稻（1）将阳性农杆菌接种于含有抗生素的培养基中，培养至对数生长期。
（2）将农杆菌与水稻叶片接触，进行转化。
4. 筛选转基因植株（1）将转化后的水稻苗移栽至田间，进行抗性鉴定。
（2）根据抗性表现，筛选出转基因植株。
5. 分子鉴定（1）提取转基因植株的DNA。
（2）利用PCR技术检测目的基因是否整合到水稻基因组中。
五、实验结果1. 成功构建了含有抗病基因Xa21、抗虫基因Bt蛋白基因和抗逆基因海藻糖合成酶基因的重组质粒。
2. 转化后的农杆菌能够将目的基因导入水稻中。
3. 通过抗性鉴定，筛选出具有抗病、抗虫、抗逆等优良性状的转基因水稻。
4. 分子鉴定结果显示，目的基因已整合到水稻基因组中。
六、实验结论本实验成功培育出具有抗病、抗虫、抗逆等优良性状的转基因水稻，为我国水稻育种提供了新的途径。